Name: characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy at JoVE.com

המחברים תודה הקרן הלאומית השוויצרית למדע (snf) עבור התמיכה הפיננסית (גרנט מספר P2ELP2_162116 ו P300P2_171219), מכללת דרווין, ארסמוס + תוכנית לתמיכה הפיננסית (גרנט מספר 2018-1-LT01-KA103-046719 -15400-P3) וה מחקר המוביל לתוצאות אלה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית תחת תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013) באמצעות מענק erc החוזה (הסכם מספר 337969), קרן ניומן (T.P.J.K.) וה מרכז קיימברידג ' למחלות מתקפלות (M.V., ו-T.P.J.K.).

1. הצבירה מציינת על קוראי לוחית הזריחה
הערה: הפרוטוקול המתואר כאן הוא דוגמה לאופן הלימוד של צבירת חלבונים או פפטיד באמצעות קינטיקה כימית. בפרט, הוא מתאר פרוטוקול ממוטב לחקור את הצבירה של aβ 42 פפטיד, אשר מעורב בתחילתה והתקדמות של מחלת האלצהיימר58,59</su...

הצעד הקריטי הראשון בפרוטוקול זה הוא הכנת חלבונים monomeric, כגון במקרה של Aβ 42 פתרון המתואר בשלבים 1.1 ו 1.2. זה חיוני כדי ליזום את תהליך הצבירה מתוך טהור מאוד, הפתרון monomeric, כמו נוכחות של oligomeric או מינים צבורים עלול לגרום היהייה ירודה של מצבור הקינטיקה58, ולגרום לחפצי אמנות afm מדידות (למש?...

מעל 40,000,000 אנשים ברחבי העולם מושפעים כיום על ידי הפרעות ניווניות, כגון אלצהיימר (AD)1 ו פרקינסון (PD)2 מחלות. באופן כללי יותר, יותר מ-50 הפתווגיות משויכים ברמה המולקולרית עם misfolding חלבון ומצבור, תהליך המוביל התפשטות של אגרגטים מסיסים חלבון fibrillar, המכונה פיקדונות עמילואיד3, 4. המקורות המולקולריים של ניוון שולי והקשרים שלה עם חלבון התאמות שינויים של חלבונים המובילים היווצרות עמילואיד, עם זאת, נשאר ברור, בחלק גדול בגלל הרמה הגבוהה של טרוגניות, הטבע ארעי ו ננו-סקאלה מידות האגרגטים הפתולוגיים4,5.
חקירות מוצלחות ביותר של מבני חלבונים בעשורים האחרונים התבססו באופן נרחב על שימוש בשיטות בצובר, כולל קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן, מיקרוסקופ הקפאה אלקטרוני וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9. בתוך מחלקה זו של טכניקות, אינפרא אדום (IR) ספקטרוסקופיית התפתחה ככלי אנליטי רגיש כדי לפענח את המאפיינים הכימיים של מערכות ביולוגיות כגון חלבונים8. שיטות IR מאפשרות את כימות החלבון של שינויים מבניים משני החלבונים במהלך הקיפול והצבירה שלהם. בנוסף, על מנת לפענח ברמה המיקרוסקופית את הפרטים המכניים המעורבים בנופי האנרגיה המסובכים של החלבון במהלך הצבירה שלהם, מקדמה גדולה הייתה פיתוח כלים קינטיקה כימית להרחבת מורכבות הרכבה עצמית מסלולים כולל עמילואיד סיבים היווצרות5,6,7,10,11,12. עם זאת, שיטות ספקטרוסקופיות בצובר מספקות מידע ממוצע בלבד על ההרכב הטרוגנית של מינים המצויים בפתרון או מעורב בצעדים מיקרוסקופיים מסוימים, ובכך מציג את החקירה של המאפיינים הביופיסיים של הפרט מינים צבורים מאתגרים ברמת ננו13,14.
בעשורים האחרונים הופיעו מספר טכניקות מיקרוסקופ עם יכולת הפעלה על קשקשים קטנים יותר מאשר מגבלת האור העקיפה. מחלקה זו של שיטות כוללת מיקרוסקופ אלקטרוני (EM) ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). בעוד סריקת אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) ומיקרוסקופ אלקטרון הילוכים (TEM) לספק דו מימדי (2D) תמונות של הדגימה, AFM התפתחה בעשורים האחרונים כטכניקה רבת עוצמה ורב תכליתי ללמוד תלת מימדי (3D) מורפולוגיות, כמו וכמו כן המאפיינים הננו של מדגם עם רזולוציה של תת-נאנמטר13,14,15,16,17,18,19, מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , בת 24 , מיכל בן 25 , מיכל בן 26 , 27. הרציונל מאחורי לימוד צבירת חלבונים באמצעות afm הוא שגישה זו מאפשרת את חקירת המבנה של מינים בודדים המצויים בתמיסה13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. במיוחד, על ידי ניטור המדגם כפונקציה של זמן, AFM מאפשר את חקירת האבולוציה של המבנה של המינים בתוך המדגם, מה שמאפשר לעקוב ולדמיין את המסלולים של היווצרות עמילואיד23, 25,38,39,40,41,42. יתרה מזאת, afm מאפשר כימות של פרמטרים מבניים כגון הגבהים הצולבים ואורכים של המינים הבודדים נוכח פתרון13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. עם זאת, המחקר של נכס ביופיזיקלי יחיד, כגון מורפולוגיה, הוא לעתים קרובות לא מספיק בעת לימוד הטרוגנית מערכות ביולוגיות מורכבות. AFM, SEM או שיטות הדמיה בלבד לא לחשוף בקלות את התכונות הכימיות של מינים הטרוגנית של אגרגטים עמילואיד בסולם הננו.
מראש מרכזי לניתוח של דגימות ביולוגיות הטרוגנית בקנה מידה זה נעשה לאחרונה עם פיתוח ויישום לתחום של צבירת חלבון של ננוספקטרוסקופיה אינפרא אדום (afm-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. שיטה חדשנית זו מנצלת את השילוב של הרזולוציה המרחבית של AFM (~ 1-10 ננומטר) עם כוח הניתוח הכימי של IR. טכניקת AFM-IR מתבססת על מדידת אפקט התהודה של פוטותרמי שמונעת על ידי לייזר IR, ועל מדידת ההתרחבות התרמית של המדגם בחקירה באמצעות העצה AFM. המדגם יכול להיות מואר על ידי לייזר IR ישירות מהחלק העליון או מהחלק התחתון של השתקפות פנימית מוחלטת, בדומה כמו באמצעות ספקטרוסקופיית אינפרא אדום קונבנציונאלי24,42,52,53 . לייזר IR יכול להיות פעמו עם תדרים טיפוסיים בסדר של מאות קילוהרץ (1-1000 kHz) ומכוונים על טווח ספקטרלי רחב, בדרך כלל בין 1000-3300 ס מ-1. למרות שמקור הלייזר משתרע על שטח של בקוטר של ~ 30 יקרומטר, הרזולוציה המרחבית של טכניקת afm-IR נקבעת בהתאם לקוטר קצה afm, המזהה את התרחבות התרמית המקומית של המערכת. Afm-IR מתאים היטב לחקר דגימות ביולוגיות מכיוון שהאות האינפרא-אדום פרופורציונלי לעובי שלהם עד 1-1.5 μm, והספקטרום של האינפרא-אדום המתקבל בדרך כלל בהסכמה עם ספקטרום התמסורת התואם של ftir13,54 ,55. מסיבה זו, שיטות מבוססות ניתוח בספקטרוסקופיה ניתן להחיל בקלות, כגון המחקר של שינויים כימיים, צורת הלהקה שינוי ו-de-קונבולוציה על ידי הנגזרות השני ניתוח52. בסך הכל, שילוב הרזולוציה המרחבית של AFM עם כוח הזיהוי הכימי של ספקטרוסקופיית IR, AFM-IR מאפשר רכישה בו של מגוון רחב של תכונות מורפולוגיות, מכניות וכימיות של מדגם בסולם הננו.
כאן, אנו ממחישים פרוטוקול לאפיון התהליך של צבירת חלבונים המנצלת את השילוב של הקרינה הפלואורסצנטית מתורבת, ברזולוציה גבוהה AFM הדמיה וננו AFM-IR. גישה משולבת זו כבר הצטיין במתן תוצאות מפורטות לימוד תכונות כימיות ומבניות של מיקרו-טיפות בודדות שנוצרו על ידי אגרגטים חלבונים, במחקר של הפרדה נוזל נוזלי בשלב החלבון, וב חקירת המאפיינים טרוגניות וביופיזיים של מינים צבורים בודדים ב-ננוסקאלה23,26,38,45,50,53, 56,57.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM-IR system</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>nanoIR 2 or 3</td>
			<td>Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminium Sealing Tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Adhesive Discs</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGG3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>415-101</td>
			<td>Platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica Disc 10mm V1</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Park NX10 AFM system</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platypus Ultra-Flat Gold Chips</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPP-NCHR-10 cantilevers</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>PPP-NCHR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LowBind Tubes, 2.0mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gold coated cantilevers</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>PR-EX-nIR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPM Specimen Discs 12mm</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy

התופעה של חלבון מתקפל ומצבור תוצאות היווצרות של אגרגטים חלבון הטרוגנית מאוד, אשר קשורים למצבים נוירוניווניות כגון מחלות אלצהיימר ופרקינסון. במיוחד אגרגטים מולקולרית במשקל נמוך, עמילואיד oligomers, הוכחו בעלי תכונות ציטוטוקסיים גנריות מעורבים כמו רעלים נוירוטוקסינים רבות של דמנציה. אנו ממחישים את השימוש בשיטות המבוססות על מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) כדי לטפל במשימה המאתגר של אפיון התכונות המורפולוגיות, הקונסטרוקטיביות והכימיות של אגרגטים אלה, שקשה ללמוד באמצעות מבנה קונבנציונאלי שיטות או שיטות ביופיזיקלי בצובר בשל טרוגניות והאופי הארעי שלהם. סריקה גישות מיקרוסקופ בדיקה כעת מסוגלים לחקור את המבנה של אגרגטים עמילואיד עם רזולוציה sub-ננומטר. אנו מראים כאן כי האינפרא אדום (IR) ננוספקטרוסקופית (AFM-IR), אשר בו מנצל את הרזולוציה הגבוהה של AFM ואת כוח הזיהוי הכימי של ספקטרוסקופיית IR, יכול ללכת רחוק יותר ולאפשר את האפיון של המאפיינים המבבניים של הפרט אגרגטים חלבוניים, ובכך מציעים תובנות על מנגנוני הצבירה. מאז הגישה שאנו מתארים ניתן ליישם גם לחקירות של אינטראקציות של הרכבות חלבון עם מולקולות ונוגדנים קטנים, זה יכול לספק מידע בסיסי כדי לפתח תרכובות טיפוליות חדשות כדי לאבחן או לטפל הפרעות ניווניות.

מסלול זמן נציג של Aβ 42, כפי שנמדד על ידי שיטת הזריחה של ThT, מוצג באיור 1. תהליך הצבירה מתאפיין בדרך כלל בעקומת סיגמואידית, שבה מתבוננים בתחילה שלב השהיה, ומלווה בשלב הגדילה התלול, לפני שעקומת העקומה מגיעה לרמה כאשר המצב הקבוע של שיווי משקל מגיע ל-6,7<...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

אנו מתארים את היישום של ננו ספקטרוסקופית אינפרא אדום ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופ כוח אטומי כדי להמחיש את תהליך של חלבון הרכבה עצמית לתוך אגרגטים oligomeric ו-עמילואיד fibrils, אשר קשורה היטב התחלתה ופיתוח של מגוון רחב של מחלות ניווניות אנושיות.

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

שיטות המבוססות על מיקרוסקופיה של כוח אטומי מאפשרות לאפיין תהליכים ביומולקולריים בסולם הננו ברזולוציה כימית או מבנית מורפולוגית, ולבסוף לפתוח חלון קדמי חדש של התבוננות בביולוגיה. שיטות מולקולה אחת מאפשרות בדיקה של מערכות הטרוגניות מאוד, תכונה שרלוונטית במיוחד להבנת צבירת חלבונים. על ידי שילוב מולקולות בודדות עם גישות גב, אנו יכולים להשיג מידע בסיסי על התנהגות של חלבונים, הקשרים שלהם עם מחלה אנושית ועיצוב התערבויות פרמקולוגיות אשר יכול להצליח.יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת בהצלחה כדי ללמוד את המאפיינים הכימיים והמבניים של ביו-חומרים לאספקת תרופות, יישומים ומטרות ביוטכנולוגיות אחרות. ייתכן שבתחילה יהיה מאתגר להגדיר את הפרמטרים הנכונים של AFM לרזולוציה גבוהה וקל להגדיר את ה-AFM תוך מדידת אגרגטים של פיבריל. 30 דקות לפני הדמיית AFM, להפעיל את מערכת AFM ולחץ על להגדיר ולחשו.בחלון שינוי החללית, לחץ ליד כדי להכין שלב מיקוד Z. כבה את מתג קרן AFM אם הוא דולוק ופתח את מנעולי dovetail. נתק את הראש מהמערכת ובחלון שינוי החללית, לחץ על הבא.הר את ה-AFM על מחזיק הגשוש. חבר את הראש למערכת ונעל את מנעולי dovetail. הפעל את מתג קרן הלייזר AFM ובחלון שינוי הבדיקה, לחץ על הבא.בחלון המוקפץ, לחץ על לא אם סוג cantilever לא השתנה ולהתאים את ידיות יישור אופטי כדי למצוא את cantilever. התאם את המוקד ל- cantilever ולחץ על הבא. בחלון המוקפץ, לחץ על כן אם המוקד הוא על cantilever.השתמש ידיות קרן לייזר זיהוי למקם את קרן הלייזר בסוף cantilever. השתמש בידיות קרן הלייזר שהוסטו כדי למקסם את האות הכולל שנמדד על ידי דיודת התמונה של ארבעת הרבעים לפחות ליותר מ וולט אחד. בחלון שינוי החללית, לחץ על הבא וסגור.לאחר המתנה של 15 דקות עבור cantilever להגיע ליציבות תרמית, להסתגל מחדש את המיקום של קרן לייזר הוסטה על דיודה צילום רגיש המיקום במידת הצורך. לחץ על סריקת NCM, בחר את משרעת הרצויה של תנודות, לחץ על שלב השימוש ולחץ על אוטומטי. כוונן את cantilever קרוב למקסימום של תהודה חופשית הראשונה של תנודות כ 300 קילוהרץ עבור cantilever עם קבוע האביב של 40 ניוטון למטר.מניחים את הדגימה על מחזיק הדגימה. לחץ על אזור הסריקה והגדר את הרזולוציה בין 256 על 256 ל- 1024 על 1024 פיקסלים ולאחר מכן הגדר את גודל הסריקה ואת מספר הפיקסל. הגדר את קצב הסריקה ל- 0.3 להרץ אחד עבור אזור סריקה של אחד עד חמישה על חמישה מיקרומטר בריבוע.מקד את התצוגה האופטית על המדגם ולחץ על הגישה כדי להתקרב למשטח הדגימה. לאחר מכן, לחץ להרים 100 מיקרומטר כדי להעלות את קצה AFM 100 מיקרומטר מעל פני השטח של המדגם ולחץ להרחיב על התמונה האופטית של המדגם. לחץ על סרגל שלב המוקד כדי למקד את התצוגה על פני השטח של המדגם ולהשתמש בחצים כדי לנוע באזור המדגם של עניין.לחץ על גישה כדי לעסוק במשטח ולחץ על סריקת קו כדי לבדוק אם הקצה עוקב היטב אחר פני השטח. כוונן את נקודת הסט לפי הצורך. לאחר מכן לחץ על סריקה כדי להתחיל בהדמיית פני השטח לדוגמה, תוך שמירה על משטר קבוע של שינוי פאזה שלא יעלה על דלתא 20 במהלך ההדמיה כדי למנוע כוח הדמיה גדול ולשמור על עקביות בין דגימות עצמאיות.עבור הדמיית ננו-ספקטרוסקופיה של IR, 30 עד 60 דקות לפני הניתוח, הפעל את מערכת ה- AFM IR ואת לייזר ה- IR. פתח את התוכנה המובנית כדי לשלוט במכשיר ולחץ על קובץ וחדש כדי לפתוח קובץ ננו-IR חדש. לחץ על אתחל כדי להפעיל את מערכת AFM IR ולפתוח את מכסה המכשיר.הר גשוש מצופה זהב סיליקון עם רדיוס נומינלי של 30 ננומטר וקבוע קפיץ של 0.2 ניוטון למטר על מערכת AFM IR כדי למדוד את המדגם במצב מגע. לחץ על טען במקטע בדיקה AFM ולאחר מכן. השתמש בהתמקדות על חיצי בדיקה כדי למקד את המצלמה על cantilever ולהשתמש בקצה כדי לחצות את הכוונת כדי למקם את הכוונת בסוף cantilever.סובבו את הידיות השולטות במיקום לייזר הגילוי כדי למקם את הלייזר בקצה הקנטילוור. סובב את ידיות הלייזר כדי לזהות ולהגדיל את הסכום הנמדד על-ידי דיודת התמונה של ארבעת הרבעים לערך הגדול משלושה וולט. סובב את ידית ההטיה כדי להתאים את הסטת ה-cantilever למינוס וולט אחד ולחץ על הבא.ואז לסגור את הכיסוי של המכשיר. השתמש בהתמקדות בחצי בדיקה כדי למקד את המצלמה על המדגם ואת הקצה חצים על הכוונת כדי לנוע באזור העניין של המדגם. לחץ על הבא ועסוק.בחלון המיקרוסקופ, בחר גובה עבור מורפולוגיה, משרעת 2 עבור ספיגת IR ותדירות PLL כדי למפות את הקצה כדי לדגום תהודה מגע. במקטע סריקת AFM, הגדר את הפרמטרים כפי שהוכח עבור דימות AFM ולחץ על סריקה כדי להשיג מפת מורפולוגיה. לאחר סיום מיפוי המורפולוגיה, בחלון המיקרוסקופ, לחץ על מפת הגובה כדי למקם את הגשוש בראש צבירה אחת.במקטע ננו IR, לחץ על הפעל IR כדי להאיר את הדגימה באמצעות לייזר IR. כדי למקד את לייזר אינפרא אדום על cantilever, לחץ על לייעל ולהזן 1655 ס"מ עבור wavenumber. לחץ על הוספה וסריקה כדי לקבוע את מיקום הלייזר של IR ולחץ על עדכן וסדר כדי ליישר את מיקומו עם cantilever.במקטע הכללי, הזן מספר גל שעבורו צפויה ספיגה גבוהה בשדה היחסי והשבית את אפשרות מסנן מעבר הרצועה. לחץ על הפעל IR ולאחר מכן בדוק את קריאת המונה ואת ה- FFT של התגובה cantilever. בחלון FFT, הזז את הסמן הירוק כדי לקרוא את תדירות תהודה של cantilever.ערך אופייני של FFT של תהודה של cantilevers הוא סביב 200 קילוהרץ. הזן את ערך תדירות תהודה שנוצר במקטע הכללי בשדה מרכז התדרים ולהשתמש בחלון תדר של 50 קילוהרץ. לחץ על חלון כוונון פעימת לייזר כדי לבחור את מצב תהודה משופרת ולהגדיר קצב דופק של 222 קילוהרץ, טווח כוונון של 50 קילוהרץ ומחזור חובה לייזר של 5%לחץ לרכוש כדי לטאטא את קצב הדופק של הלייזר.השתמש בסמן כדי לכוון את פעימת הלייזר לתדר התגובה המכנית של ההתפשטות התרמית של המדגם סופג את אור IR. לאחר מכן בחר לולאה נעולה שלב כדי לפקח על תהודה איש הקשר בין המדגם לבין הקצה ולחץ על אפס. עבור תכונות כימיות אחרות בסולם הננו, עקוב אחר תהודה מגע במהלך רכישת ספקטרום כדי להבטיח כי ספקטרום המדגם אינו מושפע התחממות יתר וריכוך.בחר באפשרות אפשר לעקוב אחר הדוגמה כדי לתת טיפ לתהודה ליצירת קשר ובחר רווח אינטגרלי של 0.5 ו רווח פרופורציונלי של 10 ולאחר מכן לחץ על אישור. בחלון האופטימיזציה, לחץ על אורך הגל וסריקה כדי לאתר את לייזר IR לפחות שלושה גלים המתאימים רצועות ספיגה גדולות של המדגם עבור מספר גל אחד לפחות עבור כל שבב של הלייזר. לחץ על כלים, כיול רקע IR וחדש, והגדר את מספר הגלים בין 1200 ל- 1800 ס"מ. הגדר את הרקע לממוצע לאחד, מחזור העבודה של 5% ומהירות הסריקה ל- 100 ס"מ בריבוע.לחץ על רכוש כדי למדוד את רקע הלייזר של IR לנורמליזציה של הספקטרום הננו-סולם שנמדד, שמור את הקובץ וסגור את החלון. בהגדרות ספקטרום IR, בחר רזולוציית ספקטרום IR בין ס"מ אחד לארבעה סנטימטרים ומספר ממוצעים חיים של 64 פעמים לפחות. לאחר מכן לחץ על לרכוש כדי למדוד ספקטרום IR מקומי בקנה מידה ננו בטווח החלבון.כדי להשיג מפה כימית שנפתרה בקנה מידה ננו, בחר 1655 ס"מ והדמיית IR ולחץ על סריקה בחלון סריקת AFM. לאחר השלמת המיפוי, שמור את המידות. לאחר מכן השתמש בתוכנה המובנית לעיבוד תמונה AFM כדי לנתח את המפות הנרכשות של מורפולוגיה, תהודה מגע וכימיה וספקטרום מקומי בקנה מידה ננו.זהו צעד קריטי כדי להשיג פתרון מונומרי טהור מאוד כמו נוכחות של מינים מצטברים עלול לגרום לשחזור לקוי של קינטיקה ולהציג חפצים במדידות שלך. גורם בסיסי לחקר מוצלח של דגימות ביולוגיות שיש להן הטרוגניות גבוהה הוא המיקום הנכון של מצעים מוצקים. תצהיר תרסיס microfluidic ניתן לנצל במקום ידני אחד על מנת לשמר את ארכיטקטורת מדגם הטרוגניות.שיטות אלה סוללות את הדרך לפענוח המבנה הכימי והמאפיינים של ביומולקולות בודדות והאינטראקציות שלהן בסביבה פיזיולוגית ונוזאלית מקומית.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה שהפגינו למחקר של H2 חמצון Hydrogenase [ניפה]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...