Name: characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy at JoVE.com

يشكر المؤلفون المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNF) على الدعم المالي (رقم المنحة P2ELP2_162116 و P300P2_171219)، وكلية داروين، برنامج Erasmus+ للدعم المالي (رقم المنحة 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) وقد تلقت البحوث التي أدت إلى هذه النتائج تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي في إطار البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013) من خلال منحة ERC PhysProt (الاتفاق رقم 337969)، ومؤسسة نيومان (T.P.J.K.) ومؤسسة مركز كامبريدج للأمراض القابلة للطي (C.G., M.V., and T.P.J.K.).

1. تجميع الاختبارات على قارئات لوحة الفلورة
ملاحظة: البروتوكول الموضح هنا هو مثال على كيفية دراسة تجميع أي بروتين أو ببتيد بواسطة الحركية الكيميائية. على وجه الخصوص، فإنه يصف بروتوكول الأمثل لدراسة تجميع الببتيد Aβ42، الذي يشارك في بداية وتطور مرض الزهايمر58،</s...

الخطوة الحاسمة الأولى في هذا البروتوكول هي إعداد البروتينات الأحادية، كما هو الحال في حل Aβ42 الموضح في الخطوتين 1.1 و1.2. من الضروري الشروع في عملية التجميع من حل أحادي النضوس، حيث أن وجود الأنواع القلة أو المجمعة قد يؤدي إلى ضعف إمكانية استنساخ حركية التجميع58،والحث على المصنوع?...

أكثر من 40 مليون شخص في جميع أنحاء العالم يتأثرون حاليا بالاضطرابات العصبية، مثل مرض الزهايمر (AD)1 ومرض باركنسون (PD)2 الأمراض. وبشكل أعم، يرتبط أكثر من خمسين علم أمراض على المستوى الجزيئي مع سوء طي البروتين والتجميع، وهي عملية تؤدي إلى انتشار مجاميع بروتين الفيبريلار غير القابلة للذوبان، والمعروفة باسم رواسب الأميلويد3، 4.الأصول الجزيئية للتنكس العصبي وصلاتها مع التغيرات المطابقة البروتينية للبروتينات مما يؤدي إلى تشكيل الأميلويد، ومع ذلك، لا تزال غير واضحة، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى مستوى عال من التغاير، والطبيعة العابرة ونانوscale أبعاد المجاميع المرضية4،5.
وقد استندت التحقيقات الناجحة للغاية من هياكل البروتين في العقود القليلة الماضية على نطاق واسع على استخدام أساليب السائبة، بما في ذلك الأشعة السينية البلورات، والفحص المجهري الإلكترون بالتبريد ومطياف الرنين المغناطيسي النووي5، 6 , 7 , 8 , 9. ضمن هذه الفئة من التقنيات، ظهرت الأشعة تحت الحمراء (IR) مطياف كأداة تحليلية حساسة لكشف الخصائص الكيميائية للنظم البيولوجية مثل البروتينات8. تسمح أساليب الأشعة تحت الحمراء بالقياس الكمي للتغيرات الهيكلية الثانوية والرباعية للبروتين أثناء طيها وتجميعها. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل المزيد من فك على المستوى المجهري التفاصيل الميكانيكية التي تنطوي عليها المناظر الطبيعية المعقدة للطاقة الحرة من البروتين أثناء تجميعها، كان تقدما كبيرا في تطوير أدوات الحركية الكيميائية لتمتد إلى معقدة مسارات التجميع الذاتي بما في ذلك تشكيل الفيبريلات الأميلويد5،6،7،10،11،12. ومع ذلك، فإن الأساليب الطيفية السائبة لا توفر سوى معلومات متوسطة عن مجموعة غير متجانسة من الأنواع الموجودة في الحل أو المشاركة في خطوات مجهرية محددة، مما يجعل التحقيق في الخصائص البيوفيزيائية للفرد الأنواع المجمعة التي تتحدى على مستوى النانو13،14.
وقد ظهرت في العقود الأخيرة عدة تقنيات للتنظير المجهري مع القدرة على العمل على مقاييس أصغر من حد الانعراج للضوء. وتشمل هذه الفئة من الأساليب الفحص المجهري الإلكتروني (EM) والفحص المجهري للقوة الذرية (AFM). في حين أن المسح المجهري الإلكتروني (SEM) والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM) يوفران صورًا ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) للعينة، فقد ظهر AFM في العقود الأخيرة كتقنية قوية ومتعددة الاستخدامات لدراسة المورفولوجيا ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)، كما فضلا عن الخصائص النانوية الميكانيكا للعينة مع قرار دون نانومتر13،14،15،16،17،18،19، 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27.الأساس المنطقي وراء دراسة تجميع البروتين عن طريق AFM هو أن هذا النهج يتيح التحقيق في مورفولوجيا الأنواع الفردية الموجودة في الحل13،14،16، 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31،32،33،34،35،36،37. على وجه الخصوص، من خلال رصد العينة كدالة للوقت، يسمح AFM بالتحقيق في تطور مورفولوجيا الأنواع داخل العينة، مما يجعل من الممكن متابعة وتصور مسارات تشكيل الأميلويد23، 25،38،39،40،41،42. وعلاوة على ذلك، يتيح AFM التحديد الكمي للمعلمات الهيكلية مثل ارتفاعات وأطوال الأنواع الفردية الموجودة في الحل13و19و30و31 ،32،33،34،35،36،37،40،43، 44 , 45 , 46 , 47 , 48- غير أن دراسة خاصية فيزيائية حيوية واحدة، مثل علم المورفولوجيا، كثيرا ما لا تكون كافية عند دراسة النظم البيولوجية غير المتجانسة والمعقدة. طرق التصوير AFM أو SEM أو TEM وحدها لا تكشف بسهولة عن الخصائص الكيميائية للأنواع غير المتجانسة من المجاميع الأميلويد على مقياس النانو.
وقد أحرز تقدم كبير لتحليل العينات البيولوجية غير المتجانسة على هذا النطاق في الآونة الأخيرة مع تطوير وتطبيق في مجال تجميع البروتين من التصوير النانوبي بالأشعة تحت الحمراء (AFM-IR)24،26، 38،42،49،50،51،52. يستغل هذا الأسلوب المبتكر الجمع بين الاستبانة المكانية لـ AFM (حوالي 1-10 نانومتر) مع قوة التحليل الكيميائي للالأشعة تحت الحمراء. وتستند تقنية AFM-IR إلى قياس تأثير الرنين المستحث بالحرارة الضوئية مدفوعاً بليزر الأشعة تحت الحمراء، وإلى قياس التوسع الحراري للعينة قيد التحقيق من طرف AFM. يمكن إضاءة العينة بواسطة ليزر الأشعة تحت الحمراء مباشرة من أعلى أو من أسفل في انعكاس داخلي كامل، وبالمثل كما هو الحال في مطياف الأشعة تحت الحمراء التقليدية24،42،52،53 . يمكن نبض ليزر الأشعة تحت الحمراء بترددات نموذجية بحسب مئات الكيلوهرتز (1-1000 كيلوهرتز) وضبطه على نطاق طيفي واسع، عادة بين 1000-3300 سم-1. على الرغم من أن مصدر الليزر يغطي مساحة تبلغ حوالي 30 درجة مئوية، يتم تحديد الاستبانة المكانية لتقنية AFM-IR اسمياً من خلال قطر طرف AFM، الذي يكشف التوسع الحراري المحلي للنظام. AFM-IR مناسبة تماما لدراسة العينات البيولوجية لأن إشارة الأشعة تحت الحمراء يتناسب مع سمكها تصل إلى 1-1.5 ميكرومتر، وأطياف الأشعة تحت الحمراء الناتجة عموما تتفق مع أطياف الإرسال FTIR المقابلة13،54 ،55. ولهذا السبب، يمكن تطبيق أساليب التحليل المعمول بها في التحليل الطيفي بسهولة، مثل دراسة التحولات الكيميائية، وتغيير شكل النطاق، وفك الإلتواء عن طريق تحليل المشتقات الثانية52. وعموما، فإن الجمع بين الاستبانة المكانية للمركبات المضادة للمواد الكيميائية وقوة التعرف الكيميائي على مطياف الأشعة تحت الحمراء، يتيح AFM-IR الحصول في وقت واحد على مجموعة واسعة من الخصائص المورفولوجية والميكانيكية والكيميائية لعينة على مقياس النانو.
هنا، نقوم بتوضيح بروتوكول لتوصيف عملية تجميع البروتين الذي يستغل مزيج من اختبارات الفلورة في المختبر، والتصوير عالي الدقة AFM والأشعة تحت الحمراء نانوية AFM. وقد برع هذا النهج المشترك بالفعل في تقديم نتائج مفصلة في دراسة الخصائص الكيميائية والهيكلية للقطرات الصغيرة الفردية التي شكلتها المجاميع البروتين، في دراسة فصل مرحلة البروتين السائل السائل، وفي التحقيق في التغايرية والخصائص الفيزيائية الحيوية للأنواع المجمعة الفردية في النانومقياس23،26،38،45،50،53، 56و57.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM-IR system</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>nanoIR 2 or 3</td>
			<td>Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminium Sealing Tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Adhesive Discs</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGG3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>415-101</td>
			<td>Platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica Disc 10mm V1</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Park NX10 AFM system</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platypus Ultra-Flat Gold Chips</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPP-NCHR-10 cantilevers</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>PPP-NCHR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LowBind Tubes, 2.0mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gold coated cantilevers</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>PR-EX-nIR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPM Specimen Discs 12mm</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy

ظاهرة عدم طي البروتين والتجميع يؤدي إلى تشكيل المجاميع البروتين غير متجانسة للغاية، والتي ترتبط مع الظروف العصبية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون. وعلى وجه الخصوص، تبين أن المجاميع ذات الوزن الجزيئي المنخفض، وهي قلة الأميلويد، تمتلك خصائص سمية سماوية عامة، وهي متورطة كسموم عصبية في العديد من أشكال الخرف. نحن نوضح استخدام الأساليب القائمة على الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) لمعالجة المهمة الصعبة المتمثلة في توصيف الخصائص المورفولوجية والهيكلية والكيميائية لهذه المجاميع، والتي يصعب دراستها باستخدام الهيكلية التقليدية الأساليب أو الأساليب البيوفيزيائية السائبة بسبب عدم تجانسها وطبيعتها العابرة. وتقترب التنظير المجهري للمسبار المسحي قادرة الآن على التحقيق في مورفولوجيا المجاميع النشوانية ذات الاستبانة دون النانومترية. نبين هنا أن الأشعة تحت الحمراء (IR) nanospectroscopy (AFM-IR)، الذي يستغل في وقت واحد دقة عالية من AFM وقوة التعرف على المواد الكيميائية من مطياف الأشعة تحت الحمراء، يمكن أن تذهب أبعد من ذلك وتمكين توصيف الخصائص الهيكلية للفرد المجاميع البروتين، وبالتالي تقديم رؤى في آليات التجميع. وبما أن النهج الذي نصفه يمكن تطبيقه أيضا على التحقيقات في تفاعلات تجمعات البروتين مع الجزيئات الصغيرة والأجسام المضادة، فإنه يمكن تقديم معلومات أساسية لتطوير مركبات علاجية جديدة لتشخيص أو علاج الاضطرابات العصبية.

ويبين الشكل 1مسار زمني تمثيلي لتجميع Aβ42، مقيساً بـ "قياس الفلورة" (ThT) . تتميز عملية التجميع عادة بمنحنى السيني، حيث يتم ملاحظة مرحلة التأخر في البداية، ويليها مرحلة نمو حاد، قبل أن يصل المنحنى إلى هضبة عندما يتم الوصول إلى حالة توازنثابتة6،7 <...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

نحن نصف تطبيق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية عالية الدقة لتصور عملية التجميع الذاتي للبروتين في مجاميع oligomeric وfibrils الأميلويد، والتي ترتبط ارتباطا وثيقا مع بداية والتنمية من مجموعة واسعة من الاضطرابات العصبية البشرية.

وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

الأساليب القائمة على المجهرية القوة الذرية تجعل من الممكن لتوصيف العمليات الجزيئية الحيوية على نطاق نانو مع الكيميائية المورفولوجية أو القرار الهيكلي، وفتح أخيرا نافذة أمامية جديدة للمراقبة على علم الأحياء. تمكن طرق الجزيء المفرد من البحث عن أنظمة غير متجانسة للغاية ، وهي ميزة ذات صلة خاصة بفهم تجميع البروتين. من خلال الجمع بين جزيئات واحدة مع النهج الظهر، يمكننا الحصول على معلومات أساسية حول سلوك البروتينات، وصلاتها مع الأمراض البشرية وتصميم التدخلات الدوائية التي يمكن أن تكون ناجحة.وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة بنجاح لدراسة الخصائص الكيميائية والهيكلية للمواد الأحيائية لأغراض توصيل المخدرات، والتطبيقات، وغيرها من الأغراض التكنولوجية الحيوية. قد يكون من الصعب في البداية لتعيين المعلمات AFM الصحيح لدقة عالية وأنه من السهل إعداد AFM الخاص بك في حين قياس المجاميع الخاص بك الفبريل. قبل 30 دقيقة من التصوير AFM، قم بتشغيل نظام AFM وانقر فوق الإعداد والمسبار.في إطار تغيير التحقيق، انقر فوق التالي لإعداد مرحلة التركيز Z. إيقاف تشغيل مفتاح شعاع AFM إذا كان على وفتح أقفال dovetail. قطع الرأس من النظام وفي إطار التغيير التحقيق، انقر فوق التالي.جبل AFM cantilever على حامل التحقيق. توصيل الرأس إلى النظام وقفل الأقفال التيلات. بدوره على مفتاح شعاع الليزر AFM وفي نافذة تغيير التحقيق، انقر فوق التالي.في النافذة المنبثقة، انقر فوق لا إذا لم يتغير نوع cantilever وضبط المقابض المحاذاة البصرية للعثور على cantilever. ضبط التركيز على cantilever وانقر فوق المقبل. في النافذة المنبثقة، انقر فوق نعم إذا كان التركيز على الـ cantilever.استخدام مقابض شعاع الليزر الكشف عن الموقع شعاع الليزر في نهاية cantilever. استخدام المقابض شعاع الليزر منحرفة لتحقيق أقصى قدر من إشارة مجموع تقاس بواسطة رباعي الصمام الثنائي الصورة أربعة إلى ما لا يقل عن أكثر من فولت واحد. في نافذة تغيير التحقيق، انقر فوق التالي ثم أغلق.بعد انتظار 15 دقيقة ل cantilever للوصول إلى الاستقرار الحراري، وإعادة ضبط موقف شعاع الليزر منحرفة على الصمام الثنائي الصورة الحساسة الموقف إذا لزم الأمر. انقر فوق NCM الاجتياح، حدد السعة المطلوبة من التذبذب، انقر فوق مرحلة الاستخدام وانقر فوق السيارات. لحن cantilever قريبة من الحد الأقصى من الرنين الأول الحر للتذبذب إلى ما يقرب من 300 كيلو هرتز ل cantilever مع ثابت الربيع من 40 نيوتن لكل متر.ضع العينة على حامل العينة. انقر فوق منطقة المسح الضوئي وتعيين الدقة إلى ما بين 256 في 256 و 1024 من قبل 1024 بكسل ثم قم بتعيين حجم المسح الضوئي ورقم بكسل. تعيين معدل المسح الضوئي إلى 0.3 إلى هرتز واحد لمنطقة مسح واحد تلو واحد إلى خمسة في خمسة ميكرومتر مربع.التركيز على عرض بصري على عينة وانقر على نهج لنهج عينة. بعد ذلك، انقر فوق رفع 100 ميكرومتر لرفع طرف AFM 100 ميكرومتر فوق سطح العينة وانقر فوق توسيع الصورة البصرية للعينة. انقر فوق شريط المرحلة التركيز لتركيز العرض على سطح العينة واستخدام الأسهم للتحرك في المنطقة من عينة من الفائدة.انقر على النهج لإشراك سطح وانقر فوق خط المسح الضوئي لمعرفة ما إذا كان الطرف هو متابعة السطح جيدا. اضبط نقطة الضبط حسب الضرورة. ثم انقر فوق المسح الضوئي لبدء تصوير سطح العينة، مع الحفاظ على نظام ثابت من تغيير المرحلة لا يتجاوز دلتا 20 أثناء التصوير لتجنب قوة تصوير كبيرة والحفاظ على الاتساق بين العينات المستقلة.بالنسبة للتصوير الضوئي النانوي بالأشعة تحت الحمراء، قبل 30 إلى 60 دقيقة من التحليل، قم بتشغيل نظام AFM IR وأشعة الليزر IR. فتح بنيت في البرنامج للسيطرة على الصك وانقر فوق ملف وجديدة لفتح ملف جديد نانو IR. انقر على تهيئة لبدء نظام AFM IR وفتح غطاء الصك.جبل مسبار سيليكون مطلي بالذهب مع دائرة نصف قطرها الاسمية من 30 نانومتر وثابت الربيع من 0.2 نيوتن لكل متر على نظام الأشعة تحت الحمراء AFM لقياس العينة في وضع الاتصال. انقر فوق تحميل في القسم مسبار AFM والقادم. استخدام التركيز على السهام التحقيق لتركيز الكاميرا على cantilever واستخدام تلميح لتقاطع لوضع مرمى في نهاية cantilever.تدوير المقابض السيطرة على موقف ليزر الكشف عن موقع الليزر في نهاية cantilever. تدوير المقابض الليزر للكشف عن وتعظيم المبلغ الذي يقاس بواسطة رباعي الصمام الثنائي الصورة إلى قيمة أكبر من ثلاثة فولت. تدوير مقبض انحراف لضبط انحراف cantilever إلى ناقص فولت واحد وانقر فوق التالي.ثم أغلق غطاء الصك. استخدام التركيز على السهام التحقيق لتركيز الكاميرا على العينة وتلميح لتقاطع السهام للتحرك في المنطقة ذات الاهتمام من العينة. انقر فوق التالي والمشاركة.في نافذة المجهر، حدد الارتفاع للمورفولوجيا، السعة اثنين لامتصاص الأشعة تحت الحمراء وتردد PLL لرسم خريطة غيض لعينة الرنين الاتصال. في قسم الفحص AFM، قم بتعيين المعلمات كما هو موضح للتصوير AFM وانقر على المسح الضوئي للحصول على خريطة مورفولوجيا. عند الانتهاء من رسم مورفولوجيا، في نافذة المجهر، انقر فوق مخطط الارتفاع لوضع المسبار في أعلى تجميع واحد.في قسم نانو IR، انقر فوق بدء IR لإلقاء الضوء على العينة باستخدام الليزر IR. لتركيز الليزر تحت الحمراء على كانتليفر، انقر فوق تحسين وأدخل 1655 سنتيمترًا للرقم الموجي. انقر فوق إضافة والمسح الضوئي لتحديد موضع الليزر الأشعة تحت الحمراء وانقر فوق التحديث واتفقنا لمحاذاة موقفها مع cantilever.في المقطع عام، أدخل عدد الموجة الذي يتوقع امتصاص عالية في الحقل النسبي وإلغاء تنشيط خيار عامل تصفية تمرير الشريط. انقر فوق بدء IR ثم تحقق من قراءة العداد و FFT من استجابة cantilever. في إطار FFT، قم بتحريك المؤشر الأخضر لقراءة تردد الرنين لـ cantilever.وهناك قيمة نموذجية من FFT من صدى cantilevers حوالي 200 كيلوهيرتز. أدخل قيمة تردد الرنين المولدة في القسم العام في حقل مركز التردد واستخدم نافذة تردد 50 كيلوهيرتز. انقر فوق الليزر نبض نافذة لحن لتحديد وضع الرنين المعزز وتعيين معدل نبض 222 كيلوهيرتز، ومجموعة لحن من 50 كيلو هرتز ودورة عمل ليزر من 5٪ انقر الحصول على لاكتساح معدل النبض من الليزر.استخدام المؤشر لضبط نبض الليزر إلى تردد الاستجابة الميكانيكية للتمدد الحراري للعينة امتصاص ضوء الأشعة تحت الحمراء. ثم حدد المرحلة تأمين حلقة لمراقبة صدى الاتصال بين العينة والتلميح وانقر فوق صفر. بالنسبة للخصائص الكيميائية الأخرى على مقياس النانو، تتبع رنين الاتصال أثناء اكتساب الأطياف لضمان عدم تأثر طيف العينة بالانهاك والتليين.حدد تمكين لتتبع العينة لتلميح صدى الاتصال وحدد مكسباً لا يتجزأ من 0.5 ومكسب نسبي من 10 ثم انقر فوق موافق. في نافذة تحسين، انقر فوق الطول الموجي والمسح لتحديد موقع ليزر الأشعة تحت الحمراء لثلاثة ترقيم الموجي على الأقل المقابلة لنطاقات الامتصاص الرئيسية للعينة ولرقم موجي واحد على الأقل لكل رقاقة من الليزر. انقر فوق أدوات ، معايرة الخلفية الأشعة تحت الحمراء والجديدة ، وتعيين عدد الموجة إلى ما بين 1200 و 1800 سنتيمتر. تعيين الخلفيات إلى متوسط إلى واحد، ودورة العمل من 5٪، وسرعة الاجتياح إلى 100 سم مربع.انقر فوق الحصول على لقياس خلفية الليزر الأشعة تحت الحمراء لتطبيع الأطياف موضعية مقياس النانو قياس، حفظ الملف وإغلاق النافذة. في إعدادات أطياف الأشعة تحت الحمراء، حدد دقة طيف الأشعة تحت الحمراء بين سنتيمتر وأربعة سنتيمترات وعدد من المتوسطات المشتركة التي لا تقل عن 64 مرة. ثم انقر فوق الحصول على لقياس نانو مقياس نطاق IR المترجمة في نطاق البروتين.للحصول على خريطة كيميائية تم حلها بمقياس نانو، حدد 1655 سنتيمترًا والتصوير بالأشعة تحت الحمراء وانقر على المسح الضوئي في نافذة المسح الضوئي AFM. عند اكتمال التعيين، قم بحفظ القياسات. ثم استخدام بنيت في برنامج معالجة الصور AFM لتحليل الخرائط المكتسبة من مورفولوجيا، الرنين الاتصال والكيمياء والأطياف المترجمة مقياس نانو.وهي خطوة حاسمة للحصول على حل أحادية خالصة للغاية حيث أن وجود الأنواع المجمعة قد يؤدي إلى سوء استنساخ الحركية وإدخال القطع الأثرية في القياسات الخاصة بك. ومن العوامل الأساسية لنجاح دراسة العينات البيولوجية التي لديها تباين عال هو وضع الركائز الصلبة الصحيحة. يمكن استغلال ترسب رذاذ microfluidic بدلا من واحد يدوي من أجل الحفاظ على بنية العينة وعدم تجانس.تمهد هذه الطرق الطريق لكشف البنية الكيميائية وخصائص الجزيئات الحيوية الفردية وتفاعلاتها في البيئة السائلة الفسيولوجية والأصلية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

إثراء مجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

البروتين فيلم الأشعة تحت الحمراء كهربية أبداه Hydrogenase [NiFe] للدراسة لأكسدة2 ح

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

بوليميراز الدنا نشاط الإنزيم استخدام القريبة من الأشعة تحت الحمراء الحمض النووي المسمى الفلورسنت تصور بالتفريد هلام الاكريلاميد

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...