Name: immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (81673247 & 81872682) og australsk-Kina Collaborative Grant (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).

Alle emnene som inngår i protokollen har blitt godkjent av etikk Committee of The Capital Medical University, Beijing, Kina12. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hvert emne i begynnelsen av studien.
1. IgG-isolasjon
<ol><li>Forbered kjemikalier inkludert bindende buffer (fosfat bufret saltvann, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), nøytralisere buffer: 10x PBS (pH = 6.6-6.8), eluent: 0,1 M maursyre syre (pH = 2,5), nøytralisere løsning for eluent: 1 M ammonium bika...

<ol>
	<li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomics,+glycoproteomics+and+the+immune+system.">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).</li><li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics.">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li><li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Glycosylation+and+Inflammation.">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392 (2013).</li><li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases.">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65 (2018).</li><li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research.">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).</li><li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated,+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform.">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).</li><li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages.">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).</li><li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index.">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia.">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).</li><li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations.">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension:+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study.">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G.">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).</li><li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson's+disease.">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).</li><li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation.">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).</li><li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations.">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).</li><li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography.">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).</li><li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types.">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963 (2016).</li></ol>

UPLC fungerer som en relativ kvantitativ analysemetode5,15. Resultatene tyder på at UPLC er en stabil deteksjons teknologi med god reproduserbarhet og relativ kvantitativ nøyaktighet. Mengden av glykaner i hver topp er uttrykt som en prosentandel av det totale integrerte området ved hjelp av UPLC, som er den relative verdien. Den relative kvantifisering forbedrer sammenlignbarhet til testprøvene. I tillegg brukes 96 brønn protein G-plater til å rense IgG me...

N-glykosylering av humane proteiner er en felles og viktig post-translational modifikasjon1 og kan bidra til å forutsi forekomsten og utviklingen av sykdommer relativt nøyaktig. På grunn av kompleksiteten i sin struktur, er det forventet at det er mer enn 5 000 glycan strukturer, gir stort potensial som diagnostiske og prediktiv biomarkører for sykdommer2. N-glykaner knyttet til immunglobulin G (IgG) har vist å være avgjørende for IgG funksjon, og IgG N-glykosylering deltar i balansen mellom Pro-og anti-inflammatoriske systemer3. Differensial IgG N-glykosylering er involvert i sykdomsutvikling og progresjon, som representerer både en predisposisjon og funksjonell mekanisme involvert i sykdoms patologi. Den inflammatoriske rollen som IgG N-glykosylering har vært assosiert med aldring, inflammatoriske sykdommer, autoimmune sykdommer, og kreft4.
Med utviklingen av gjenkjennings teknologi er følgende metoder mest brukt i høy gjennomstrømming glycomics: hydrofile interaksjon kromatografi (HILIC) Ultra-ytelse flytende kromatografi med fluorescens deteksjon (UPLC-FLR), multiplex kapillær gel elektroforese med laser indusert fluorescens deteksjon (xCGE-LIF), Matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering time-of-Flight Mass massespektrometri (MALDI-TOF-MS), og flytende kromatografi electrospray Mass massespektrometri (LC-ESI-MS) . Disse metodene har overvunnet tidligere mangler av lav Flux, ustabile resultater, og dårlig følsomhet spesifisitet5,6.
UPLC er mye brukt til å utforske foreningen mellom IgG N-glykosylering og visse sykdommer (dvs. aldring7, fedme8, dyslipidemi9, type II diabetes10, hypertensjon11, iskemiske hjerneslag12, og Parkinsons sykdom13). Sammenlignet med de tre andre ovennevnte metoder, har UPLC følgende fordeler5,14. For det første gir det en relativ kvantitativ analysemetode, og dataanalysen som involverer totalareal normalisering, forbedrer sammenlignbarhet for hvert utvalg. For det andre er kostnaden av utstyr og nødvendig ekspertise relativt lav, noe som gjør det enklere å implementere og transformere glykosylering biomarkører til kliniske anvendelser. Presentert her er en introduksjon til UPLC så det kan bli mer utbredt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-aminobenzamide, 2-AB</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well collection plate</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plate</td>
			<td>Pol</td>
			<td>0.45 um GHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well monolithic plate</td>
			<td>BIA Separations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate rotor</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant shaking incubator/rocker</td>
			<td>Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China</td>
			<td>ZWY-10313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>BEH column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric ovens</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>202-2AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empower 3.0</td>
			<td>Waters technology Co., Ltd, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoProfile 2-AB Labeling kit</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerator</td>
			<td>Qingdao Haier Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold 96-well plate</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q pure water meter</td>
			<td>Millipore Co., Ltd, America</td>
			<td>Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH tester</td>
			<td>Sartorius Co., Ltd, Germany</td>
			<td>PB-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>4672100, 0.5-10&#956;l &#38; 10-100&#956;l &#38; 20-200&#956;l &#38; 1000&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td>
			<td>B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer liquid gun</td>
			<td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>4672100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low temperature refrigerator</td>
			<td>Thermo Co., Ltd, America</td>
			<td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-performance liquid chromatography</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>Acquity MLtraPerformance LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volatilizing machine/Dryer</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>NP-30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-bath</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>DK-98-IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>MP200B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography

Glycomics er en ny subspecialty i omics system forskning som gir betydelig potensial i å oppdage neste generasjons biomarkører for sykdoms mottakelighet, narkotika mål oppdagelse, og presisjons medisin. Alternativ IgG N-glykaner har blitt rapportert i flere vanlige kroniske sykdommer og foreslo å ha stort potensial i kliniske anvendelser (dvs. biomarkører for diagnostisering og prediksjon av sykdommer). IgG N-glykaner er viden karakterisert ved hjelp av metoden for hydrofile interaksjon KROMATOGRAFI (HILIC) Ultra-ytelse flytende KROMATOGRAFI (UPLC). UPLC er en stabil deteksjons teknologi med god reproduserbarhet og høy relativ kvantitativ nøyaktighet. I tillegg er strukturen av IgG N-glycan klart separert, og glycan sammensetning og relativ overflod i plasma er karakterisert.

Som vist i figur 1ble IgG N-glykaner analysert i 24 innledende IgG-glycan topper (GPS) basert på topp posisjon og oppbevaringstid. N-glycan strukturer er tilgjengelig gjennom masse massespektrometri deteksjon i henhold til en tidligere studie (tabell 1)15. For å sikre at resultatene var sammenlignbare, ble totalareal normalisering brukt, der mengden av glykaner i hver topp ble uttrykt som en prosent...

Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Immunglobulin G (IgG) N-glycan er karakterisert ved hjelp av hydrofile INTERAKSJON kromatografi UPLC. I tillegg er strukturen av IgG N-glycan klart separert. Presentert her er en introduksjon til denne eksperimentelle metoden slik at den kan bli mye brukt i forskning innstillinger.

Immunglobulin G N-Glycan analyse av ultra-gjennomførelse flytende kromatografi

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Ultra-ytelse flytende kromatografi er etablert teknologi for nøyaktig analyse av IgG n-glycan På grunn av sin følsomhet synes å være, og det har evnen til å gi en bestemt informasjon om glykolikk Denne metoden er enkel å bruke og har en rekke forskjellige relativt lave kostnader for trinn, høy reproduserbarhet Evnen til å glysan isomers. Målingene av protein i plasma kan være attraktive. i medisin.også forbundet med IgG i glykosebase og slik og biologisk som inneholder populasjonen. Du vet at av uren tilstand brukes til å teste IgG i glysaner. Faktisk kan det teste n-glysaner av protein.Dette er nødvendig i et kryssbundet protein av to ren tilstand kan brukes på protein eller eksperimentell prosess er relativt enkel mens den eksperimentelle prosessen må standardiseres. Den ende-til-ende eksperimentelle prosessen tar tre dager å operere, og de eksperimentelle trinnene må huskes for å mestre eksperimentelle ferdigheter. For å forberede prøvene, tin den frosne plasmaprøven.Deretter sentrifuge på 80 ganger G i 10 minutter. La proteinet G monolittisk plate ved romtemperatur i 30 minutter. Overfør 100 mikrometer prøve til hver brønn av den to milliliteroppsamlingsplaten.Tilsett ultra rent vann som en kontrollprøve. Fortynn prøvene med en X PBS med ett til syv volumforhold. Rengjør en 0,45 mikron hydrofil polypropolen filterplate med 200 mikroliter ultra rent vann.Gjenta rengjøringen to ekstra ganger. Overfør de fortynnede prøvene til filterplaten, og filtrer prøvene inn i den kollektive platen ved hjelp av en vakuumpumpe med trykk på 266,6 til 399,9 Pascals. For å forberede proteinet G monolittiske plater, kast først lagringsbufferen.Rengjør monolittiske plater med to milliliter ultra rent vann, to milliliter av en X PBS, en milliliter 0,17 molar formic acid, to milliliter på 10 X PBS, og to milliliter av en X PBS sekvensielt. Fjern følgende væske ved hjelp av en vakuumpumpe. Bruk en flerkanals pipet til å overføre de filtrerte prøvene til proteinet G monolittisk plate for IgG-binding og rengjøring.Deretter legger du til to milliliter av en X PBS for å rengjøre monolittiske plater. Fjern PBS med en vakuumpumpe, og gjenta rengjøringen to ekstra ganger. Illute IgG med en milliliter 0,17 molar formisk syre, og filtrer prøvene inn i oppsamlingsplaten med vakuumpumpe.Deretter legger du til 170 mikroliter av en molar ammoniumbikarbonat i oppsamlingsplaten. Oppdag IgG-konsentrasjonen ved hjelp av et absorpsjonsspekttropetometer ved optimal bølgelengde på 280 nanometer. Legg den ekstraherte IgG i en ovn for å tørke ved 60 grader Celsius i tre timer.Bestem mengden som skal observeres i henhold til konsentrasjonen som beskrevet i manuskriptet, og bevare det i minus 80 grader Celsius. Samle tørket IgG, og lagre kjemikalier inkludert 1,33% SDS, fire prosent IgePal og 5% PBS ved romtemperatur. Forbered indoglykosidase F-enzymet ved å fortynne 250 enheter enzym med 250 mikroliter ultra rent vann.For å denaturere IgG, legg til 30 mikroliter på 1,33% SDS og bland ved vortexing. Overfør prøven til en 65 graders Celsius-ovn i 10 minutter. Fjern den deretter fra ovnen, og la den avkjøles i 15 minutter.Legg til 10 mikroliter på fire prosent IgePal i samme prøve, og legg den på en ristende inkubator i fem minutter. Tilsett 20 mikroliter med fem X PBS og 30 til 35 mikroliter på 0,1 molar natriumhydroksid for å regulere pH til 8,0, og bland ved vortexing. Tilsett fire mikroliter av endoglykosidase F-enzym, og bland ved vortexing.Deretter inkuber i 18 til 20 timer i et 37 grader Celsius vannbad. Neste dag, plasser de frigjorte gylcans i en ovn på 60 grader Celsius å tørke i to og en halv til tre timer. Lagre utgivelsen glykaner på minus 80 grader Celsius inntil videre måling.Forbered de to aminobenzomidmerkingsreagensen med 24,5 mikroliter DMSO, 10,5 mikroliter eddiksyre, 0,7 milligram to aminobenzomid og seks milligram natriumcyanoborohydrid. Deretter, i et mørkt rom, merk glykolene ved å legge til 35 mikroliter av to aminobenzomidmerkingsreagens. Overfør de merkede glcans til en oscillator i fem minutter, og overfør den deretter til ovnen i tre timer ved 65 grader Celsius.Deretter overfører du den til romtemperatur i 30 minutter. IgG n-glyase, vi vil merke den med for å bli oppdaget av fluorescerende oppdage av uren tilstand. Forbehandle en 0,2 mikron GHP filterplate med 200 mikroliter på 70% etanol, 200 mikroliter ultra rent vann, og 200 mikroliter på 96% aceto nitril ved fire grader Celsius.Fjern deretter avfallet ved hjelp av en vakuumpumpe. For å rense de to aminobenzomidmerket glykomaner, tilsett 700 mikroliter på 100% acetonitril til prøven, og overfør den til en ristende inkubator i fem minutter. Sentrifuge ved 134 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius.Overfør supernatent til en 0,2 mikrometer GHP filterplate i to minutter, og fjern filtratet ved hjelp av vakuumet. Vask de to aminobenzomidmerket glykolsyre med 200 mikroliter på 96% acetonitril ved fire grader Celsius, og fjern filtratet ved hjelp av en vakuumpumpe fem til seks ganger. Illute to amino benzimide merket glykol med 100 mikroliter ultra rent vann tre ganger.Overfør de to aminobenzomidmerket glykolsyre til en ovn for å tørke ved 60 grader Celsius i tre og en halv time. Lagre de merkede n-glykolene ved minus 80 grader Celsius inntil videre måling. Først åpner du programvaren for å kontrollere de mobile fasene.Vask UPLC-instrumenter med 50 % oppløsningsvæske B og 50 % oppløsningsvæske C med en strømningshastighet på 0,2 milliliter per minutt i 30 minutter. Vask deretter med 25% løsningsmiddel A og 75% løsningsmiddel B med en strømningshastighet på 0,2 milliliter per minutt i 20 minutter. Deretter legger du til en strømningshastighet på 0,4 milliliter per minutt.Oppløs de merkede n-glykolene med 25 mikroliter av en blanding av 100% acetonitril og ultra rent vann med to til ett volumforhold. Deretter sentrifuge ved 134 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius, og bruk et tørt rør for å laste 10 mikroliter av supernatent inn i UPLC-instrumentene. Skill de merkede n-glykolene med strømningshastighet på 0,4 milliliter per minutt med en lineær gradering på 75% til 62% acetonitril i 25 minutter.Deretter utfører du en analytisk drevet av Dexteran kalibreringsstige glykopeptidkolonne på en UPLC ved 60 grader Celsius. Oppdag n-glykoliserendemidler ved X-sitat og utslippsbølgelengder på henholdsvis 330 nanometer og 420 nanometer. Som vist i dette tallet ble IgG n-glycans analysert i 24 innledende IgG glykoltopper basert på toppposisjon og oppbevaringstid.N-glykolstrukturene er tilgjengelige i 24 typer gjennom massespektrometrideteksjon. For å eske repetisjonsevnen og stabiliteten til metoden, ble standardprøven testet parallelt seks ganger. Glykoltoppene med relativt små proporsjoner viste høye målefeil på mer enn 10 % av variasjonskoeffisienten.I stykket og viktig å danne til en etablert av IgG n-glykol struktur, spesielt for å etablere terminal Derfor, i stedet for 3,3 IgG n-glycase funnet i er kritisk i dette betydningen av IgG. Glycans fra er kjent for å være forskjellige. Med utviklingen i glycan prototomics, kombinert i glycans å utforske informasjon til dette slik at Den kan brukes som et potensial for dagens diagnose.Etter denne teknikken utvikling, gir det en ny måte å utforske

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Mouse Modell av intraluminal MCAO: Cerebral infarct Evaluering av Cresyl Violet Farging

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Netthinneavløsning Model i Gnagere etter subretinal Injeksjon av Natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

I utero Måling av puls i Mouse av invasiv M-modus Ekkokardiografi

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering av human lymfatisk endotelceller ved Multi-parameter fluorescens-aktivert cellesortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analyse av omorganisert Immunoglobulin Heavy Chain Gene å avsløre Klonal Evolution Mønstre av B celle lymfom

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal miRNA Analyse på ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasient Plasma Gjennom qPCR: En Mulighets Flytende Biopsi Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Romlig kvantifisering av narkotika i lunge tuberkulose lesjoner av Laser fange Microdissection væske kromatografi massespektrometri (MFM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

Program Biochip Microfluidic teknologi for å oppdage Serum Allergen-spesifikke immunglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Vurdering av akutt innånding av luftbårne partikler ved å utsette dyrkede menneskelige lungeceller ved luftflytende grensesnitt

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Kvalitetskontrollert sputumanalyse ved flowcytometri

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...