Name: immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (81673247 & 81872682) och australiska-Kina Collaborative Grant (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).

Alla ämnen som ingår i protokollet har godkänts av etikkommittén för Capital Medical University, Peking, Kina12. Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje ämne i början av studien.
1. IgG-isolering
<ol><li>Förbered kemikalierna inklusive bindningsbuffert (fosfatbuffrad saltlösning, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutraliserande buffert: 10X PBS (pH = 6,6-6,8), Eluent: 0,1 M myrsyra (pH = 2,5), neutraliserande lösning för Eluent: 1 M ammoniumbikarbonat, ...

<ol>
	<li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomics,+glycoproteomics+and+the+immune+system.">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).</li><li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics.">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li><li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Glycosylation+and+Inflammation.">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392 (2013).</li><li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases.">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65 (2018).</li><li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research.">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).</li><li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated,+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform.">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).</li><li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages.">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).</li><li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index.">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia.">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).</li><li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations.">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension:+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study.">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G.">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).</li><li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson's+disease.">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).</li><li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation.">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).</li><li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations.">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).</li><li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography.">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).</li><li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types.">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963 (2016).</li></ol>

UPLC fungerar som en relativ kvantitativ analysmetod5,15. Resultaten indikerar att UPLC är en stabil detektionsteknik med god reproducerbarhet och relativ kvantitativ noggrannhet. Mängden glykaner i varje topp uttrycks som en procentandel av det totala integrerade området med hjälp av UPLC, vilket är det relativa värdet. Den relativa kvantifieringen förbättrar jämförbarheten av testprover. Dessutom, 96 well protein G plattor används för att rena IgG m...

N-glykosylering av humana proteiner är en vanlig och essentiell post-translationell modifiering1 och kan hjälpa till att förutsäga uppkomst och utveckling av sjukdomar relativt noggrant. På grund av komplexiteten i dess struktur, det förväntas att det finns mer än 5 000 glykananalys strukturer, vilket ger stor potential som diagnostiska och Prediktiva biomarkörer för sjukdomar2. N-glykaner kopplade till immunglobulin G (IgG) har visat sig vara väsentliga för IgG funktion, och IgG N-glykosylering deltar i balansen mellan Pro-och antiinflammatoriska system3. Differential IgG N-glykosylering är involverad i sjukdomsutveckling och progression, som representerar både en predisposition och funktionell mekanism som deltar i sjukdoms patologi. Den inflammatoriska rollen av IgG N-glykosylering har förknippats med åldrande, inflammatoriska sjukdomar, autoimmuna sjukdomar, och cancer4.
Med utvecklingen av detektionsteknik, följande metoder används mest i hög genomströmning glycomics: hydrofila interaktionskromatografi (HILIC) Ultra-Performance vätskekromatografi med fluorescensdetektion (UPLC-FLR), multiplex kapillär gel elektrofores med laserinducerad fluorescensdetektion (xCGE-LIF), Matrix-Assisted laserdesorption/joniseringstid-of-Flight masspektrometri (MALDI-TOF-MS), och vätskekromatografi elektrospray masspektrometri (LC-ESI-MS) . Dessa metoder har övervinna tidigare brister i låga Flux, instabila resultat, och dålig känslighet specificitet5,6.
UPLC används ofta för att utforska sambandet mellan IgG N-glykosylering och vissa sjukdomar (i.e., åldrande7, fetma8, dyslipidemi9, typ II diabetes10, hypertoni11, ischemisk stroke12, och Parkinsons sjukdom13). Jämfört med de andra tre ovannämnda metoderna har UPLC följande fördelar5,14. Först, det ger en relativ kvantitativ analysmetod, och dataanalys som innebär total areal normalisering förbättrar jämförbarheten av varje prov. För det andra är kostnaden för utrustning och erforderlig expertis relativt låg, vilket gör det lättare att implementera och omvandla glykosyleringsbiomarkers till kliniska tillämpningar. Presenteras här är en introduktion till UPLC så det kan vara mer allmänt används.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-aminobenzamide, 2-AB</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well collection plate</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plate</td>
			<td>Pol</td>
			<td>0.45 um GHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well monolithic plate</td>
			<td>BIA Separations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate rotor</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant shaking incubator/rocker</td>
			<td>Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China</td>
			<td>ZWY-10313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>BEH column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric ovens</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>202-2AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empower 3.0</td>
			<td>Waters technology Co., Ltd, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoProfile 2-AB Labeling kit</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerator</td>
			<td>Qingdao Haier Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold 96-well plate</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q pure water meter</td>
			<td>Millipore Co., Ltd, America</td>
			<td>Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH tester</td>
			<td>Sartorius Co., Ltd, Germany</td>
			<td>PB-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>4672100, 0.5-10&#956;l &#38; 10-100&#956;l &#38; 20-200&#956;l &#38; 1000&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td>
			<td>B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer liquid gun</td>
			<td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>4672100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low temperature refrigerator</td>
			<td>Thermo Co., Ltd, America</td>
			<td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-performance liquid chromatography</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>Acquity MLtraPerformance LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volatilizing machine/Dryer</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>NP-30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-bath</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>DK-98-IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>MP200B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography

Glycomics är ett nytt subspecialty i omics Systemforskning som erbjuder betydande potential för att upptäcka nästa generations biomarkörer för sjukdoms känslighet, läkemedelsmål Discovery, och precisionsmedicin. Alternativa IgG N-glykaner har rapporterats i flera vanliga kroniska sjukdomar och föreslog att ha stor potential i kliniska tillämpningar (dvs., biomarkörer för diagnos och Prediktion av sjukdomar). IgG N-glykaner kännetecknas allmänt med hjälp av metoden för hydrofila interaktionskromatografi (hilic) Ultra-prestationsvätskekromatografi (UPLC). UPLC är en stabil detektionsteknik med god reproducerbarhet och hög relativ kvantitativ noggrannhet. Dessutom är strukturen av IgG N-glykan tydligt åtskilda, och glykananalys sammansättning och relativa överflöd i plasma kännetecknas.

Som visas i figur 1, IgG N-glykaner analyserades i 24 initiala IgG glykananalys toppar (GPS) baserat på topp position och retentionstid. N-Glycan-strukturerna är tillgängliga genom masspektrometridetektering enligt en tidigare studie (tabell 1)15. För att säkerställa att resultaten var jämförbara tillämpades den totala normaliseringen av arealen, där mängden glykaner i varje topp uttrycks s...

Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Immunglobulin G (IgG) N-Glycan kännetecknas med hjälp av hydrofila interaktionskromatografi UPLC. Dessutom är strukturen av IgG N-glykan tydligt åtskilda. Presenteras här är en introduktion till denna experimentella metod så att den kan användas i stor utsträckning i forskningsmiljöer.

Immunglobulin G N-Glycan analys av Ultra-Prestationvätskekromatografi

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Ultra-performance flytande kromatografi är etablerad teknik för noggrann analys av IgG n-glycan På grund av dess känslighet verkar vara och det har förmåga att ge en specifik information av glykan Denna metod är lätt att använda och har antal olika relativt låga kostnader för steg, hög reproducerbarhet Förmågan att glykan isomerer. Mätningarna av protein i plasma kan vara attraktiva. inom medicin.också förknippas med IgG i glykos bas och sådan och biologiska innehåller befolkningen. Du vet att av orent tillstånd används för att testa IgG i glykaner. Egentligen kan det testa n-glykaner av protein.Detta behövs i ett tvärbundet protein av två rent tillstånd kan tillämpas på ProteinEt ELLER experimentella processen är relativt enkel medan den experimentella processen måste standardiseras. Den end-to-end experimentella processen tar tre dagar att fungera, och de experimentella stegen måste memoreras för att behärska experimentella färdigheter. För att förbereda proverna, tina det frusna plasmaprovet.Sedan centrifug vid 80 gånger G i 10 minuter. Låt proteinet G monolitisk platta vara rumstemperatur i 30 minuter. Överför 100 mikrometer prov i varje brunn av två-milliliter uppsamlingsplattan.Tillsätt ultra rent vatten som ett kontrollprov. Späd ut proverna med en X PBS med ett till sju volymförhållande. Rengör en 0,45 mikron hydrofil polypropolene filterplatta med 200 mikroliter av ultra rent vatten.Upprepa städningen ytterligare två gånger. Överför de utspädda proverna i filterplattan, och filtrera proverna i den kollektiva plattan med hjälp av en vakuumpump med tryck vid 266,6 till 399,9 Pascal. För att förbereda proteinet G monolitiska plattor, först kassera lagringsbufferten.Rengör de monolitiska plattorna med två milliliter ultrarent vatten, två milliliter av en X PBS, en milliliter av 0,17 molar myrsyra, två milliliter på 10 X PBS, och två milliliter av en X PBS sekventiellt. Ta bort följande vätska med hjälp av en vakuumpump. Med hjälp av en flerkanal pipet, överför de filtrerade proverna till proteinet G monolitisk platta för IgG-bindning och rengöring.Tillsätt sedan två milliliter av en X PBS för att rengöra de monolitiska plattorna. Ta bort PBS med hjälp av en vakuumpump, och upprepa rengöringen ytterligare två gånger. Illute IgG med en milliliter av 0,17 molar myrsyra, och filtrera proverna i uppsamlingsplattan med vakuumpump.Tillsätt sedan 170 mikroliter av en molar ammoniumbikarbonat i uppsamlingsplattan. Detektera IgG-koncentrationen med hjälp av en absorptionsspektropetometer vid den optimala våglängden på 280 nanometer. Placera den extraherade IgG i en ugn för att torka vid 60 grader Celsius i tre timmar.Bestäm mängden som ska observeras enligt dess koncentration enligt beskrivningen i manuskriptet, och bevara den i minus 80 grader Celsius. Samla torkade IgG, och lagra kemikalier inklusive 1,33%SDS, fyra procent IgePal och 5%PBS vid rumstemperatur. Förbered indoglycosidase F-enzym genom att späda ut 250 enzymenheter med 250 mikroliter av ultra rent vatten.För att denaturera IgG, tillsätt 30 mikroliter av 1,33%SDS och blanda genom att virvelning. Överför provet till en 65 graders Celsius ugn i 10 minuter. Sedan, ta bort den från ugnen, och låt den svalna i 15 minuter.Tillsätt 10 mikroliter av fyra procent IgePal i samma prov, och placera den på en skakande inkubator i fem minuter. Tillsätt 20 mikroliter av fem X PBS och 30 till 35 mikroliter på 0,1 molar natriumhydroxid för att reglera pH till 8,0, och blanda genom virvelning. Tillsätt fyra mikroliter av endoglycosidase F enzym, och blanda genom virvelning.Sedan, inkubera i 18 till 20 timmar i en 37 grader Celsius vattenbad. Nästa dag, placera de frisläppta gylcanerna i en ugn på 60 grader Celsius för att torka i två och en halv till tre timmar. Spara frisättningslykorna vid minus 80 grader Celsius tills ytterligare mätning.Förbered de två aminobensimidmärkningreagensen med 24,5 mikroliter DMSO, 10,5 mikroliter av ättiksyra, 0,7 milligram av två aminobensimid, och sex milligram natriumcyanoborohydrid. Därefter, i ett mörkt rum, etikett glycans genom att lägga till 35 mikroliter av två aminobensdimide märkning reagens. Överför de märkta glkanerna till en oscillator i fem minuter, och överför den sedan till ugnen i tre timmar vid 65 grader Celsius.Därefter överför den till rumstemperatur i 30 minuter. Den IgG n-glycase, vi ska märka den med för att upptäckas av fluorescerande upptäcka orena tillstånd. Förtrest en 0,2 mikron GHP-filterplatta med 200 mikroliter av 70%etanol, 200 mikroliter av ultra rent vatten, och 200 mikroliter av 96%aceto nitril vid fyra grader Celsius.Ta sedan bort avfallet med hjälp av en vakuumpump. För att rena de två aminobensmiden som är märkta glycaner, tillsätt 700 mikroliter av 100%acetonitril till provet, och överför den till en skakande inkubator i fem minuter. Centrifug vid 134 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Överför supernatent till en 0,2 mikron GHP-filterplatta i två minuter, och ta bort filtratet med hjälp av vakuumet. Tvätta de två aminobensmiden som är märkta med glyja med 200 mikroliter på 96%acetonitril vid fyra grader Celsius, och ta bort filtratet med hjälp av en vakuumpump fem till sex gånger. Illute två aminobensdimide märkt glykan med 100 mikroliter av ultra rent vatten tre gånger.Överför de två aminobensmiden som är märkta glycanen till en ugn för att torka i 60 grader Celsius i tre och en halv timme. Spara de märkta n-glyanerna vid minus 80 grader Celsius tills ytterligare mätning. Öppna först programvaran för att styra de mobila faserna.Tvätta UPLC-instrument med 50%lösningsmedel B och 50%lösningsmedel C vid flödet av 0,2 milliliter per minut i 30 minuter. Tvätta sedan med 25%lösningsmedel A och 75%lösningsmedel B vid en flödeshastighet på 0,2 milliliter per minut i 20 minuter. Lägg sedan till en flödeshastighet på 0,4 milliliter per minut.Lös upp de märkta n-glycans med 25 mikroliter av en blandning av 100%acetonitrile och ultra rent vatten vid en två till en volymvolym i förhållande. Sedan centrifugera vid 134 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius, och använd ett torrt rör för att ladda 10 mikroliter av supernatent i UPLC-instrumenten. Separera de märkta n-glycansna vid flödeshastighet på 0,4 milliliter per minut med en linjär gradient på 75%till 62%acetonitril i 25 minuter.Utför sedan en analytisk körning av Dexteran kalibreringsstege glyopeptid kolumn på en UPLC vid 60 grader Celsius. Detektera n-glycanlysorcerande vid X citering och emissionsvåglängder på 330 nanometer respektive 420 nanometer. Som framgår av denna figur, IgG n-glycans analyserades i 24 inledande IgG glykna toppar baserat på topp position och retention tid.De n-glycan strukturer finns i 24 typer genom masspektrometri upptäckt. För att aföra metodens repeterbarhet och stabilitet testades standardprovet parallellt sex gånger. Glyktopparna med relativt små proportioner visade höga mätfel på mer än 10 % av variationskoefficienten.I pjäsen och viktigt att bilda till en etablerad av IgG n-glycan struktur, särskilt för upprättande terminal Därför, i stället för 3,3 IgG n-glycase finns i är kritisk i detta vikten av IgG. Glyknaner från är kända för att vara annorlunda. Med utvecklingen i glykiska prototomics, kombineras i glyaner att utforska information till detta sådant att det kan användas som en potential för dagens diagnos.Efter denna teknikutveckling ger den ett nytt sätt att utforska den

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Musmodell av Intraluminal MCAO: cerebral infarkt Utvärdering av kresylviolett färgning

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Näthinneavlossning modell i gnagare genom subretinal Injektion av natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

I livmodern Mätning av hjärtfrekvens i mus genom Noninvasive M-mode ekokardiografi

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering av Human Lymphatic endotelceller från Multi-parameter fluorescensaktiverad cellsortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

VDJ-Seq: Deep sekvenseringsanalys av omarrangerade immunoglobulin tung kedja Gene att avslöja Klon Evolution Mönster för B-cellslymfom

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal miRNA Analys i icke-småcellig lungcancer (NSCLC) Patient Plasma genom qPCR: en möjlig Liquid biopsi Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Rumsliga kvantifiering av droger i lungtuberkulos lesioner av Laser fånga lokalt flytande kromatografi masspektrometri (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

Tillämpningen av Biochip mikroflödessystem teknik att upptäcka Serum Allergen-specifika Immunglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Bedömning av den akuta inandning toxicitet luftburna partiklar genom att exponera odlade mänskliga lungceller vid air-liquid interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Kvalitetsstyrd Sputumanalys efter flödescytometri

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...