Name: immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la National Natural Science Foundation of China (81673247 y 81872682) y Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).

Todos los temas incluidos en el protocolo han sido aprobados por el Comité de ética de la Universidad Médica Capital, Beijing, China12. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada tema al comienzo del estudio.
1. Aislamiento IgG
<ol><li>Preparar los productos químicos incluyendo tampón de unión (sina tamponada de fosfato, PBS): 1x PBS (pH a 7,4), tampón neutralizante: 10x PBS (pH a 6,6-6,8), eluyente: 0,1 M de ácido fórmico (pH a 2,5), solución...

<ol>
	<li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomics,+glycoproteomics+and+the+immune+system.">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).</li><li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics.">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li><li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Glycosylation+and+Inflammation.">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392 (2013).</li><li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases.">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65 (2018).</li><li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research.">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).</li><li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated,+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform.">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).</li><li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages.">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).</li><li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index.">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia.">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).</li><li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations.">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension:+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study.">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G.">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).</li><li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson's+disease.">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).</li><li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation.">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).</li><li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations.">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).</li><li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography.">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).</li><li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types.">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963 (2016).</li></ol>

UPLC sirve como método de análisis cuantitativo relativo5,15. Los resultados indican que UPLC es una tecnología de detección estable con buena reproducibilidad y precisión cuantitativa relativa. La cantidad de glicanos en cada pico se expresa como un porcentaje del área integrada total utilizando UPLC, que es el valor relativo. La cuantificación relativa mejora la comparabilidad de las muestras de prueba. Además, 96 placas de proteína G de pozo se utiliz...

N-glicosilación de proteínas humanas es una modificación post-traduccional común y esencial1 y puede ayudar a predecir la aparición y el desarrollo de enfermedades con relativa precisión. Debido a la complejidad de su estructura, se espera que haya más de 5.000 estructuras glicanas, proporcionando un gran potencial como biomarcadores diagnósticos y predictivos para enfermedades2. Se ha demostrado que los Nglicanos unidos a la inmunoglobulina G (IgG) son esenciales para la función de IgG, y IgG N-glicosilación participa en el equilibrio entre los sistemas pro yantiinflamatorio3. La IgG Ndiferencial-glicosilación participa en el desarrollo y la progresión de la enfermedad, representando tanto una predisposición como un mecanismo funcional implicado en la patología de la enfermedad. El papel inflamatorio de IgG N-glicosilación se ha asociado con el envejecimiento, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, y el cáncer4.
Con el desarrollo de la tecnología de detección, los siguientes métodos se utilizan más ampliamente en glicómics de alto rendimiento: cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) cromatografía líquida de ultra rendimiento con detección de fluorescencia (UPLC-FLR), electroforesis de gel capilar multiplex con fluores inducidos por láser Detección de cence (xCGE-LIF), espectrometría de masas de tiempo de tiempo de desorción/ionización asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) y espectrometría de masas electrospray por cromatografía líquida (LC-ESI-MS) . Estos métodos han superado las deficiencias anteriores de bajo flujo, resultados inestables y especificidad de sensibilidad deficiente5,6.
UPLC es ampliamente utilizado para explorar la asociación entre IgG N-glicosilación y ciertas enfermedades (es decir, envejecimiento7, obesidad8, dislipidemia9, tipo II diabetes10, hipertensión11, accidente cerebrovascular isquémico12, y la enfermedad de Parkinson13). En comparación con los otros tres métodos antes mencionados, UPLC tiene las siguientes ventajas5,14. En primer lugar, proporciona un método de análisis cuantitativo relativo, y el análisis de datos que implica la normalización total del área mejora la comparabilidad de cada muestra. En segundo lugar, el costo de los equipos y la experiencia requerida son relativamente bajos, lo que facilita la implementación y transformación de biomarcadores de glicosilación en aplicaciones clínicas. Aquí se presenta una introducción a UPLC para que pueda ser más ampliamente utilizado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-aminobenzamide, 2-AB</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well collection plate</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plate</td>
			<td>Pol</td>
			<td>0.45 um GHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well monolithic plate</td>
			<td>BIA Separations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate rotor</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant shaking incubator/rocker</td>
			<td>Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China</td>
			<td>ZWY-10313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>BEH column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric ovens</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>202-2AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empower 3.0</td>
			<td>Waters technology Co., Ltd, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoProfile 2-AB Labeling kit</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerator</td>
			<td>Qingdao Haier Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold 96-well plate</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q pure water meter</td>
			<td>Millipore Co., Ltd, America</td>
			<td>Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH tester</td>
			<td>Sartorius Co., Ltd, Germany</td>
			<td>PB-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>4672100, 0.5-10&#956;l &#38; 10-100&#956;l &#38; 20-200&#956;l &#38; 1000&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td>
			<td>B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer liquid gun</td>
			<td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>4672100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low temperature refrigerator</td>
			<td>Thermo Co., Ltd, America</td>
			<td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-performance liquid chromatography</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>Acquity MLtraPerformance LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volatilizing machine/Dryer</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>NP-30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-bath</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>DK-98-IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>MP200B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography

Glycomics es una nueva subespecialidad en investigación de sistemas omics que ofrece un potencial significativo en el descubrimiento de biomarcadores de próxima generación para la susceptibilidad a enfermedades, el descubrimiento de objetivos de fármacos y la medicina de precisión. Se han notificado igG N-glicanos alternativos en varias enfermedades crónicas comunes y se ha sugerido que tienen un gran potencial en aplicaciones clínicas (es decir, biomarcadores para el diagnóstico y la predicción de enfermedades). Los IgG N-glicanos se caracterizan ampliamente utilizando el método de cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) cromatografía líquida de ultrarendimiento (UPLC). UPLC es una tecnología de detección estable con buena reproducibilidad y alta precisión cuantitativa relativa. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada, y la composición de glicanos y la abundancia relativa en plasma se caracterizan.

Como se muestra en la Figura 1,los IgG N-glicanos se analizaron en 24 picos iniciales de IgG glicano (GPs) basados en la posición máxima y el tiempo de retención. Las estructuras N-glicano están disponibles a través de la detección de espectrometría de masas según un estudio anterior (Tabla 1)15. Para garantizar que los resultados fueran comparables, se aplicó la normalización total de la s...

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Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

La inmunoglobulina G (IgG) N-glicano se caracteriza mediante cromatografía de interacción hidrófila UPLC. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada. Presentado aquí es una introducción a este método experimental para que pueda ser ampliamente utilizado en entornos de investigación.

Inmunoglobulina G Análisis de N-Glycan por Cromatografía Líquida Ultra-Performance

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

La cromatografía líquida de ultra-rendimiento es la tecnología establecida para el análisis preciso de IgG n-glycan Debido a su sensibilidad parece ser y tiene capacidad para proporcionar una información específica de glicano Este método es fácil de usar y tiene un número de diferentes relativamente bajo costo de incrementos, alta reproducibilidad La capacidad de glycan isómeros. Las mediciones de proteínas en plasma podrían ser atractivas. en medicina.también asociado con IgG en base de glucosa y Tal y biológico que contiene a la población. Usted sabe que el estado impuro se utiliza para probar IgG en glicanos. En realidad, puede probar n-glicanos de proteína.Esto es necesario en una proteína cruzada de dos estados puros se puede aplicar a la proteína El proceso experimental OR es relativamente simple, mientras que el proceso experimental necesita ser estandarizado. El proceso experimental de extremo a extremo tarda tres días en funcionar, y los pasos experimentales deben memorizarse para dominar las habilidades experimentales. Para preparar las muestras, descongele la muestra de plasma congelado.Luego, centrifugar a 80 veces G durante 10 minutos. Dejar la placa monolítica de proteína G a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transfiera 100 micrómetros de muestra a cada pozo de la placa de recogida de dos mililitros.Agregue agua ultra pura como una muestra de control. Diluir las muestras con un X PBS en una a siete unidades de volumen por volumen. Limpie una placa de filtro de polipropeno hidrófilo de 0,45 micras con 200 microlitros de agua ultra pura.Repita la limpieza dos veces adicionales. Transfiera las muestras diluidas a la placa de filtro y filtre las muestras en la placa colectiva utilizando una bomba de vacío con presión de 266,6 a 399,9 Pascals. Para preparar las placas monolíticas de la proteína G, primero deseche el tampón de almacenamiento.Limpie las placas monolíticas con dos mililitros de agua ultra pura, dos mililitros de un PBS X, un mililitro de ácido fórmico molar 0,17, dos mililitros de 10 PBS y dos mililitros de un PBS X secuencialmente. Retire el siguiente líquido con una bomba de vacío. Con una pipeta multicanal, transfiera las muestras filtradas a la placa monolítica de proteína G para la unión y limpieza de IgG.A continuación, agregue dos mililitros de un X PBS para limpiar las placas monolíticas. Retire el PBS con una bomba de vacío y repita la limpieza dos veces adicionales. Illute IgG con un mililitro de ácido fórmico molar 0,17, y filtre las muestras en la placa de recogida mediante bomba de vacío.A continuación, añada 170 microlitros de un bicarbonato de amonio molar en la placa de recogida. Detecte la concentración de IgG utilizando un espectrotómetro de absorción en la longitud de onda óptima de 280 nanómetros. Coloque el IgG extraído en un horno para secar a 60 grados centígrados durante tres horas.Determinar la cantidad a observar de acuerdo con su concentración como se describe en el manuscrito, y preservarlo en menos 80 grados Celsius. Reúna el IgG seco y almacene productos químicos como 1.33%SDS, cuatro por ciento IgePal y 5%PBS a temperatura ambiente. Preparar la enzima indoglycosidasa F diluyendo 250 unidades de enzima con 250 microlitros de agua ultra pura.Para desnaturalizar el IgG, añadir 30 microlitros de 1.33%SDS y mezclar por vórtice. Transfiera la muestra a un horno Celsius de 65 grados durante 10 minutos. Luego, retírelo del horno y déjelo enfriar durante 15 minutos.Agregue 10 microlitros de cuatro por ciento de IgePal en la misma muestra y colóquelo en una incubadora de temblores durante cinco minutos. Añadir 20 microlitros de cinco X PBS y 30 a 35 microlitros de hidróxido de sodio molar 0,1 para regular el pH a 8,0, y mezclar por vórtice. Añadir cuatro microlitros de enzima endoglycosidasa F, y mezclar por vórtice.Luego, incubar durante 18 a 20 horas en un baño de agua de 37 grados centígrados. Al día siguiente, coloque a los gitanos liberados en un horno a 60 grados centígrados para que se sequen durante dos horas y media a tres horas. Guarde los glicanos de liberación a menos 80 grados Centígrados hasta que se medin más.Preparar los dos reactivos de etiquetado de benzimida de aminoácidos con 24,5 microlitros de DMSO, 10,5 microlitros de ácido acético, 0,7 miligramos de dos aminoácidos benzimida y seis miligramos de cianoborohidruro de sodio. A continuación, en una habitación oscura, etiquete los glicanos añadiendo 35 microlitros de dos reactivos de etiquetado de benzimida amino. Transfiera los glcans etiquetados a un oscilador durante cinco minutos, y luego, transfieralo al horno durante tres horas a 65 grados centígrados.Después de eso, transfiételo a temperatura ambiente durante 30 minutos. El IgG n-glycase, lo etiquetaremos con el fin de ser detectados por la detección fluorescente de estado impuro. Pretraque una placa de filtro GHP de 0,2 micras con 200 microlitros de 70%etanol, 200 microlitros de agua ultra pura y 200 microlitros de 96%aceto nitrilo a cuatro grados Celsius.A continuación, retire los residuos con una bomba de vacío. Para purificar los dos glicanos etiquetados con benzimida amino, agregue 700 microlitros de 100% acetonitrilo a la muestra y transfiéralo a una incubadora de temblores durante cinco minutos. Centrifugar a 134 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Transfiera el sobreniente a una placa de filtro GHP de 0,2 micras durante dos minutos y retire el filtrado utilizando el vacío. Lave los dos aminoácidos de benzimida etiquetados con 200 microlitros de 96%acetonitrilo a cuatro grados centígrados, y retire el filtrado con una bomba de vacío de cinco a seis veces. Illute dos amino benzimida etiquetada glicano con 100 microlitros de agua ultra pura tres veces.Transfiera los dos aminoácidos de glucón incorporado a un horno para que se sequen a 60 grados centígrados durante tres horas y media. Guarde los n-glicanos etiquetados a menos 80 grados Centígrados hasta que se medin más. En primer lugar, abra el software para controlar las fases móviles.Lave los instrumentos UPLC con 50%solvente B y 50%solvente C a un caudal de 0,2 mililitros por minuto durante 30 minutos. A continuación, lave con 25%solvente A y 75%solvente B a un caudal de 0,2 mililitros por minuto durante 20 minutos. A continuación, agregue un caudal de 0,4 mililitros por minuto.Disolver los n-glicanos etiquetados con 25 microlitros de una mezcla de 100%acetonitrilo y agua ultra pura a un volumen de dos a uno por proporción de volumen. Luego, centrifugar a 134 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius, y utilice una tubería seca para cargar 10 microlitros del sobrenadante en los instrumentos UPLC. Separe los n-glicanos etiquetados a un caudal de 0,4 mililitros por minuto con un gradiente lineal de 75% a 62%acetonitrilo durante 25 minutos.A continuación, realice un análisis ejecutado por la columna de glucopéptido de escalera de calibración Dexteran en un UPLC a 60 grados Celsius. Detectar fluorescentes n-glicanos en la cita X y longitudes de onda de emisión de 330 nanómetros y 420 nanómetros, respectivamente. Como se muestra en esta figura, Los IgG n-glycans se analizaron en 24 picos iniciales de Glicano IgG basados en la posición máxima y el tiempo de retención.Las estructuras n-glycan están disponibles en 24 tipos a través de la detección de espectrometría de masas. Para analizar la repetibilidad y estabilidad del método, la muestra estándar se probó en paralelo seis veces. Los picos de glicano con proporciones relativamente pequeñas mostraron errores de medición altos de más del 10% del coeficiente de variación.En la pieza e importante para formar a una estructura establecida de IgG n-glycan, especialmente para el establecimiento de terminal Por lo tanto, en lugar de 3.3 IgG n-glisa encontrado en es crítico en esto la importancia de IgG. Los glicanos de son conocidos por ser diferentes. Con los desarrollos en la prototómica de glicano, combinado en glicanos para explorar la información a esto de tal manera que se puede utilizar como un potencial para el diagnóstico de hoy.Después de este desarrollo de la técnica, proporciona una nueva manera de explorar la

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In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

En el útero de medición de la frecuencia cardíaca en el ratón por no invasiva Ecocardiografía en modo M

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Aislamiento de células endoteliales linfático humano por Multi-parámetro de clasificación de células activadas por fluorescencia

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

VDJ-Sec: Análisis de secuenciación profunda del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina reordenados para revelar clonal Evolución Patrones de linfoma de células B

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Análisis miARN exosomal en células no pequeñas del cáncer de pulmón (NSCLC) de plasma de los pacientes a través de qPCR: una herramienta de biopsia líquida factible

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Cuantificación espacial de fármacos en lesiones de Tuberculosis pulmonar por Laser Capture Microdissection líquido cromatografía espectrometría de masas (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

Aplicación de la tecnología de microfluidos Biochip para detectar suero alergénico-específicos de la inmunoglobulina E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Evaluación de la toxicidad aguda por inhalación de partículas transmitidas por el aire mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Análisis de esputo de calidad controlada por citometría de flujo

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...