Name: murine surgical model of topical elastase induced descending thoracic aortic aneurysm
Uploaded: 2019-08-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Surgical Model of Topical Elastase Induced Descending Thoracic Aortic Aneurysm at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni AHA Scientist Development Grant 14SDG187300000 (M.S.), NIH K08 HL098560 (G.A.) e RO1 HL081629 (G.R.U.). Questo progetto è stato sostenuto dalla Thoracic Surgery Foundation for Research and Education (TSFRE) Research Grant (PI: G. Ailawadi). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni della NHLBI o del TSFRE. Ringraziamo Anthony Herring e Cindy Dodson per le loro conoscenze e competenze tecniche.

I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Virginia (n. 3634).
1. Induzione di anestesia e intubazione
<ol><li>Mettere un topo C57BL/6 maschio di 8-10 settimane in una camera chiusa con flusso continuo del 5% di isoflurane e miscela di ossigeno per 5 min, fino a quando le respirazioni non sono visibilmente rallentate. NOTA: diversi ceppi, generi ed età dei topi possono essere utilizzati a seconda del protocollo sp...

<ol>
	<li>Coady, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+appropriate+size+criterion+for+resection+of+thoracic+aortic+aneurysms.">What is the appropriate size criterion for resection of thoracic aortic aneurysms.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 113 (3), 489-491 (1997).</li><li>Aggarwal, S., Qamar, A., Sharma, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+aortic+aneurysm:+A+comprehensive+review.">Abdominal aortic aneurysm: A comprehensive review.</a> Experimental and Clinical Cardiology. 16 (1), 11-15 (2011).</li><li>Bickerstaff, L. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endovascular+stenting+versus+open+surgery+for+thoracic+aortic+disease:+systematic+review+and+meta-analysis+of+perioperative+results.">Endovascular stenting versus open surgery for thoracic aortic disease: systematic review and meta-analysis of perioperative results.</a> Journal of Vascular Surgery. 47 (5), 1094-1098 (2008).</li><li>Absi, T. 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P., Schaheen, B., Downs, E., Roy, R. J., Ailawadi, G., Upchurch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chronic+advanced+staged+abdominal+aortic+aneurysm+murine+model.">A novel chronic advanced staged abdominal aortic aneurysm murine model.</a> Journal of Vascular Surgery. 66 (1), 232-242 (2017).</li></ol>

Le aorta toraciche e addominali sono cellularalmente ed embrionalmente distinte, che è rilevante per la malattia aneurismica14,15,16. Pertanto, è necessario un modello animale specifico per studiare la TAA. Anche se altri modelli murine dTAA sono stati pubblicati8, il nostro è l'unico modello per creare dilatazione aortica toracica discendente che può essere considerata veramente aneurismatica (oltre ...

Lo scopo di questo metodo è quello di studiare lo sviluppo, la fisiofisiologia e i cambiamenti strutturali nell'aorta toracica discendente murina durante la formazione di aneurismi aortici. Il nostro modello offre un metodo riproducibile e coerente per indurre aneurismi aortici toracici (dTAA) nei topi consentendo così la verifica di vari inibitori genetici e farmacologici. Questo lavoro può aiutare a identificare i farmaci e le terapie geniche che potrebbero essere tradotte in una strategia di trattamento praticabile per gli esseri umani affetti da malattia di DTAA.
Le DAA si formano quando la parete dell'aorta toracica si indebolisce e si dilata nel tempo fino a raggiungere un diametro critico quando può verificarsi strappo o rottura. Clinicamente, la dTAA può progredire in silenzio, aumentando di dimensioni fino a quando la struttura della parete aortica è così distorta che alla fine fallisce, con conseguenze catastrofiche. Per quanto riguarda, i sintomi di solito si sviluppano solo quando l'aneurisma ha raggiunto una dimensione perilosa (100-150% dilatazione) ed è ad alto rischio di dissezione o rottura1,2. La rottura della dTAA è quasi universalmente letale3, e la riparazione chirurgica elettiva porta una morbilità significativa4,5. Inoltre, la maggior parte dei pazienti portano la diagnosi di un aneurisma aortico per circa 5 anni prima della riparazione chirurgica6,7. Questa finestra rappresenta un momento opportuno per intervenire in modo non chirurgico. Pertanto, sono necessarie terapie mediche per trattare o rallentare la progressione della dTAA e rappresenterebbero un significativo progresso nel campo della ricerca sull'aneurisma. Attualmente non ci sono trattamenti medici per la dTAA, soprattutto a causa di una comprensione incompleta della patogenesi della dTAA.
Negli ultimi 20 anni sono stati sviluppati diversi modelli animali dTAA, ma ciascuno di questi modelli si è distinto dal nostro e non ha prodotto aneurismi robusti. Un modello di dTAA murine più simile al nostro è stato sviluppato da Ikonomidis et al.8, che include l'applicazione diretta di CaCl2 all'avvento dell'aorta. Anche se il nostro modello è stato adattato da molte delle tecniche stabilite da Ikonomidis, il nostro modello è unico in tre modi separati. In primo luogo, nel nostro modello l'aorta è esposta all'elastasi topica per 3-5 minuti, rispetto ai 15 minuti di esposizione a CaCl 2. In secondo luogo, la dilatazione aortica si verifica in 2 settimane, rispetto alle 16 settimane nel modello CaCl 2. Infine, il nostro modello produce costantemente aneurismi di circa il 100% di dilatazione, rispetto alle dilatazioni aortiche del 20-30% prodotte dall'applicazione CaCl2 (che non possono essere realmente considerate aneurismi in quanto definiti come un aumento diametro >50%). Ci sono altri modelli murini non chirurgici della formazione di aneurisma, come il topo Knockout Apo E, che formano robusti aneurismi con infusione di angiotensina II. Tuttavia, questi topi sviluppano aneurismi aortici tonocici o supracici piuttosto che aneurismi specificamente nell'aorta toracica discendente9,10.
Il razionale per questo protocollo è quello di avere un modo semplice, economico, e il tempo adatto per studiare dTAA in un modello murino. Il modello murino offre un'opportunità unica di utilizzare molti knockout genetici e specifici delle cellule che sono stati trovati per essere di impatto in altre malattie vascolari. L'uso del nostro specifico modello TAA è stato ben accolto e gli esperimenti che lo utilizzano sono stati pubblicati su riviste ad alto impatto11,12. A questo punto, il modello è stato utilizzato per studiare possibili trattamenti genetici e farmacologici che hanno avuto un effetto significativo nei modelli murini addominali anortici (AAA); tuttavia, poiché il nostro laboratorio ha ampliato l'uso del modello dTAA, stiamo trovando obiettivi unici per la formazione di dTAA che potrebbero essere utilizzati come terapie mirate negli esseri umani.
Questo modello è più appropriato per i laboratori che hanno capacità micro-chirurgiche murine. Anche se è tecnicamente impegnativo, può essere eseguito in modo coerente anche dai ricercatori senza alcuna esperienza chirurgica precedente. Per un ricercatore senza alcuna esperienza chirurgica murina il modello può essere masterizzato in circa 20 sessioni operative (o circa 50 topi). Per il ricercatore con esperienza chirurgica precedente, il modello può essere masterizzato in 5 sessioni operative (circa 20 topi). Crediamo che con un video di alta qualità, il tempo di padronanza può essere ulteriormente ridotto. Dopo la conoscenza, la procedura può essere completata in 35 minuti per l'intervento chirurgico e 20 minuti per la raccolta terminale. I chirurghi del nostro laboratorio possono completare 10-12 interventi chirurgici completi al giorno, con un tasso di mortalità operativa del 5-10%. La causa più comune di mortalità è la lesione polmonare all'ingresso al torace, la tossicità anestetica o lo strappo dell'aorta durante la dissezione. Oltre alla ricerca dTAA, questo modello serve anche come guida per un accesso facile e sicuro all'aorta toracico e al barile polmonare per i ricercatori che studiano altri interventi nel torace.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:761px;" width="760">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Angiocatheter (22G)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Used for ET Tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Dumont Tweezers; Pattern #7 x2</td>
			<td style="width:191px;">Roboz</td>
			<td style="width:161px;">RS-4982</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Graefe Tissue Forceps</td>
			<td style="width:191px;">Roboz</td>
			<td style="width:161px;">RS-5158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Harms Forceps x2</td>
			<td style="width:191px;">Roboz</td>
			<td style="width:161px;">RS-5097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7&#34; Length</td>
			<td style="width:191px;">Roboz</td>
			<td style="width:161px;">RS-7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">&#160;KL 1500 LED Light Source</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">150-400</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">&#160;M205A Dissction Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">CH 94-35</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:161px;">500216-G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Metal Clip board</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Use with the Mouse Retractor Set&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Mouse Retractor Set</td>
			<td style="width:191px;">Kent</td>
			<td style="width:161px;">SURGI-5001</td>
			<td style="width:167px;">Need 2 short and 1 tall fixators</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:243px;">Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector</td>
			<td style="width:191px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:161px;">73-0043</td>
			<td style="width:167px;">MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">Elastase from porcine pancreas</td>
			<td style="width:161px;">E0258-50MG</td>
			<td style="width:167px;">Can be purchased in various size bottles</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">Small Vessel Cauterizer Kit</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:161px;">18000-00</td>
			<td style="width:167px;">Recommend using rechargable AA batteries</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Spring Scissors, 10.5cm</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right" style="width:161px;">14127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Steril Swabs (Sponges)</td>
			<td style="width:191px;">Sugi</td>
			<td align="right" style="width:161px;">31603</td>
			<td style="width:167px;">Can be cut to size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Surgi Suite Surgical Platform</td>
			<td style="width:191px;">Kent</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Attach to clip board&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tech IV Isoflurane Vap</td>
			<td style="width:191px;">Jorgensen&#160;Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:161px;">J0561A</td>
			<td style="width:167px;">Anesthesia vaporizer&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine surgical model of topical elastase induced descending thoracic aortic aneurysm

Secondo il Center for Disease Control, gli aneurismi aortici (AA) sono stati considerati una delle principali cause di morte in tutte le razze ed entrambi i sessi dal 1999 al 2016. Un aneurisma si forma a seguito di progressivo indebolimento e didilatazione dell'aorta, che può rompersi o strappare una volta raggiunto un diametro critico. Gli aneurismi dell'aorta discendente nel petto, chiamati aneurismi aortici toracici discendenti (dTAA), costituiscono una grande percentuale di casi di aneurisma negli Stati Uniti. La rottura di dTAA non contenuta è quasi universalmente letale e la riparazione elettiva ha un alto tasso di morbilità e mortalità. Lo scopo del nostro modello è quello di studiare la dTAA in modo specifico, chiarire la fisiopatologia della dTAA e cercare obiettivi molecolari per arrestare la crescita o ridurre le dimensioni della dTAA. Avendo un modello murino per studiare con precisione la patologia toracica, è possibile sviluppare terapie mirate per testare specificamente la dAA. Il metodo si basa sul posizionamento dell'elasasi pancreatica dei porcini (PPE) direttamente sulla parete aortica murina esterna dopo l'esposizione chirurgica. Questo crea una reazione distruttiva e infiammatoria, che indebolisce la parete aortica e permette la formazione di aneurisma per settimane o mesi. Anche se i modelli murine possiedono limitazioni, il nostro modello dTAA produce robusti aneurismi di dimensioni prevedibili. Inoltre, questo modello può essere utilizzato per testare obiettivi genetici e farmaceutici che possono arrestare la crescita della DTAA o prevenire la rottura. Nei pazienti umani, interventi come questi potrebbero aiutare a evitare la rottura dell'aneurisma e un intervento chirurgico difficile.

L'applicazione del nostro protocollo si traduce in robusto dTAA nei topi rispetto ai controlli salini. I TAA sviluppati sono di forma fusiforme e si verificano solo nella parte trattata dell'aorta (Figura 1 e Figura 2)11. La figura 2 mostra un esempio di misurazione della micrometria video al raccolto dei tessuti. Utilizzando l'equazione 1, la dilatazione aortica è 130% in questo esempio.
<p class="jove_...

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Murine Surgical Model of Topical Elastase Induced Descending Thoracic Aortic Aneurysm

Descriviamo un protocollo chirurgico per indurre costantemente robusti aneurismi aortici discendenti nei topi. La procedura prevede la toracotomia sinistra, l'esposizione all'aorta toracica e il posizionamento di una spugna imbevuta di elastasi pancreatica porcina sulla parete aortica.

Modello chirurgico murine dell'elastasi topica indotta decrescente all'aneurtica toracica

According to the Center for Disease Control, aortic aneurysms (AAs) were considered a leading cause of death in all races and both sexes from 1999-2016. ...

Questo protocollo è in grado di produrre robusti aneurismi aortici toracici di dimensioni e posizione costanti nei topi e funge da guida per un accesso sicuro al petto murino. Questo protocollo è un metodo semplice e coerente per produrre aneurismi aortici toracici nei topi per un periodo di tempo ragionevole rispetto ad altri modelli. Dopo aver confermato un adeguato livello di sedazione in un topo nero c57 nero c57 di otto-10 settimane, posizionare il mouse nella posizione di decubito laterale destro e rastremare il braccio destro rostralmente in modo che la zampa anteriore sia in linea con il naso.Tirare la coda caudally per creare una linea di tensione tra il braccio destro e la coda, producendo estensione della colonna vertebrale, e nastro la gamba sinistra nella sua posizione naturale. Quindi, nastro il braccio sinistro ventralmente sopra garza arrotolata. Prima di iniziare la procedura, utilizzare i tosaerba per radere il fianco sinistro dalla spalla sinistra all'addome sinistro.Utilizzare un applicatore con punta di cotone per spazzolare prima la soluzione di betadine, quindi il 70% di etanolo sul sito chirurgico. Quando la pelle è asciutta, posizionare un drappo sterile sull'animale. Fare un'incisione laterale di due centimetri nel punto centrale dell'emotorace e utilizzare l'elettrocauteria detenuta per dividere gli strati muscolari fino a quando le costole non sono visibili.Sotto l'ingrandimento da 10 a 15x, cauterizzare direttamente una porzione di due millimetri tra le costole e utilizzare un applicatore a punta di cotone fine bagnato di salina nello spazio delle nervature per sezionare nello spazio pleurico attraverso la porzione cauterizzata. Posizionare una spugna salina bagnata da tre per due millimetri nel torace per aiutare a collassare il polmone. Quindi, usa le forbici per allargare la toracotomia fino a quando il diaframma è visibile ventralmente e l'incisione è a diversi millimetri di distanza dai muscoli paraspinus dorsalmente.Per esporre l'aorta, posizionare i retrattili delle costole nell'incisione della toracotomia e rimuovere con cura la spugna dalla superficie del polmone. Coprire il polmone con una spugna salina bagnata da sei per quattro millimetri con le estremità rivolte rostralmente e caudally e posizionare un ampio retrattile polmonare piatto sulla spugna. Quindi, far scorrere delicatamente il riavvolgitore ventricolare fino a quando l'aorta toracica discendente è esposta e utilizzare le forcelle numero sette per sezionare una sezione di circa cinque millimetri di tessuto connettivo e grasso dall'aorta.Per applicare l'elastasi, in primo luogo, utilizzare una micropipetta per saturare una spugna di 0,5 per un millimetro con 12 microlitri di elastasi pancreatica suina e posizionare la spugna sulla superficie esposta dell'aorta. Dopo tre o cinque minuti, utilizzare le forcep numero sette per rimuovere la spugna di elastasi e rimuovere il riavvolgitore polmonare. Irrigare la cavità toracica con circa la metà di un millilitro di soluzione salina sterile.Rimuovere la spugna polmonare e utilizzare un pezzo di garza arrotolato da due a due pollici per assorbire l'irrigazione salina rimanente. Rimuovere i retrattili delle nervature e deporre le costole con tre suture non assorbibili a sei ore interrotte, legando un nodo sciolto in ogni sutura senza legare le suture. Dopo aver rigonfiato il polmone, legare le suture e riapprossimare gli strati muscolari con una sutura intrecciata assorbibile a cinque ore.Chiudere la pelle con da sette a 10 suture non assorbibili interrotte da cinque a 10. Quindi, monitorare l'animale fino alla piena recumbency. Nel punto finale sperimentale appropriato, utilizzare le forbici per incidere la pelle medialmente dal fianco sinistro all'addome centrale, facendo attenzione a non entrare nel peritoneo.Incidere la pelle dal fianco sinistro dorsale rostralmente alla spalla sinistra e fare un'incisione con un angolo di 90 gradi attraverso l'ascella fino allo sterno. Usando il cautery, sezionare il lembo cutaneo verso l'aspetto ventrale del topo per esporre l'emotorace sinistro e utilizzare le forbici per entrare nell'addome lungo il margine costale sinistro dalla direzione ventrale a quella dorsale per esporre la parte inferiore del diaframma sinistro. Se il bordo più laterale del diaframma non si apre, incise il diaframma sul bordo più laterale.Posizionando la punta del cautery in questo foro, cauterizzare il diaframma dal margine costale al processo xifoide e utilizzare un applicatore umido con punta di cotone a punta fine per liberare delicatamente il polmone da eventuali aderenze alla parete toracica. Mentre si assicura che il polmone sia fuori mano, utilizzare l'elettrocauteria per tagliare le costole e la parete toracica dal margine costale alla prima costola, dalla linea dorsale a quella medio ascellare, ma ad almeno due millimetri dall'aorta. Tagliare lungo il margine superiore della prima costola e riflettere ventralmente la gabbia toracica per esporre l'emotorace.Posizionare i retrattiri sul polmone e tirare medialmente. Posizionare un riavvolgitore o una garza bagnata di salina sul diaframma e disegnare caudally per esporre il maggior numero possibile di aorta. Utilizzare un applicatore asciutto con punta di cotone per rimuovere eventuali aderenze dall'aneurisma aortico e da un segmento distale non influenzato e utilizzare la micrometria video per misurare il diametro del segmento di controllo non influenzato e la parte più ampia dell'aneurisma trattato con elastasi.Per raccogliere l'aorta, afferrare il vaso con le forcep danneggiate appena distale al segmento trattato e utilizzare le forbici per tagliare distale alle forcep. Sezionare l'aorta dalla colonna vertebrale e tagliare il vaso prossimale al segmento trattato per rimuovere il tessuto aneurismatico. Quindi, utilizzando una siringa e un ago tubercolina, lavare il lume aortico con soluzione salina ed elaborare il campione secondo l'analisi sperimentale a valle pianificata.L'aneurisma toracico sviluppato è di forma fusiforme e si verifica solo nella porzione trattata sull'aorta. In questa misurazione rappresentativa della micrometria video, la dilatazione aortica è stata determinata al 130% al momento della raccolta dei tessuti. Infatti, mentre i topi trattati con elastasi di tipo mostrano un aumento significativo della dilatazione aortica nei giorni tre, sette, 14 e 21 post-trattamento con la massima dilatazione osservata al giorno 14 rispetto al controllo dei topi di tipo selvatico.L'analisi istologica rivela che gli aneurismi di tipo selvaggio hanno fibre di elastina sottili e frammentate. C'è anche una colorazione cellulare muscolare meno liscia con un aumento del macrofago e dell'espressione un-beta interlugine. Il polmone murino è estremamente delicato e la lesione è solitamente fatale.Prestare la massima attenzione con l'ingresso iniziale nel torace e manipolare il polmone solo con spugne bagnate da saline. Questo modello ha contribuito a chiarire il ruolo dell'interluigine one-beta e interlukin six nella patogenesi degli aneurismi aortici toracici discendenti e come il loro blocco potrebbe facilitare la gestione non chirurgica di questi aneurismi.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Ricerca

Medicina

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Background
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