Name: immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por doações da National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e da Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).

Todos os assuntos incluídos no protocolo foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica capital, Pequim, China12. O consentimento informado escrito foi obtido de cada sujeito no início do estudo.
1. Isolamento igg
<ol><li>Prepare os produtos químicos, incluindo tampão de ligação (soisma tampão de fosfato, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutralizando buffer: 10x PBS (pH = 6,6-6,8), eluente: 0,1 M ácido fórmico (pH = 2,5), neutralizando a solução pa...

<ol>
	<li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomics,+glycoproteomics+and+the+immune+system.">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).</li><li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics.">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li><li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Glycosylation+and+Inflammation.">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392 (2013).</li><li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases.">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65 (2018).</li><li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research.">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).</li><li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated,+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform.">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).</li><li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages.">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).</li><li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index.">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia.">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).</li><li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations.">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension:+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study.">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G.">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).</li><li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson's+disease.">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).</li><li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation.">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).</li><li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations.">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).</li><li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography.">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).</li><li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types.">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963 (2016).</li></ol>

UPLC serve como um método de análise quantitativa relativa5,15. Os resultados indicam que o UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e precisão quantitativa relativa. A quantidade de glicanos em cada pico é expressa como uma porcentagem da área integrada total usando UPLC, que é o valor relativo. A quantificação relativa melhora a comparabilidade das amostras de teste. Além disso, 96 placas G de proteína bem são usadas p...

N-glicosilação de proteínas humanas é uma modificação pós-translacional comum e essencial1 e pode ajudar a prever a ocorrência e o desenvolvimento de doenças com relativa precisão. Devido à complexidade de sua estrutura, espera-se que existam mais de 5.000 estruturas glicanas, proporcionando grande potencial como biomarcadores diagnósticos e preditivos para doenças2. N-glicanos ligados à imunoglobulina G (IgG) têm se mostrado essenciais para a função da IgG, e a IgG N-glicosilação participa do equilíbrio entre os sistemas pró e antiinflamatórios3. A glicosilação diferencial igg nestá envolvida no desenvolvimento e progressão da doença, representando tanto uma predisposição quanto um mecanismo funcional envolvido na patologia da doença. O papel inflamatório do IgG N-glicosilação tem sido associado ao envelhecimento, doenças inflamatórias, doenças autoimunes e câncer4.
Com o desenvolvimento da tecnologia de detecção, os seguintes métodos são mais amplamente utilizados em glifosas de alta produtividade: cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho com detecção de fluorescência (UPLC-FLR), eletroforese de gel capilar multiplex com fluores induzidos por laser detecção de cência (xCGE-LIF), desintoxicação/ionização assistida por matriz tipode espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS) e espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-ESI-MS) . Estes métodos superaram deficiências anteriores de baixo fluxo, resultados instáveis e baixa especificidade de sensibilidade5,6.
UPLC é amplamente utilizado para explorar a associação entre IgG N-glicosilação e certas doenças (ou seja, envelhecimento7, obesidade8, disslipidemia9, diabetes tipo II10, hipertensão11, acidente vascular cerebral isquêmico12, e doença de Parkinson13). Em comparação com os outros três métodos acima mencionados, uplc tem as seguintes vantagens5,14. Primeiro, ele fornece um método de análise quantitativa relativa, e a análise de dados que envolve a normalização total da área melhora a comparabilidade de cada amostra. Em segundo lugar, o custo do equipamento e a experiência necessária são relativamente baixos, o que facilita a implementação e transformação de biomarcadores de glicosilação em aplicações clínicas. Apresentado aqui é uma introdução ao UPLC para que ele possa ser mais amplamente utilizado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-aminobenzamide, 2-AB</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well collection plate</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plate</td>
			<td>Pol</td>
			<td>0.45 um GHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well monolithic plate</td>
			<td>BIA Separations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate rotor</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant shaking incubator/rocker</td>
			<td>Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China</td>
			<td>ZWY-10313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>BEH column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric ovens</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>202-2AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empower 3.0</td>
			<td>Waters technology Co., Ltd, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoProfile 2-AB Labeling kit</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerator</td>
			<td>Qingdao Haier Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold 96-well plate</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q pure water meter</td>
			<td>Millipore Co., Ltd, America</td>
			<td>Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH tester</td>
			<td>Sartorius Co., Ltd, Germany</td>
			<td>PB-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>4672100, 0.5-10&#956;l &#38; 10-100&#956;l &#38; 20-200&#956;l &#38; 1000&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td>
			<td>B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer liquid gun</td>
			<td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>4672100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low temperature refrigerator</td>
			<td>Thermo Co., Ltd, America</td>
			<td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-performance liquid chromatography</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>Acquity MLtraPerformance LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volatilizing machine/Dryer</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>NP-30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-bath</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>DK-98-IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>MP200B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography

Glycomics é uma nova subespecialidade em pesquisa do sistema de omics que oferece um potencial significativo na descoberta de biomarcadores de última geração para a suscetibilidade à doença, descoberta de alvos de medicamentos e medicina de precisão. Os glicanos alternativos de IgG Nforam relatados em diversas doenças crônicas comuns e sugeridos ter o grande potencial em aplicações clínicas (isto é, biomarcadores para o diagnóstico e a predição das doenças). Os igg n-glicanos são amplamente caracterizados usando o método de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho (UPLC). A UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e alta precisão quantitativa relativa. Além disso, a estrutura do IgG N-glicano é claramente separada, e a composição glicana e a abundância relativa no plasma são caracterizadas.

Como mostrado na Figura 1,IgG N-glicanos foram analisados em 24 picos iniciais de glicoglicemia IgG (GPs) com base no pico de posição e tempo de retenção. As estruturas N-glicanestão disponíveis através da detecção de espectrometria de massa de acordo com um estudo anterior ( Tabela1)15. Para garantir que os resultados fossem comparáveis, foi aplicada normalização total da área, na qual a...

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Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

A imunoglobulina G (IgG) N-glicano é caracterizada por meio de cromatografia de interação hidrofílica UPLC. Além disso, a estrutura do IgG N-glican é claramente separada. Apresentado aqui é uma introdução a este método experimental para que ele possa ser amplamente utilizado em ambientes de pesquisa.

Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Cromatografia líquida de ultra-desempenho é tecnologia estabelecida para análise precisa do IgG n-glycan Devido à sua sensibilidade parece ser e tem capacidade de fornecer uma informação específica de glicano Este método é fácil de usar e tem um número de diferentes custos relativamente baixos de incrementos, alta reprodutibilidade A capacidade de isômeros glicanos. As medidas de proteína no plasma podem ser atraentes. na medicina.também associado ao IgG na base glicose e tal e biológico contendo a população. Você sabe que o estado impuro é usado para testar IgG em glicanes. Na verdade, pode testar n-glicanos de proteína.Isso é necessário em uma proteína transversal de dois estados puros pode ser aplicado à proteína O processo experimental or é relativamente simples enquanto o processo experimental precisa ser padronizado. O processo experimental de ponta a ponta leva três dias para funcionar, e as etapas experimentais precisam ser memorizadas para dominar as habilidades experimentais. Para preparar as amostras, descongele a amostra de plasma congelado.Em seguida, centrífuga a 80 vezes G por 10 minutos. Deixe a placa monolítica proteína G em temperatura ambiente por 30 minutos. Transfira 100 micrômetros de amostra para cada poço da placa de coleta de dois mililitros.Adicione água ultra pura como uma amostra de controle. Diluir as amostras com um X PBS por um a sete volumes por relação de volume. Limpe uma placa de filtro de polipropolen hidrofílico de 0,45 míclica com 200 microliters de água ultra pura.Repita a limpeza duas vezes adicionais. Transfira as amostras diluídas para a placa do filtro e filtre as amostras na placa coletiva usando uma bomba de vácuo com pressão de 266,6 a 399,9 Pascals. Para preparar as placas monolíticas da proteína G, primeiro descarte o tampão de armazenamento.Limpe as placas monolíticas com dois mililitros de água ultra pura, dois mililitros de um X PBS, um mililitro de ácido fórmico molar de 0,17, dois mililitros de 10 X PBS, e dois mililitros de um X PBS sequencialmente. Remova o seguinte líquido usando uma bomba de vácuo. Utilizando um tubo multicanal, transfira as amostras filtradas para a placa monolitosa de proteína G para ligação e limpeza de IgG.Em seguida, adicione dois mililitros de um X PBS para limpar as placas monolíticas. Remova o PBS usando uma bomba de vácuo e repita a limpeza duas vezes adicionais. Illute IgG com um mililitro de ácido fórmico molar de 0,17, e filtrar as amostras na placa de coleta por bomba de vácuo.Em seguida, adicione 170 microliters de um bicarbonato de amônio molar na placa de coleta. Detecte a concentração de IgG usando um espectetômetro de absorção no comprimento de onda ideal de 280 nanômetros. Coloque o IgG extraído em um forno para secar a 60 graus Celsius por três horas.Determine a quantidade a ser observada de acordo com sua concentração, conforme descrito no manuscrito, e preserve-a em menos 80 graus Celsius. Reúna o IgG seco e armazene produtos químicos incluindo 1,33% SDS, 4% IgePal e 5% PBS à temperatura ambiente. Prepare a enzima F indoglycosidase diluindo 250 unidades de enzima com 250 microliters de água ultra pura.Para desnaturar o IgG, adicione 30 microliters de 1,33% SDS e misture por vórtice. Transfira a amostra para um forno Celsius de 65 graus por 10 minutos. Em seguida, retire-o do forno e deixe esfriar por 15 minutos.Adicione 10 microliters de 4% IgePal na mesma amostra e coloque-o em uma incubadora de agitação por cinco minutos. Adicione 20 microliters de cinco X PBS e 30 a 35 microliters de 0,1 hidróxido de sódio molar para regular o pH a 8,0, e misture por vórtice. Adicione quatro microliters de enzima Endoglycosidase F, e misture por vórtice.Em seguida, incubar por 18 a 20 horas em um banho de água de 37 graus Celsius. No dia seguinte, coloque os gylcans soltos em um forno a 60 graus Celsius para secar por duas horas e meia a três horas. Salve os glicanos de liberação a menos 80 graus Celsius até uma nova medição.Prepare o reagente de rotulagem de amino benzimida com 24,5 microliters de DMSO, 10,5 microliters de ácido acético, 0,7 miligramas de dois amino benzimida e seis miligramas de cianoboroidido de sódio. Em seguida, em uma sala escura, rotule os glicanos adicionando 35 microliters de dois reagentes de rotulagem amino benzimida. Transfira os glcans rotulados para um oscilador por cinco minutos e, em seguida, transfira-o para o forno por três horas a 65 graus Celsius.Depois disso, transfira para temperatura ambiente por 30 minutos. O IgG n-glycase, vamos rotulá-lo com a fim de ser detectado pela detectagem fluorescente de estado impuro. Pré-tree uma placa de filtro GHP de 0,2 mícrons com 200 microliters de 70% de etanol, 200 microliters de água ultra pura e 200 microliters de 96% aceto nitrito a quatro graus Celsius.Em seguida, remova o resíduo usando uma bomba de vácuo. Para purificar os dois glimices rotulados de amino benzimida, adicione 700 microlitadores de 100% acetonitrilo à amostra e transfira-o para uma incubadora de agitação por cinco minutos. Centrifugar a 134 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Transfira o supernassente para uma placa de filtro GHP de 0,2 mícrons por dois minutos e remova o filtrado usando o vácuo. Lave os dois amino benzimídeos rotulados de glycan com 200 microlitres de 96% de acetonitrilo a quatro graus Celsius, e remova o filtrado usando uma bomba de vácuo de cinco a seis vezes. Illute dois amino benzimida rotulado glycan com 100 microliters de água ultra pura três vezes.Transfira os dois amino benzímidas rotulados glicocano em um forno para secar a 60 graus Celsius por três horas e meia. Salve os n-glicocanos rotulados a menos 80 graus Celsius até uma nova medição. Primeiro, abra o software para controlar as fases móveis.Lave os instrumentos UPLC com 50% de solvente B e 50% de solvente C na vazão de 0,2 mililitros por minuto durante 30 minutos. Em seguida, lave com 25% de solvente A e 75% solvente B a uma vazão de 0,2 mililitros por minuto durante 20 minutos. Em seguida, adicione uma taxa de fluxo de 0,4 mililitros por minuto.Dissolva os n-glicanos rotulados com 25 microliters de uma mistura de 100% de acetonitrilo e água ultra pura em uma proporção de volume de dois a um. Em seguida, centrífugas a 134 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius, e use um tubo seco para carregar 10 microlitadores da supernênite nos instrumentos UPLC. Separe os n-glicanos rotulados à taxa de fluxo de 0,4 mililitros por minuto com um gradiente linear de 75% a 62% de acetonitrilo por 25 minutos.Em seguida, execute uma análise da coluna de glycopeptida escada de calibração Dexteran em um UPLC a 60 graus Celsius. Detecte fluorescentes n-glicanos em citação X e comprimentos de onda de emissão de 330 nanômetros e 420 nanômetros, respectivamente. Como mostrado nesta figura, os n-glycanos IgG foram analisados em 24 picos iniciais de glicocano IgG com base na posição de pico e tempo de retenção.As estruturas n-glycan estão disponíveis em 24 tipos através da detecção de espectrometria de massa. Para acotoar a repetibilidade e estabilidade do método, a amostra padrão foi testada em paralelo seis vezes. Os picos glicanos com proporções relativamente pequenas apresentaram altos erros de medição de mais de 10% de coeficiente de variação.Na peça e importante para se formar a uma estrutura IgG n-glycan, especialmente para o estabelecimento do terminal Portanto, em vez de 3,3 IgG n-glycase encontrado é fundamental nesta a importância do IgG. Os glicanos são conhecidos por serem diferentes. Com os desenvolvimentos da protomica glican, combinados em glicanos para explorar informações para isso, pode ser usado como potencial para o diagnóstico atual.Após esse desenvolvimento de técnica, ele fornece uma nova maneira de explorar o

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In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Na medição utero da frequência cardíaca em rato por não invasiva em modo M Ecocardiografia

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

VDJ-Seq: Análise Sequenciamento profundo do Reorganizados Imunoglobulina Cadeia Pesada Gene para revelar padrões Clonal evolução do linfoma B celular

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal Análise miRNA em não-pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC) dos pacientes Plasma Através qPCR: Um Líquido Biópsia ferramenta viável

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Spatial quantificação de drogas em lesões de tuberculose pulmonar por Laser capturar Microdissection líquido cromatografia de espectrometria de massa (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

Aplicação da tecnologia de Microfluidic Biochip para detectar soro alérgeno-específicas E de imunoglobulina (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Avaliação da toxicidade da inalação aguda de partículas transmitidas por expor células pulmonares humanas cultivadas na Interface Ar-Líquido

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Análise de escarro controlada pela qualidade por citometria de fluxo

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...