Name: characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy at JoVE.com

De auteurs danken de Zwitserse nationale Stichting voor wetenschap (SNF) voor de financiële steun (subsidie nummer P2ELP2_162116 en P300P2_171219), het Darwin College, Erasmus +-programma voor de financiële ondersteuning (subsidie nummer 2018-1-LT01-KA103-046719 -15400-P3) en de onderzoek dat tot deze resultaten leidt, heeft financiering ontvangen van de Europese Onderzoeksraad uit hoofde van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (KP7/2007-2013) via de ERC grant PhysProt (overeenkomstnummer 337969), de Newman Foundation (T.P.J.K.) en de Cambridge centrum voor Misvouwen ziekten (c., M.V., en T.P.J.K.).

1. aggregatie-assays op fluorescentie plaat lezers
Opmerking: het hier beschreven protocol is een voorbeeld van hoe de aggregatie van elk eiwit of peptide door chemische kinetiek te bestuderen. In het bijzonder, het beschrijft een geoptimaliseerde protocol voor het bestuderen van de aggregatie van de Aβ 42 peptide, die is betrokken bij het ontstaan en de progressie van de ziekte van Alzheimer58,59. Een soortgelijk protocol kan worden aa...

De eerste cruciale stap in dit protocol is de bereiding van monomere eiwitten, zoals in het geval van een Aβ 42-oplossing zoals beschreven in de stappen 1,1 en 1,2. Het is essentieel om het aggregatieproces te initiëren van een zeer zuivere monomere oplossing, aangezien de aanwezigheid van oligomere of geaggregeerde soorten kan resulteren in een slechte reproduceerbaarheid van de aggregatie kinetiek58, en artefacten in de AFM induceren metingen (bijv. fibrillar-soorten zullen zichtbaar zijn in d...

Meer dan 40.000.000 mensenwereld wijd worden momenteel getroffen door neurodegeneratieve aandoeningen, zoals Alzheimer (AD)1 en Parkinson (PD)2 ziekten. Meer in het algemeen worden meer dan 50 pathologieën geassocieerd op moleculair niveau met eiwit misvouwen en aggregatie, een proces dat leidt tot de proliferatie van onoplosbare fibrillar eiwit aggregaten, bekend als amyloïde deposito's3, 4. de moleculaire oorsprong van neurodegeneratie en de verbanden met eiwit conformationele veranderingen van eiwitten die leiden tot amyloïde vorming, blijven echter onduidelijk, grotendeels vanwege het hoge niveau van heterogeniteit, voorbijgaande aard en nanoschaal dimensies van de pathologische aggregaten4,5.
Zeer succesvolle onderzoeken van eiwit structuren in de afgelopen decennia zijn op grote schaal gebaseerd op het gebruik van bulk methoden, waaronder Röntgen kristallografie, Cryo-elektronenmicroscopie en nucleaire magnetische resonantie spectroscopie5, 6 , 7 , 8 , 9. binnen deze klasse van technieken, infrarood (IR) spectroscopie is ontstaan als een gevoelig analytisch instrument om de chemische eigenschappen van biologische systemen zoals eiwitten8ontrafelen. IR-methoden maken het kwantificeren van eiwit secundaire en quaterale structurele veranderingen mogelijk tijdens hun misvouwen en aggregatie. Bovendien, om verder te ontcijferen op microscopisch niveau de mechanistische details die betrokken zijn bij de complexe vrije energie landschappen van eiwitten tijdens hun aggregatie, is een belangrijke voorschot de ontwikkeling van chemische kinetiek-instrumenten om uit te breiden tot complexe zelf-assemblage trajecten waaronder amyloïde fibrillen formatie5,6,7,10,11,12. Echter, bulk spectroscopische methoden bieden alleen gemiddelde informatie over het heterogene ensemble van soorten die aanwezig zijn in de oplossing of die betrokken zijn bij specifieke microscopische stappen, waardoor het onderzoek naar de biofysische eigenschappen van individuele geaggregeerde soorten uitdagend op het niveau van de nanoschaal13,14.
In de laatste decennia zijn verschillende microscopie technieken met de mogelijkheid om te werken op schalen kleiner dan de diffractie-grens van licht ontstaan. Deze klasse van methoden omvat elektronenmicroscopie (EM) en Atoom kracht microscopie (AFM). Terwijl het scannen van elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) voorziet in tweedimensionale (2D) beelden van een specimen, is de AFM in de afgelopen decennia ontstaan als een krachtige en veelzijdige techniek om driedimensionale (3D) morfologieën te bestuderen, zoals evenals de Nano-eigenschappen van een monster met een sub-nanometer resolutie13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. de gedachte achter het bestuderen van eiwit aggregatie via de AFM is dat deze aanpak het onderzoek mogelijk maakt naar de morfologie van individuele soorten die aanwezig zijn in de oplossing13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Met name door de monitoring van het monster als functie van de tijd, maakt de AFM het mogelijk onderzoek te doen naar de evolutie van de morfologie van de soort in het monster, waardoor de paden van amyloïde vorming23kunnen worden gevolgd en visualiseren, 25,38,39,40,41,42. Bovendien maakt de AFM de kwantificering mogelijk van structurele parameters zoals transversale hoogten en lengtes van de afzonderlijke soorten in oplossing13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. de studie van één enkele biofysische eigenschap, zoals morfologie, is echter vaak niet voldoende bij het bestuderen van heterogene en complexe biologische systemen. Bij de beeldvormende methoden AFM, SEM of TEM wordt de chemische eigenschappen van heterogene aggregaten van amyloïde stoffen op nanoschaal niet gemakkelijk onthuld.
Een belangrijke vooruitgang voor de analyse van heterogene biologische monsters op deze schaal is onlangs gemaakt met de ontwikkeling en toepassing op het gebied van eiwit aggregatie van infrarood nano spectroscopie (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Deze innovatieve methode exploiteert de combinatie van de ruimtelijke resolutie van AFM (~ 1 − 10 nm) met de chemische analyse kracht van IR. De AFM-IR-techniek is gebaseerd op de meting van het fotothermisch geïnduceerde resonantie-effect dat wordt aangedreven door een IR-laser, en op de meting van de thermische expansie van het onderzochte monster door de AFM-tip. Het monster kan worden verlicht door de IR-laser direct vanaf de bovenkant of van de bodem in totale inwendige reflectie, net als bij conventionele infraroodspectroscopie24,42,52,53 . De IR-laser kan worden gepulseerd met typische frequenties in de volgorde van honderden kilohertz (1 − 1000 kHz) en afgestemd op een breed spectrum bereik, meestal tussen 1000 − 3300 cm-1. Hoewel de laserbron een oppervlakte van ~ 30 μm diameter bedekt, wordt de ruimtelijke resolutie van de AFM-IR-techniek nominaal bepaald door de diameter van de AFM, die de lokale thermische expansie van het systeem detecteert. AFM-IR is goed geschikt om biologische monsters te bestuderen omdat het IR-signaal evenredig is aan de dikte tot 1 − 1,5 μm, en de resulterende IR-spectra zijn in het algemeen in overeenstemming met de overeenkomstige FTIR-transmissie Spectra13,54 ,55. Om deze reden, gevestigde analysemethoden in spectroscopie kunnen gemakkelijk worden toegepast, zoals de studie van chemische verschuivingen, verandering van de band vorm en de-convolutie door tweede derivaten analyse52. In het algemeen, het combineren van de ruimtelijke resolutie van de AFM met de chemische herkennings kracht van IR-spectroscopie, biedt AFM-IR de gelijktijdige verwerving van een breed scala aan morfologische, mechanische en chemische eigenschappen van een monster op nanoschaal.
Hier illustreren we een protocol voor de karakterisering van het proces van eiwit aggregatie die de combinatie van in vitro fluorescentie testen, hoge resolutie AFM beeldvorming en nanoschaal AFM-IR exploiteert. Deze gecombineerde aanpak heeft al voortreffelijke resultaten opgeleverd bij het bestuderen van de chemische en structurele eigenschappen van individuele microdruppeltjes gevormd door eiwit aggregaten, in de studie van vloeistof-vloeibare eiwit fase scheiding, en in onderzoek naar de heterogeniteit en biofysische eigenschappen van individuele geaggregeerde soorten op de nanoschaal23,26,38,45,50,53, 56,57.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM-IR system</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>nanoIR 2 or 3</td>
			<td>Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminium Sealing Tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Adhesive Discs</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGG3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>415-101</td>
			<td>Platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica Disc 10mm V1</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Park NX10 AFM system</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platypus Ultra-Flat Gold Chips</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPP-NCHR-10 cantilevers</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>PPP-NCHR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LowBind Tubes, 2.0mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gold coated cantilevers</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>PR-EX-nIR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPM Specimen Discs 12mm</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy

Het fenomeen van eiwit misvouwen en aggregatie resulteert in de vorming van zeer heterogene eiwit aggregaten, die worden geassocieerd met neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson. In het bijzonder laag moleculair gewicht aggregaten, amyloïde oligomeren, is aangetoond dat het bezitten van generieke cytotoxische eigenschappen en zijn betrokken als neurotoxines in vele vormen van dementie. We illustreren het gebruik van methoden op basis van atoom kracht microscopie (AFM) om de uitdagende taak van het karakteriseren van de morfologische, structurele en chemische eigenschappen van deze aggregaten te verhelpen, die moeilijk te bestuderen zijn met conventionele structurele methoden of bulk Biofysische methoden vanwege hun heterogeniteit en voorbijgaande aard. Scanning probe microscopie benaderingen zijn nu in staat om te onderzoeken van de morfologie van amyloïde aggregaten met sub-nanometer resolutie. We laten hier zien dat infrarood (IR) nano spectroscopie (AFM-IR), die tegelijkertijd de hoge resolutie van de AFM en de chemische herkennings kracht van IR-spectroscopie exploiteert, verder kan gaan en de karakterisering van de structurele eigenschappen van individuele eiwit aggregaten, en bieden dus inzicht in de aggregatie mechanismen. Aangezien de benadering die we beschrijven ook kan worden toegepast op het onderzoek van de interacties van eiwit assemblages met kleine moleculen en antilichamen, kan het fundamentele informatie leveren om nieuwe therapeutische verbindingen te ontwikkelen voor het diagnosticeren of behandelen van neurodegeneratieve aandoeningen.

Een representatieve tijdsduur van Aβ 42 aggregatie, zoals gemeten door de fluorescentie test ThT, wordt weergegeven in Figuur 1. Het aggregatieproces wordt meestal gekenmerkt door een sigmoïdale curve, waarbij een lag-fase in eerste instantie wordt waargenomen, en wordt gevolgd door een steile groeifase, voordat de curve een plateau bereikt wanneer een evenwichtstoestand wordt bereikt6,7 , 58. het...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

We beschrijven de toepassing van infrarood nano spectroscopie en hoge-resolutie atomaire kracht microscopie om het proces van eiwit zelf montage te visualiseren in oligomere aggregaten en amyloïde fibrils, die nauw verbonden is met het ontstaan en de ontwikkeling van een breed scala aan humane neurodegeneratieve aandoeningen.

Karakteriseren van individuele eiwit aggregaten door infrarood nano spectroscopie en Atoom kracht microscopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Methoden op basis van atomaire kracht microscopie maken het mogelijk om biomoleculaire processen op nanoschaal te karakteriseren met morfologische chemische of structurele resolutie, eindelijk het openen van een nieuwe voorste venster van observatie op de biologie. Methoden van één molecuul maken indringende zeer heterogene systemen mogelijk, een kenmerk dat bijzonder relevant is voor het begrijpen van eiwitaggregatie. Door het combineren van enkele moleculen met rugbenaderingen, kunnen we fundamentele informatie verkrijgen over het gedrag van eiwitten, hun banden met menselijke ziekte en het ontwerpen van farmacologische interventies die succesvol kunnen zijn.Bovendien kan deze methode met succes worden toegepast om de chemische en structurele eigenschappen van biomaterialen voor de levering van geneesmiddelen, toepassingen en andere biotechnologische doeleinden te bestuderen. Het kan in eerste instantie een uitdaging zijn om de juiste AFM-parameters voor hoge resolutie in te stellen en het is eenvoudig om uw AFM in te stellen tijdens het meten van uw fibrillar aggregaten. Schakel 30 minuten voor de afm-beeldvorming het AFM-systeem in en klik op instellen en sonde.Klik in het venster voor het wijzigen van de sonde naast de focusfase van Z. Schakel de AFM-balkschakelaar uit als deze is ingeschakeld en ontgrendel de zwaluwstaartsloten. Koppel het hoofd los van het systeem en klik in het venster voor het wijzigen van de sonde op de volgende.Monteer de AFM cantilever op de sondehouder. Sluit het hoofd aan op het systeem en vergrendel de zwaluwstaartsloten. Schakel de AFM-laserstraalschakelaar in en klik in het venster voor sondewisselaar op volgende.Klik in het pop-upvenster op nee als het cantilever-type niet is gewijzigd en pas de optische uitlijnknoppen aan om de cantilever te vinden. Pas de focus aan op de cantilever en klik vervolgens. Klik in het pop-upvenster op ja als de focus op de cantilever ligt.Gebruik de detectie laserstraalknoppen om de laserstraal aan het einde van de cantilever te plaatsen. Gebruik de afgebogen laserstraalknoppen om het totale signaal gemeten door de vier kwadrantfotodiode te maximaliseren tot ten minste één volt. Klik in het venster voor het wijzigen van de sonde op volgende en sluit.Na 15 minuten wachten op de cantilever om thermische stabiliteit te bereiken, pas indien nodig de positie van de afgebogen laserstraal aan op de positiegevoelige fotodode. Klik op NCM sweep, selecteer de gewenste amplitude van oscillatie, klik op fase gebruiken en klik op automatisch. Stem de cantilever dicht bij het maximum van zijn eerste vrije resonantie van oscillatie af op ongeveer 300 kilohertz voor een cantilever met een veerconstante van 40 newton per meter.Plaats het monster op de monsterhouder. Klik op scangebied en stel de resolutie in op 256 bij 256 en 1024 bij 1024 pixels en stel vervolgens de scangrootte en het pixelnummer in. Stel de scansnelheid in op 0,3 op één hertz voor een scangebied van één bij vijf bij vijf micrometer in het kwadraat.Richt de optische weergave op het monster en klik op de aanpak om het monsteroppervlak te benaderen. Klik vervolgens 100 micrometer optillen om de AFM-tip 100 micrometer boven het oppervlak van het monster te verhogen en klik op uitzetten op het optische beeld van het monster. Klik op de focusfasebalk om de weergave op het oppervlak van het monster te richten en gebruik de pijlen om in het gebied van het interessant voorbeeld te bewegen.Klik op de aanpak om het oppervlak te betrekken en klik op de lijn scan om te controleren of de tip is na het oppervlak goed. Pas het instelpunt zo nodig aan. Klik vervolgens op scannen om te beginnen met het beeldvorming van het monsteroppervlak, met behoud van een constant regime van faseverandering dat niet hoger is dan delta 20 tijdens de beeldvorming om een grote beeldvormingskracht te voorkomen en om de consistentie tussen onafhankelijke monsters te behouden.Voor IR nanospectroscopie beeldvorming, 30 tot 60 minuten voor de analyse, schakelt u het AFM IR-systeem en de IR-laser in. Open de ingebouwde software om het instrument te bedienen en klik op bestand en nieuw om een nieuw nano-IR-bestand te openen. Klik op initialiseren om het AFM IR-systeem te starten en open de instrumentenhoes.Monteer een siliconen goud gecoate sonde met een nominale straal van 30 nanometer en een veerconstante van 0,2 newton per meter op het AFM IR-systeem om het monster in contactmodus te meten. Klik op laden in de sectie AFM-sonde en vervolgens. Gebruik de focus op sondepijlen om de camera op de cantilever te richten en gebruik de punt om het vizier te kruisen om het vizier aan het einde van de cantilever te plaatsen.Draai de knoppen die de positie van de detectielaser regelen om de laser aan het einde van de cantilever te plaatsen. Draai de laserknoppen om de som te detecteren en te maximaliseren die door de vier kwadrantfotodode wordt gemeten tot een waarde groter dan drie volt. Draai de afbuigingknop om de afbuiging van de cantilever aan te passen op min één volt en klik vervolgens.Sluit vervolgens de cover van het instrument. Gebruik de focus op sondepijlen om de camera op het monster en de tip te richten om pijlen te kruisen om in het gebied van belang van het monster te bewegen. Klik op volgende en engageer.Selecteer in het microscoopvenster de hoogte voor morfologie, amplitude twee voor de IR-absorptie- en PLL-frequentie om de tip naar monstercontactresonantie in kaart te brengen. Stel in de sectie AFM-scan de parameters in zoals aangetoond voor de AFM-beeldvorming en klik op scan om een morfologiekaart te verkrijgen. Wanneer de morfologietoewijzing is voltooid, klikt u in het microscoopvenster op de hoogtekaart om de sonde op de bovenkant van één aggregaat te plaatsen.Klik in de nano-IR-sectie op start-IR om het monster te verlichten met de IR-laser. Als u de infraroodlaser op de cantilever wilt richten, klikt u op optimaliseren en voert u 1655 centimeter in voor het golfnummer. Klik op toevoegen en scannen om de IR-laserpositie te bepalen en klik op update en oke om de positie uit te lijnen met de cantilever.Voer in de algemene sectie een golfnummer in waarvoor een hoge absorptie in het relatieve veld wordt verwacht en schakel de optie filter van de bandpas uit. Klik op start IR en controleer de meterstand en de FFT van de cantileverrespons. Verplaats in het FFT-venster de groene cursor om de resonantiefrequentie van de cantilever te lezen.Een typische waarde van FFT van de resonantie van de cantilevers is rond 200 kilohertz. Voer de gegenereerde resonantiefrequentiewaarde in de algemene sectie in het frequentiecentrumveld in en gebruik een frequentievenster van 50 kilohertz. Klik op laserpuls tune venster om de resonantie verbeterde modus te selecteren en stel een hartslag van 222 kilohertz, een tune bereik van 50 kilohertz en een laser duty cyclus van 5%Klik te verwerven om de hartslag van de laser te vegen.Gebruik de cursor om de laserpuls af te stemmen op de frequentie van de mechanische respons van de thermische uitzetting van het monster dat het IR-licht absorbeert. Selecteer vervolgens fase vergrendelde lus om de contactresonantie tussen het monster en de tip te controleren en klik op nul. Voor andere chemische eigenschappen op nanoschaal volgt u de contactresonantie tijdens de spectra-verwerving om ervoor te zorgen dat het monsterspectrum niet wordt beïnvloed door oververhitting en verzachting.Selecteer inschakelen om het monster bij te houden om contactresonantie tip en selecteer een integrale versterking van 0,5 en een proportionele versterking van 10 en klik vervolgens op OK. Klik in het venster optimaliseren op de golflengte en scan om de IR-laser te lokaliseren voor ten minste drie golfnummers die overeenkomen met grote absorptiebanden van het monster en voor ten minste één golfnummer voor elke chip van de laser. Klik op gereedschappen, IR-achtergrondkalibratie en nieuw en stel de golfnummers in op 1200 tot 1800 centimeter. Stel de achtergronden op gemiddeld op een, de taak cyclus van 5%en de veegsnelheid op 100 centimeter in het kwadraat.Klik op acquire om de IR-laserachtergrond te meten voor normalisatie van de gemeten nanoschaal gelokaliseerde spectra, sla het bestand op en sluit het venster. Selecteer in de IR-spectra-instellingen een IR-spectrumresolutie tussen één en vier centimeter en een aantal cogemiddelden van ten minste 64 keer. Klik vervolgens op acquire om een nanoschaal gelokaliseerd IR-spectrum in het eiwitbereik te meten.Als u een nanoschaal opgelost chemische kaart te verwerven, selecteert u 1655 centimeter en IR-beeldvorming en klik op scannen in de AFM-scanvenster. Wanneer de toewijzing is voltooid, slaat u de metingen op. Gebruik vervolgens de ingebouwde AFM-beeldverwerkingssoftware om de verworven kaarten van morfologie, contactresonantie en chemie en gelokaliseerde spectra op nanoschaal te analyseren.Het is een cruciale stap om een zeer zuivere monomeeroplossing te verkrijgen, omdat de aanwezigheid van geaggregeerde soorten kan resulteren in een slechte reproduceerbaarheid van kinetiek en artefacten in uw metingen kan introduceren. Een fundamentele factor voor het succesvol bestuderen van biologische monsters met een hoge heterogeniteit is de juiste positie van vaste substraten. Microfluïde spray afzetting kan worden benut in plaats van handmatige een om de monsterarchitectuur en heterogeniteit te behouden.Deze methoden effenen de weg voor het ontrafelen van de chemische structuur en eigenschappen van individuele biomoleculen en hun interacties in fysiologische en inheemse vloeibare omgeving.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Eiwit Film infrarood elektrochemie voor studie van H2 oxidatie aangetoond door een Hydrogenase [connectoren]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-Polymerase activiteit Assay gebruikend nabij-infrarood fluorescerende gelabelde DNA gevisualiseerd door Acrylamide Gel elektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...