Name: characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-12T15:00:00
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Die Autoren danken der Schweizerischen Nationalstiftung für Wissenschaft (SNF) für die finanzielle Unterstützung (Fördernummer P2ELP2_162116 und P300P2_171219), dem Darwin College, Erasmus+ Programm für die finanzielle Unterstützung (Fördernummer 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) und Forschung, die zu diesen Ergebnissen führt, wurde vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (RP7/2007-2013) über das ERC-Stipendium PhysProt (Vereinbarung nr. 337969), die Newman Foundation (T.P.J.K.) und The The Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V. und T.P.J.K.).

1. Aggregations-Assays auf Fluoreszenzplattenlesern
HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beispiel dafür, wie die Aggregation von Proteinen oder Peptiden durch chemische Kinetik untersucht werden kann. Insbesondere beschreibt es ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung der Aggregation des Peptids A-42, das am Beginn und fortschreitender Alzheimer-Krankheit beteiligt ist58,59. Ein ähnliches Protokoll kann angepasst und ange...

Der erste kritische Schritt in diesem Protokoll ist die Herstellung monomerer Proteine, wie im Fall der in den Schritten 1.1 und 1.2 beschriebenen Lösung A-42. Es ist wichtig, den Aggregationsprozess aus einer hochreinen, monomeren Lösung zu initiieren, da das Vorhandensein von oligomeren oder aggregierten Arten zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der Aggregationskinetik führen kann58, und Artefakte im AFM induzieren kann. (z. B. fibrillare Arten werden in den Anfangsstadien der Aggregation ...

Mehr als 40 Millionen Menschen weltweit sind derzeit von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer (AD)1 und Parkinson (PD)2 Krankheiten betroffen. Allgemeiner gesagt, sind mehr als fünfzig Pathologien auf molekularer Ebene mit Proteinfehlfaltung und -aggregation assoziiert, ein Prozess, der zur Proliferation von unlöslichen fibrillaren Proteinaggregaten führt, die als Amyloidablagerungen3 bekannt sind. 4. Die molekularen Ursprünge der Neurodegeneration und ihre Verbindungen mit Proteinkonformationsveränderungen von Proteinen, die zur Amyloidbildung führen, bleiben jedoch weitgehend unklar, was zum großen Teil auf das hohe Maß an Heterogenität, transikulären Natur und nanoskalige Abmessungen der pathologischen Aggregate4,5.
Sehr erfolgreiche Untersuchungen von Proteinstrukturen in den letzten Jahrzehnten basierten weitgehend auf dem Einsatz von Massenmethoden, einschließlich Röntgenkristallographie, Kryo-Elektronenmikroskopie und Kernspinresonanzspektroskopie5, 6 , 7 , 8 , 9. Innerhalb dieser Klasse von Techniken hat sich die Infrarotspektroskopie (IR) als ein sensibles Analysewerkzeug herausgebildet, um die chemischen Eigenschaften biologischer Systeme wie Proteine8zu entwirren. IR-Methoden ermöglichen die Quantifizierung von sekundären und quartären Strukturveränderungen des Proteins während ihrer Fehlfaltung und Aggregation. Um auf mikroskopischer Ebene die mechanistischen Details, die in den komplexen freien Energielandschaften von Proteinen während ihrer Aggregation involviert sind, weiter zu entschlüsseln, war ein großer Fortschritt die Entwicklung chemischer Kinetik-Werkzeuge, die sich auf komplexe Selbstmontagewege einschließlich AmyloidfibrillenBildung5,6,7,10,11,12. Massenspektroskopische Methoden liefern jedoch nur durchschnittliche Informationen über das heterogene Artenensemble, das in Lösung oder in bestimmten mikroskopischen Schritten vorhanden ist, wodurch die Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften einzelner aggregierte Arten, die auf der Nanoskala anspruchsvoll sind13,14.
In den letzten Jahrzehnten sind mehrere Mikroskopietechniken mit der Fähigkeit entstanden, auf Skalen zu arbeiten, die kleiner als die Beugungsgrenze des Lichts sind. Diese Methodenklasse umfasst Elektronenmikroskopie (EM) und Atomkraftmikroskopie (AFM). Während Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zweidimensionale (2D) Bilder einer Probe liefern, hat sich AFM in den letzten Jahrzehnten als eine leistungsfähige und vielseitige Technik zur Untersuchung dreidimensionaler (3D) Morphologien sowie die nanomechanischen Eigenschaften einer Probe mit Sub-Nanometer-Auflösung13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. Der Grund für die Untersuchung der Proteinaggregation über AFM ist, dass dieser Ansatz die Untersuchung der Morphologie einzelner Arten in Lösung13,14,16ermöglicht. 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Insbesondere durch die Überwachung der Probe als Funktion der Zeit, AFM ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung der Morphologie der Art innerhalb der Probe, die es ermöglicht, zu folgen und visualisieren die Wege der Amyloidbildung23, 25,38,39,40,41,42. Darüber hinaus ermöglicht AFM die Quantifizierung von Strukturparametern wie Querschnittshöhen und -längen der einzelnen Arten in Lösung13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. Die Untersuchung einer einzigen biophysikalischen Eigenschaft, wie z. B. der Morphologie, reicht jedoch bei der Untersuchung heterogener und komplexer biologischer Systeme oft nicht aus. AFM-, SEM- oder TEM-Bildgebungsverfahren allein zeigen nicht ohne weiteres die chemischen Eigenschaften heterogener Arten von Amyloid-Aggregaten im Nanomaßstab.
Ein großer Fortschritt für die Analyse heterogener biologischer Proben in diesem Maßstab wurde in jüngster Zeit mit der Entwicklung und Anwendung auf dem Gebiet der Proteinaggregation der Infrarot-Nanospektroskopie (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Diese innovative Methode nutzt die Kombination der räumlichen Auflösung von AFM (1,10 nm) mit der chemischen Analyseleistung von IR. Die AFM-IR-Technik basiert auf der Messung des photothermischen induzierten Resonanzeffekts, der von einem IR-Laser angetrieben wird, und auf der Messung der thermischen Ausdehnung der Probe, die von der AFM-Spitze untersucht wird. Die Probe kann mit dem IR-Laser direkt von oben oder von unten in der gesamten inneren Reflexion beleuchtet werden, ähnlich wie bei der herkömmlichen Infrarotspektroskopie24,42,52,53 . Der IR-Laser kann mit typischen Frequenzen in der Größenordnung von Hunderten von Kilohertz (1x1000 kHz) gepulst und über einen weiten Spektralbereich abgestimmt werden, typischerweise zwischen 1000 und 3300 cm-1. Obwohl die Laserquelle eine Fläche von 30 m Durchmesser abdeckt, wird die räumliche Auflösung der AFM-IR-Technik nominell durch den AFM-Spitzendurchmesser bestimmt, der die lokale Wärmeausdehnung des Systems erkennt. AFM-IR eignet sich gut für die Untersuchung biologischer Proben, da das IR-Signal proportional zu ihrer Dicke bis zu 1,5 m ist und die resultierenden IR-Spektren im Allgemeinen mit den entsprechenden FTIR-Übertragungsspektren13,54 übereinstimmen. ,55. Aus diesem Grund können etablierte Analysemethoden in der Spektroskopie problemlos angewendet werden, wie z. B. die Untersuchung chemischer Verschiebungen, Bandformänderung und De-Konvolution durch zweite Derivateanalyse52. Insgesamt ermöglicht AFM-IR durch die Kombination der räumlichen Auflösung von AFM mit der chemischen Erkennungskraft der IR-Spektroskopie die gleichzeitige Erfassung einer vielzahl morphologischer, mechanischer und chemischer Eigenschaften einer Probe im Nanomaßstab.
Hier illustrieren wir ein Protokoll zur Charakterisierung des Prozesses der Proteinaggregation, das die Kombination von In-vitro-Fluoreszenz-Assays, hochauflösender AFM-Bildgebung und nanoskaliger AFM-IR nutzt. Dieser kombinierte Ansatz hat sich bereits durch detaillierte Ergebnisse bei der Untersuchung der chemischen und strukturellen Eigenschaften einzelner Mikrotröpfchen, die durch Proteinaggregate gebildet werden, bei der Untersuchung der Flüssigkeits-Flüssig-Proteinphasentrennung und in Untersuchung der Heterogenität und der biophysikalischen Eigenschaften einzelner aggregierter Arten im Nanomaßstab23,26,38,45,50,53, 56,57.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM-IR system</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>nanoIR 2 or 3</td>
			<td>Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminium Sealing Tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Adhesive Discs</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGG3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>415-101</td>
			<td>Platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica Disc 10mm V1</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Park NX10 AFM system</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platypus Ultra-Flat Gold Chips</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPP-NCHR-10 cantilevers</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>PPP-NCHR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LowBind Tubes, 2.0mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gold coated cantilevers</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>PR-EX-nIR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPM Specimen Discs 12mm</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy

Das Phänomen der Proteinfehlfaltung und -aggregation führt zur Bildung hochheterogener Proteinaggregate, die mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson in Verbindung gebracht werden. Insbesondere niedermolekulare Aggregate, Amyloid-Oligomere, haben nachweislich generische zytotoxische Eigenschaften und sind als Neurotoxine in vielen Formen von Demenz involviert. Wir veranschaulichen den Einsatz von Methoden auf Basis der Atomkraftmikroskopie (AFM), um die anspruchsvolle Aufgabe der Charakterisierung der morphologischen, strukturellen und chemischen Eigenschaften dieser Aggregate anzugehen, die mit konventionellen strukturellen biophysikalische Methoden aufgrund ihrer Heterogenität und Vergänglichkeit. Scan-Sondenmikroskopie-Ansätze sind nun in der Lage, die Morphologie von Amyloid-Aggregaten mit Sub-Nanometer-Auflösung zu untersuchen. Wir zeigen hier, dass die Infrarot-Nanospektroskopie (AFM-IR), die gleichzeitig die hohe Auflösung von AFM und die chemische Erkennungskraft der IR-Spektroskopie ausnutzt, weiter gehen und die Charakterisierung der strukturellen Eigenschaften einzelner Proteinaggregate und bieten so Einblicke in die Aggregationsmechanismen. Da der von uns beschriebene Ansatz auch auf die Untersuchungen der Wechselwirkungen von Proteinassemblys mit kleinen Molekülen und Antikörpern angewendet werden kann, kann er grundlegende Informationen liefern, um neue therapeutische Verbindungen zur Diagnose oder Behandlung zu entwickeln. neurodegenerative Störungen.

Abbildung 1zeigt einen repräsentativen Zeitverlauf der A-42-Aggregation, gemessen anhand des ThT-Fluoreszenz-Assays. Der Aggregationsprozess ist häufig durch eine sigmoidale Kurve gekennzeichnet, bei der zunächst eine Verzögerungsphase beobachtet wird, gefolgt von einer steilen Wachstumsphase, bevor die Kurve ein Plateau erreicht, wenn ein Gleichgewichts-Stabilitätszustand erreicht wird6,7 , 58...

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Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Wir beschreiben die Anwendung von Infrarot-Nanospektroskopie und hochauflösender Atomkraftmikroskopie, um den Prozess der Protein-Selbstmontage in oligomere Aggregate und Amyloidfibrillen zu visualisieren, die eng mit dem Beginn und der Entwicklung verbunden sind. einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen.

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Methoden auf Basis der Atomkraftmikroskopie ermöglichen es, biomolekulare Prozesse im Nanomaßstab mit morphologischer chemischer oder struktureller Auflösung zu charakterisieren und schließlich ein neues Frontfenster zur Beobachtung der Biologie zu öffnen. Einzelmolekülmethoden ermöglichen die Untersuchung hochheterogener Systeme, ein Merkmal, das für das Verständnis der Proteinaggregation besonders relevant ist. Durch die Kombination einzelner Moleküle mit Rückenansätzen können wir grundlegende Informationen über das Verhalten von Proteinen, ihre Verbindungen mit menschlichen Krankheiten und das Design pharmakologischer Interventionen erhalten, die erfolgreich sein können.Darüber hinaus kann diese Methode erfolgreich angewendet werden, um die chemischen und strukturellen Eigenschaften von Biomaterialien für die Arzneimittelabgabe, Anwendungen und andere biotechnologische Zwecke zu untersuchen. Es kann zunächst eine Herausforderung sein, die richtigen AFM-Parameter für eine hohe Auflösung einzustellen, und es ist einfach, Ihren AFM einzurichten, während Sie Ihre Fibrillaraggregate messen. 30 Minuten vor der AFM-Bildgebung schalten Sie das AFM-System ein und klicken Sie auf Einrichten und Sonden.Klicken Sie im Fenster "Prüfpunktwechsel" auf next, um die Z-Fokusstufe vorzubereiten. Schalten Sie den AFM-Strahlschalter aus, wenn er eingeschaltet ist, und entsperren Sie die Schwalbenschwanzschlösser. Trennen Sie den Kopf vom System, und klicken Sie im Fenster zum Sondenwechsel auf Weiter.Montieren Sie den AFM-Ausleger am Sondenhalter. Schließen Sie den Kopf an das System an und verriegeln Sie die Schwalbenschwanzschlösser. Schalten Sie den AFM-Laserstrahlschalter ein und klicken Sie im Sondenwechselfenster auf Weiter.Klicken Sie im Pop-up-Fenster auf "Nein", wenn sich der Freischwingertyp nicht geändert hat, und passen Sie die optischen Ausrichtungsknöpfe an, um den Ausleger zu finden. Passen Sie den Fokus auf den Ausleger an, und klicken Sie auf weiter. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Ja, wenn der Fokus auf dem Ausleger liegt.Verwenden Sie die Erkennungslaserstrahlknöpfe, um den Laserstrahl am Ende des Auslegers zu positionieren. Verwenden Sie die umgelenkten Laserstrahlknöpfe, um das Gesamtsignal der vier Quadranten-Fotodiode auf mindestens einen Volt zu maximieren. Klicken Sie im Fenster "Prüfpunktändern" auf Weiter und schließen Sie.Nachdem Sie 15 Minuten gewartet haben, bis der Ausleger thermische Stabilität erreicht hat, stellen Sie bei Bedarf die Position des abgelenkten Laserstrahls auf der positionsempfindlichen Fotodiode nach. Klicken Sie auf NCM Sweep, wählen Sie die gewünschte Amplitude der Schwingung, klicken Sie auf Phase verwenden und klicken Sie auf Auto. Stimmen Sie den Ausleger nahe an das Maximum seiner ersten freien Schwingungsresonanz auf ca. 300 Kilohertz für einen Ausleger mit einer Federkonstante von 40 Newton pro Meter.Legen Sie die Probe auf den Probenhalter. Klicken Sie auf Scanbereich, und legen Sie die Auflösung auf 256 x 256 und 1024 x 1024 Pixel fest, und legen Sie dann die Scangröße und die Pixelzahl fest. Legen Sie die Scanrate für eine Scanfläche von einem mal eins bis fünf mal fünf Mikrometer quadratisch auf 0,3 auf einen Hertz fest.Konzentrieren Sie die optische Ansicht auf die Probe, und klicken Sie auf den Ansatz, um sich der Probenoberfläche zu nähern. Klicken Sie als Nächstes auf 100 Mikrometer, um die AFM-Spitze 100 Mikrometer über die Oberfläche der Probe zu heben, und klicken Sie auf erweitern auf das optische Bild der Probe. Klicken Sie auf die Fokusstufenleiste, um die Ansicht auf die Oberfläche des Beispiels zu fokussieren, und verwenden Sie die Pfeile, um sich im Bereich der betreffenden Probe zu bewegen.Klicken Sie auf Ansatz, um die Oberfläche einzubinden, und klicken Sie auf Linienscan, um zu überprüfen, ob die Spitze der Oberfläche gut folgt. Passen Sie den Sollwert nach Bedarf an. Klicken Sie dann auf Scannen, um mit der Bildgebung der Probenoberfläche zu beginnen, wobei ein konstantes Regime von Phasenänderungen beibehalten wird, das Delta 20 während der Bildgebung nicht überschreitet, um eine große Bildkraft zu vermeiden und die Konsistenz zwischen unabhängigen Proben aufrechtzuerhalten.Für die IR-Nanospektroskopie-Bildgebung, 30 bis 60 Minuten vor der Analyse, schalten Sie das AFM IR-System und den IR-Laser ein. Öffnen Sie die eingebaute Software, um das Instrument zu steuern und klicken Sie auf Datei und neu, um eine neue Nano-IR-Datei zu öffnen. Klicken Sie auf Initialisieren, um das AFM IR-System zu starten und die Instrumentenabdeckung zu öffnen.Montieren Sie eine silikongoldbeschichtete Sonde mit einem Nennradius von 30 Nanometern und einer Federkonstante von 0,2 Newton pro Meter auf das AFM IR-System, um die Probe im Kontaktmodus zu messen. Klicken Sie im AFM-Prüfpunkt und als nächstes auf Laden. Verwenden Sie den Fokus auf Sondenpfeile, um die Kamera auf den Ausleger zu fokussieren, und verwenden Sie die Spitze, um das Fadenkreuz am Ende des Auslegers zu platzieren.Drehen Sie die Knöpfe, die die Position des Erkennungslasers steuern, um den Laser am Ende des Auslegers zu positionieren. Drehen Sie die Laserknöpfe, um die von der vier Quadranten-Fotodiode gemessene Summe auf einen Wert größer als drei Volt zu erkennen und zu maximieren. Drehen Sie den Umlenkknopf, um die Auslegerablenkung auf minus einen Volt einzustellen, und klicken Sie auf weiter.Schließen Sie dann die Abdeckung des Instruments. Verwenden Sie den Fokus auf Dieonpfeile, um die Kamera auf das Beispiel zu fokussieren, und kippen Sie die Pfeile des Fadenkreuzs, um sich im Bereich des Interesses der Probe zu bewegen. Klicken Sie als nächstes und engagieren Sie sich.Wählen Sie im Mikroskopfenster die Höhe für die Morphologie, die Amplitude zwei für die IR-Absorption und die PLL-Frequenz aus, um die Spitze für die Probenresonanz abzubilden. Legen Sie im AFM-Scan-Bereich die Parameter fest, wie für die AFM-Bildgebung gezeigt, und klicken Sie auf Scannen, um eine Morphologiekarte zu erhalten. Wenn die Morphologie-Zuordnung abgeschlossen ist, klicken Sie im Mikroskopfenster auf die Höhenkarte, um die Sonde oben auf einem Aggregat zu positionieren.Klicken Sie im Bereich Nano IR auf IR starten, um die Probe mit dem IR-Laser zu beleuchten. Um den Infrarotlaser auf den Ausleger zu fokussieren, klicken Sie auf Optimieren und geben Sie 1655 Zentimeter für die Wellenzahl ein. Klicken Sie auf Hinzufügen und Scannen, um die IR-Laserposition zu bestimmen, und klicken Sie auf Aktualisieren und okay, um seine Position am Ausleger auszurichten.Geben Sie im allgemeinen Abschnitt eine Wellenzahl ein, für die eine hohe Absorption im relativen Feld erwartet wird, und deaktivieren Sie die Bandpassfilteroption. Klicken Sie auf IR starten und überprüfen Sie dann den Zählerstand und die FFT der Auslegerantwort. Bewegen Sie im FFT-Fenster den grünen Cursor, um die Resonanzfrequenz des Auslegers zu lesen.Ein typischer Wert der FFT der Resonanz der Ausleger beträgt rund 200 Kilohertz. Geben Sie den erzeugten Resonanzfrequenzwert im allgemeinen Abschnitt im Frequenzbereichsfeld ein und verwenden Sie ein Frequenzfenster von 50 Kilohertz. Klicken Sie auf das Fenster laserpulstune, um den Resonanz-verbesserten Modus auszuwählen und eine Pulsrate von 222 Kilohertz, einen Melodiebereich von 50 Kilohertz und einen Laser-Duty-Zyklus von 5%Klicken Sie erfassen, um die Pulsfrequenz des Lasers zu fegen.Verwenden Sie den Cursor, um den Laserpuls auf die Frequenz der mechanischen Reaktion der thermischen Ausdehnung der Probe einzustellen, die das IR-Licht absorbiert. Wählen Sie dann eine Phasenschleife aus, um die Kontaktresonanz zwischen der Probe und der Spitze zu überwachen, und klicken Sie auf Null. Verfolgen Sie bei anderen chemischen Eigenschaften im Nanomaßstab die Kontaktresonanz während der Spektrenerfassung, um sicherzustellen, dass das Probenspektrum nicht durch Überhitzung und Erweichung beeinflusst wird.Wählen Sie aktivieren, um die Probe zu verfolgen, um die Kontaktresonanz zu kippen, und wählen Sie eine integrale Verstärkung von 0,5 und eine proportionale Verstärkung von 10 aus, und klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie im Optimierungsfenster auf die Wellenlänge und scannen Sie, um den IR-Laser für mindestens drei Wellenzahlen zu lokalisieren, die den großen Absorptionsbändern der Probe entsprechen, und für mindestens eine Wellenzahl für jeden Chip des Lasers. Klicken Sie auf Werkzeuge, IR-Hintergrundkalibrierung und neu, und stellen Sie die Wellenzahlen auf 1200 bis 1800 Zentimeter ein. Legen Sie die Hintergründe auf durchschnittlich auf eins, den Tastzyklus von 5 % und die Sweep-Geschwindigkeit auf 100 Zentimeter im Quadrat fest.Klicken Sie auf Acquire, um den IR-Laserhintergrund für die Normalisierung der gemessenen nanoskaligen lokalisierten Spektren zu messen, die Datei zu speichern und das Fenster zu schließen. Wählen Sie in den IR-Spektreneinstellungen eine IR-Spektrumauflösung zwischen einem und vier Zentimetern und eine Anzahl von Co-Durchschnitten von mindestens 64 Mal aus. Klicken Sie dann auf Acquire, um ein nanoskaliges lokalisiertes IR-Spektrum im Proteinbereich zu messen.Um eine im Nanomaßstab aufgelöste chemische Karte zu erhalten, wählen Sie 1655 Zentimeter und IR-Bildgebung aus und klicken Sie im AFM-Scanfenster auf Scannen. Wenn die Zuordnung abgeschlossen ist, speichern Sie die Messungen. Verwenden Sie dann die eingebaute AFM-Bildverarbeitungssoftware, um die erworbenen Karten der Morphologie, Kontaktresonanz und Chemie sowie lokalisierte Spektren im Nanomaßstab zu analysieren.Es ist ein kritischer Schritt, um eine hochreine monomere Lösung zu erhalten, da das Vorhandensein von aggregierten Arten zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der Kinetik führen und Artefakte in Ihre Messungen einführen kann. Ein wesentlicher Faktor für die erfolgreiche Untersuchung biologischer Proben mit hoher Heterogenität ist die korrekte Position fester Substrate. Die mikrofluidische Sprühabscheidung kann anstelle einer manuellen verwendet werden, um die Probenarchitektur und Heterogenität zu erhalten.Diese Methoden ebnen den Weg für die Entschlüsselung der chemischen Struktur und Eigenschaften einzelner Biomoleküle und ihrer Wechselwirkungen in physiologischer und nativer flüssiger Umgebung.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Forschung

Biochemie

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrarot-Elektrochemie für Studie der H2 Oxidation durch ein [NiFe] Hydrogenase unter Beweis gestellt

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...