Name: characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-12T15:00:00
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作者感谢瑞士国家科学基金会（SNF）的财政支持（赠款号P2ELP2_162116和P300P2_171219），达尔文学院，伊拉斯谟®计划的财政支持（赠款号2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3）和导致这些结果的研究通过ERC赠款PhysProt（协议号337969）、纽曼基金会（T.P.J.K.）和剑桥错折疾病中心（C.G.、M.V.和T.P.J.K.）。

1. 荧光板读取器上的聚合测定
注：此处描述的协议是如何通过化学动力学研究任何蛋白质或肽的聚合的示例。特别是，它描述了一个优化的协议，以研究A+42肽的聚合，它参与阿尔茨海默氏病的发病和进展58，59。类似的方案可以调整和采用，以研究任何蛋白质或肽的聚合。
<ol><li>通过电离交换和大小排除色谱技术获得A+42的超纯单?...

该协议的第一个关键步骤是制备单体蛋白，如步骤1.1和1.2中描述的A_42溶液。从高度纯、单一的溶液启动聚合过程至关重要，因为寡头或聚合物种的存在可能导致聚合动力学58的可重复性差，并诱导 AFM 中的人工制品测量（例如，纤维素物种在聚集的初始阶段将明显），这可能导致对数据的误解。基于ThT荧光测定的淀粉样形成的高度可重复动力学数据，与化学动力学5、6、7...

目前，全世界有超过4000万人受到神经退行性疾病的影响，如阿尔茨海默氏症（AD）1和帕金森氏症（PD）2型疾病。 更一般地，超过五十种病理学在分子水平上与蛋白质误折叠和聚集有关，这一过程导致不溶性纤维蛋白聚集物的增殖，称为淀粉样矿床3， 4.神经退化的分子起源及其与蛋白质形成蛋白的构象变化的联系，然而，仍然不清楚，这在很大程度上是由于异质性、瞬态性和纳米尺度的高水平病理聚合体4，5的尺寸。
在过去的几十年中，蛋白质结构的研究非常成功，广泛基于批量方法的使用，包括X射线晶体学、低温电子显微镜和核磁共振光谱学5，6,7,8,9.在这类技术中，红外（IR）光谱技术已成为一种敏感的分析工具，可以揭示蛋白质8等生物系统的化学性质。红外方法允许在蛋白质误折叠和聚合期间对蛋白质二次和四元结构进行定量。此外，为了在微观层面上进一步破译蛋白质聚合过程中复杂的自由能量景观所涉及的机械细节，一个重大进展是开发化学动力学工具，以扩展到复杂的自组装途径包括淀粉样纤维蛋白形成5，6，7，10，11，12。然而，散装光谱方法只提供关于溶液中存在的物种的异质组合或涉及特定微观步骤的平均信息，从而对个体的生物物理特性进行了调查在纳米级13、14级挑战的聚合物种。
在过去的几十年中，出现了几种显微镜技术，其操作能力小于光的衍射极限。此类方法包括电子显微镜 （EM） 和原子力显微镜 （AFM）。扫描电子显微镜 （SEM） 和传输电子显微镜 （TEM） 提供标本的二维 （2D） 图像，而 AFM 在过去几十年中已成为一种功能强大且用途广泛的技术，用于研究三维 （3D） 形态，如以及亚纳米分辨率13、14、15、16、17、18、19的样品的纳米力学特性。20,21,22,23,24,25,26,27.研究通过AFM的蛋白质聚集的理由是，这种方法能够研究溶液13、14、16中个别物种的形态。 17，19，20，21，25，27，28，29，30 31，32，33，34，35，36，37。特别是，通过监测样本作为时间的函数，AFM允许调查样本内物种形态的演变，从而能够跟踪和可视化淀粉样蛋白形成的途径23。 25，38，39，40，41，42。此外，AFM 能够量化结构参数，如溶液13、19、30、31中存在的单个物种的横截面高度和长度 ，32，33，34，35，36，37，40，43，44,45,46,47,48.然而，在研究异质和复杂的生物系统时，对单一生物物理特性的研究，例如形态学，往往是不够的。AFM、SEM 或 TEM 成像方法本身并不能轻易揭示纳米尺度上异构淀粉样聚合体的化学性质。
随着红外纳米光谱（AFM-IR）24、26、24、26、24、26 、24、26 、24、26、24、26、26 、26 、26 、26 、26 、26 、26 、26、26、24、24、26、24、26、26、26、24、26、26、24、26、26、24、26、24、26、26、24、26、24、26、26、26、24、26号蛋白质聚集领域的开发 38，42，49，50，51，52.这种创新方法利用了AFM（±1~10nm）的空间分辨率与红外化学分析能力的结合。AFM-IR 技术基于红外激光驱动的光热感应共振效应的测量，以及 AFM 尖端所调查样品的热膨胀的测量。样品可以直接由红外激光从顶部或底部在总内部反射中照亮，类似于传统的红外光谱24、42、52、53.红外激光器的典型频率可按数百千赫（1~1000 kHz）的顺序进行脉冲，并在宽光谱范围内进行调谐，通常在1000~3300厘米-1之间。虽然激光源的直径为 ±30 μm，但 AFM-IR 技术的空间分辨率名义上由 AFM 尖端直径确定，该直径可检测系统的局部热膨胀。AFM-IR 非常适合研究生物样品，因为红外信号与其厚度成正比，高达 1~1.5 μm，并且生成的红外光谱通常与相应的 FTIR 透射光谱13、54 一致 ， 55.因此，在光谱学中可以容易地应用既定的分析方法，例如通过第二导数分析研究化学变化、带形变化和去卷积。总体而言，AFM 的空间分辨率与红外光谱的化学识别能力相结合，使样品能够在纳米尺度上同时采集各种形态、机械和化学特性。
在这里，我们演示了蛋白质聚合过程的表征方案，该协议利用体外荧光测定、高分辨率 AFM 成像和纳米级 AFM-IR 的组合。这种组合方法在研究蛋白质聚合形成的单个微液滴的化学和结构特性、液-液蛋白相分离的研究以及在纳米尺度23、26、38、45、50、53， 56，57.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM-IR system</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>nanoIR 2 or 3</td>
			<td>Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminium Sealing Tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Adhesive Discs</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGG3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>415-101</td>
			<td>Platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica Disc 10mm V1</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Park NX10 AFM system</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platypus Ultra-Flat Gold Chips</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPP-NCHR-10 cantilevers</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>PPP-NCHR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LowBind Tubes, 2.0mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gold coated cantilevers</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>PR-EX-nIR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPM Specimen Discs 12mm</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy

蛋白质误折叠和聚集的现象导致形成高度异质蛋白聚集体，这些聚合与神经退行性疾病（如阿尔茨海默氏症和帕金森病）相关。特别是低分子量聚合物，淀粉样寡聚物，已被证明具有一般细胞毒性，并被牵连为神经毒素在许多形式的痴呆症。我们说明了使用基于原子力显微镜（AFM）的方法，以解决这些骨料的形态、结构和化学特性的特性这一具有挑战性的任务，这些特性很难使用传统的结构来研究。方法或散装生物物理方法，因为它们的异质性和瞬态性。扫描探针显微镜方法现在能够研究淀粉样粒体具有亚纳米分辨率的形态。我们在这里表明，红外（IR）纳米光谱（AFM-IR），同时利用AFM的高分辨率和红外光谱的化学识别能力，可以更进一步，使个体的结构特性的表征蛋白质聚合，从而提供对聚合机制的见解。由于我们描述的方法也可以应用于研究蛋白质组件与小分子和抗体的相互作用，它可以提供基本信息，以开发新的治疗化合物来诊断或治疗神经退行性疾病。

A_42聚合的代表性时间过程，由ThT荧光测定测量，如图1所示。聚合过程通常以 sigmoidal 曲线为特征，其中最初观察到滞后阶段，然后是陡峭的生长阶段，在达到平衡稳定状态达到6、7时曲线达到稳定状态之前,58.必须确保使用优化的聚合协议来生成高质量的数据，以研究与聚合过程有关的分子细节<sup class="xr...

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Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

我们描述了红外纳米光谱学和高分辨率原子力显微镜的应用，将蛋白质自组装过程可视化为寡聚体和淀粉样纤维蛋白，这与发病和发展密切相关广泛的人类神经退行性疾病。

通过红外纳米光谱和原子力显微镜对单个蛋白质聚合进行特征化

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

基于原子显微镜的方法，利用形态化学或结构分辨率对纳米尺度的生物分子过程进行表征，最终为生物学观测打开了新的前视窗。单分子方法能够探测高度异构的系统，这一特征对于理解蛋白质聚合特别相关。通过将单个分子与背部方法相结合，我们可以获得有关蛋白质行为的基本信息，它们与人类疾病的联系，并设计出可以成功的药理干预。此外，该方法还可成功地应用于研究生物材料的化学和结构特性，用于药物输送、应用和其他生物技术目的。最初为高分辨率设置正确的 AFM 参数可能具有挑战性，并且很容易在测量纤维聚合时设置 AFM。在 AFM 成像前 30 分钟，打开 AFM 系统，然后单击设置并探测。在探测更改窗口中，单击"下一步"以准备 Z 焦点阶段。如果 AFM 光束开关已打开，请将其关闭并解锁鸽子尾锁。断开头部与系统的连接，在探头更换窗口中，单击"下一步"。将 AFM 悬臂安装在探头支架上。将头连接到系统并锁定小尾锁。打开 AFM 激光束开关，在探头更换窗口中，单击下一步。在弹出窗口中，如果悬臂类型未更改，请单击"否"，并调整光学对齐旋钮以查找悬臂。将焦点调整到悬臂上，然后单击下一步。在弹出窗口中，如果焦点在悬臂上，请单击"是"。使用检测激光束旋钮将激光束定位在悬臂的端。使用偏转激光束旋钮将四个象限光电二极管测量的总信号最大化为至少大于一伏。在"探头更改"窗口中，单击"下一步"并关闭。等待悬臂达到热稳定性 15 分钟后，如有必要，重新调整位置敏感光电二极管上的偏转激光束的位置。单击 NCM 扫描，选择所需的振荡幅度，单击使用相位并单击自动。将悬臂接近其第一次自由谐振的最大值，将悬臂调至约 300 千赫的悬臂，其弹簧常数为每米 40 牛顿。将样品放在样品架上。单击扫描区域，将分辨率设置为 256 x 256 和 1024 x 1024 像素之间，然后设置扫描大小和像素数。将扫描速率设置为 0.3 到 1 赫兹，扫描区域为 1 到 5 到 5 微米平方。将光学视图聚焦在样品上，然后单击接近样品表面的方法。接下来，单击提升 100 微米，将 AFM 尖端提升 100 微米，然后单击扩展样品的光学图像。单击焦点阶段栏将视图聚焦在样本表面，并使用箭头在感兴趣的样本区域中移动。单击方法以接合曲面，然后单击线扫描以检查尖端是否很好地跟踪曲面。根据需要调整设定点。然后单击扫描开始成像样品表面，在成像过程中保持不超过增量 20 的恒定相变机制，以避免较大的成像力并保持独立样品之间的一致性。对于红外纳米光谱成像，在分析前 30 至 60 分钟，打开 AFM 红外系统和红外激光器。打开内置软件来控制仪器，点击文件，并打开新的纳米红外文件。单击初始化以启动 AFM 红外系统并打开仪器盖。将标称半径为 30 纳米且弹簧常数为 0.2 牛顿/米的硅胶镀金探头安装到 AFM IR 系统中，以在接触模式下测量样品。单击 AFM 探测部分中的加载，然后单击加载。使用探头箭头上的对焦将相机聚焦在悬臂上，并使用尖端十字线将十字线放在悬臂的末尾。旋转控制检测激光位置的旋钮，将激光定位在悬臂的端。旋转激光旋钮以检测四个象限光电二极管测量的总和并最大化到大于三伏特的值。旋转偏转旋钮将悬臂偏转调整为负一伏，然后单击下一个。然后关闭仪器的盖。使用探头箭头上的对焦将相机聚焦在样品上，尖对十字线箭头，以在样本感兴趣的区域中移动。单击"下一步"并参与。在显微镜窗口中，选择形态高度，选择振幅2用于红外吸收和PLL频率，以映射尖端到样品接触共振。在 AFM 扫描部分中，设置 AFM 成像演示的参数，然后单击扫描以获取形态图。完成形态图绘制后，在显微镜窗口中，单击高度贴图将探针定位在一个聚合的顶部。在纳米红外部分，单击"启动红外"以使用红外激光器照亮样品。要将红外激光器聚焦在悬臂上，请单击"优化"并输入 1655 厘米的波数。单击"添加"和"扫描"以确定红外激光位置，然后单击更新，即可将其位置与悬臂对齐。在常规部分中，输入预期相对字段中的高吸收率的波数，并停用带通滤波器选项。单击"启动红外"，然后检查仪表读数和悬臂响应的 FFT。在 FFT 窗口中，移动绿色光标以读取悬臂的谐振频率。软向器共振的 FFT 的典型值约为 200 千赫。在频率中心场的常规部分输入生成的谐振频率值，并使用 50 千赫的频率窗口。单击激光脉冲调窗选择谐振增强模式，并设置 222 千赫的脉冲速率、50 千赫的调谐范围和 5% 的激光占空比，以扫描激光的脉冲速率。使用光标将激光脉冲调谐为吸收红外光的样品热膨胀的机械响应频率。然后选择相位锁定循环以监视样品和尖端之间的接触共振，然后单击零。对于纳米级的其他化学性质，在光谱采集过程中跟踪接触共振，以确保样品光谱不受过热和软化的影响。选择"启用"以跟踪样品以提示接触共振，并选择 0.5 和 10 的比例增益，然后单击"确定"。在优化窗口中，单击波长并扫描以定位至少三个波数，这些波数对应于样品的主要吸收带，以及激光的每个芯片至少一个波数。单击工具、红外背景校准和新的，将波数设置为 1200 到 1800 厘米之间。将背景设置为平均值 1，占空比为 5%，扫描速度设置为 100 厘米平方。单击"获取"以测量红外激光背景，使测量的纳米尺度局部光谱正常化，保存文件并关闭窗口。在红外光谱设置中，选择 1 到 4 厘米之间的红外频谱分辨率和至少 64 倍的共平均值。然后单击"获取"以测量蛋白质范围内的纳米尺度局部红外光谱。要获取纳米比例解析化学图，请选择 1655 厘米和红外成像，并在 AFM 扫描窗口中单击扫描。映射完成后，保存测量值。然后使用内置的AFM图像处理软件分析获得的形态学、接触共振和化学以及纳米比例局部光谱的地图。获得高度纯的单体解决方案是关键步骤，因为聚合物种的存在可能导致动力学的可重复性较差，并在测量中引入伪影。成功研究具有高异质性的生物样品的一个基本因素是固体基板的位置是正确的。微流体喷雾沉积可以代替人工喷涂沉积，以保持样品的架构和异质性。这些方法为解开单个生物分子的化学结构和特性及其在生理和原生液体环境中的相互作用铺平了道路。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

人死后脑中洗涤剂不溶性蛋白的富集

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科研

生物化学

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