Name: characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-12T15:00:00
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著者らは、スイス国立科学財団(SNF)の財政支援(助成番号P2ELP2_162116とP300P2_171219)、ダーウィンカレッジ、エラスムス+プログラム(助成番号2018-1-LT01-KA103-046719-154000)に感謝します。これらの成果につながる研究は、ERC助成金フィスプロト(契約番号337969)、ニューマン財団(T.P.J.K.)および欧州連合の第7フレームワークプログラム(FP7/2007-2013)の下で欧州研究評議会から資金を受け取っています。ケンブリッジ・センター・フォー・フォールディング・疾患(C.G.、M.V.、T.P.J.K.)

1. 蛍光プレートリーダーの凝集アッセイ
注:ここで説明するプロトコルは、化学動態によるタンパク質またはペプチドの凝集を研究する方法の一例です。特に、アルツハイマー病58、59の発症および進行に関与するAβ42ペプチドの凝集を研究するために最適化されたプロトコルを記述する。同様のプロトコルは、任意のタンパク質?...

このプロトコルの最初の重要なステップは、ステップ1.1および1.2で説明するAβ42溶液の場合のような単量体タンパク質の調製である。オリゴマーまたは凝集種の存在は、凝集運動学58の再現性が悪い可能性があり、AFMでアーティファクトを誘導する可能性があるため、非常に純粋な単量体溶液から集約プロセスを開始することが不可欠です。測定(例えば、フィブリル種は、?...

現在、世界中で4,000万人以上の人々が、アルツハイマー病(AD)1やパーキンソン病(PD)2疾患などの神経変性疾患の影響を受けています。より一般的には、50以上の病理がタンパク質の誤折と凝集と分子レベルで関連しており、アミロイド沈着物として知られる不溶性線維性タンパク質凝集体の増殖につながるプロセス、 4.神経変性の分子起源とアミロイド形成につながるタンパク質のタンパク質立体構造変化との関連は、しかし、不均一性、一過性、ナノスケールの高いレベルのために、大部分は不明のままである。病理学的凝集体の次元4、5。
過去数十年のタンパク質構造の非常に成功した調査は、X線結晶学、クライオ電子顕微鏡および核磁気共鳴分光法5を含むバルク法の使用に広く基づいている。6,7,8,9.このクラスの技術の中で、赤外線(IR)分光法は、タンパク質8などの生物学的システムの化学的特性を解明するための敏感な分析ツールとして出現した。IR法は、タンパク質の二次的および四次構造変化の定量化を可能にします。さらに、凝集中のタンパク質の複雑な自由エネルギー景観に関与する機械的詳細を顕微鏡レベルでさらに解読するために、複雑にまで広がる化学運動学ツールの開発が大きな進歩を遂げました。アミロイド線維形成5、6、7、10、11、12を含む自己組み立て経路。しかし、バルク分光法は、溶液中に存在する種の異種アンサンブルに関する平均的な情報のみを提供し、特定の顕微鏡ステップに関与しているため、個々の生物物理学的特性の調査を行うナノスケールレベル13、14で挑戦する集約種。
光の回折限界よりも小さいスケールで動作する能力を持ついくつかの顕微鏡検査技術は、過去数十年で出現しています。このクラスの方法には、電子顕微鏡(EM)および原子間力顕微鏡(AFM)が含まれる。走査電子顕微鏡(SEM)と透過電子顕微鏡(TEM)は標本の2次元(2D)画像を提供する一方で、AFMは過去数十年にわたり、3次元(3D)形態を研究するための強力で汎用性の高い技術として登場しました。サブナノメートル分解能13、14、15、16、17、18、19、サンプルのナノ機械的特性と同様に、 20歳,21歳,22歳,23歳,24歳,25名,26歳,27.AFMを介してタンパク質凝集を研究する背後にある根拠は、このアプローチは、溶液13,14,16に存在する個々の種の形態の調査を可能にする、 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37.特に、時間の関数としてサンプルをモニタリングすることにより、AFMは、サンプル内の種の形態の進化の調査を可能にし、アミロイド形成23の経路を追従および可視化することを可能にする。 25,38,39,40,41,42.さらに、AFMは、溶液13、19、30、31に存在する個々の種の断面高さおよび長さなどの構造パラメータの定量を可能にする ,32,33,34,35,36,37,40,43,44歳,45歳,46歳,47歳,48.しかし、形態学のような単一の生物物理学的性質の研究は、多くの場合、異種および複雑な生物学的システムを研究する際に十分ではない。AFM、SEMまたはTEMイメージング法だけでは、ナノスケールでのアミロイド凝集体の異種種の化学的特性を容易に明らかにしない。
この規模での異種生体試料の解析に大きな進歩が見られ、最近では、赤外線ナノ分光法(AFM-IR)24,26のタンパク質凝集分野への応用が進み、 38,42,49,50,51,52.この革新的な方法は、AFM(~1−10nm)の空間分解能とIRの化学分析力の組み合わせを利用します。AFM-IR技術は、IRレーザーによって駆動される光熱誘導共鳴効果の測定と、AFM先端によって調査中のサンプルの熱膨張の測定に基づいています。サンプルは、従来の赤外線分光法24、42、52、53と同様に、全体的な内部反射で上から直接または下からIRレーザーによって照射することができる.IRレーザーは数百キロヘルツ(1−1000 kHz)の順序で典型的な周波数で脈打ち、広いスペクトル範囲、典型的には1000−3300 cm-1の間で調整することができる。レーザー光源は直径約30μmの面積をカバーしますが、AFM-IR技術の空間分解能は、システムの局所的な熱膨張を検出するAFM先端径によって公称的に決定されます。AFM-IRは、IR信号が1−1.5 μmまでの厚さに比例し、得られるIRスペクトルは一般的に対応するFTIR透過スペクトル13、54と一致しているため、生物学的サンプルの研究に適しています。 、55.このため、分光法における確立された分析方法は、化学シフトの研究、バンド形状変化および第2誘導体分析による非畳み込み52の研究など容易に適用することができる。全体的に、AFMの空間分解能とIR分光法の化学認識力を組み合わせることで、AFM-IRはナノスケールでのサンプルの形態的、機械的、化学的特性の広い範囲の同時取得を可能にします。
ここでは、インビトロ蛍光アッセイ、高分解能AFMイメージングおよびナノスケールAFM-IRの組み合わせを利用するタンパク質凝集プロセスの特性評価のためのプロトコルを例示する。この組み合わせアプローチは、タンパク質凝集体によって形成された個々のマイクロ液滴の化学的および構造的特性の研究、液体液タンパク質相分離の研究において、およびナノスケール23、26、38、45、50、53における個々の凝集種の不均一性および生物物理学的特性を調べている 56、57。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM-IR system</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>nanoIR 2 or 3</td>
			<td>Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminium Sealing Tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Adhesive Discs</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGG3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>415-101</td>
			<td>Platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica Disc 10mm V1</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Park NX10 AFM system</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platypus Ultra-Flat Gold Chips</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPP-NCHR-10 cantilevers</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>PPP-NCHR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LowBind Tubes, 2.0mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gold coated cantilevers</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>PR-EX-nIR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPM Specimen Discs 12mm</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy

タンパク質の誤折と凝集の現象は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性状態に関連する高度に異種タンパク質凝集体の形成をもたらします。特に低分子量凝集体は、アミロイドオリゴマーが、一般的な細胞傷害性を有することが示されており、認知症の多くの形態において神経毒として関与している。原子間力顕微鏡(AFM)に基づく方法を用いて、従来の構造を用いて研究が困難なこれらの集合体の形態的、構造的、化学的特性を特徴付けるという困難な課題に取り組む方法を示す。その不均一性と一過性の性質のために、方法またはバルク生物物理学的方法。スキャンプローブ顕微鏡アプローチは、サブナノメートル分解能を持つアミロイド凝集体の形態を調製できるようになりました。ここでは、AFMの高分解能とIR分光法の化学認識力を同時に利用する赤外線(IR)ナノ分光法(AFM-IR)が、個々の構造特性の特性をさらに高め、特性の特性を高めることができることを示します。タンパク質凝集体を提供し、集約メカニズムに関する洞察を提供します。我々が説明するアプローチは、低分子および抗体とのタンパク質アセンブリの相互作用の調査にも適用することができるので、診断または治療するための新しい治療化合物を開発するための基本的な情報を提供することができます神経変性疾患。

ThT蛍光アッセイによって測定されたAβ42凝集の代表的な時間経過を図1に示す。集約プロセスは、一般的に、ラグ相が最初に観察されるシグモイド曲線によって特徴付けられ、その後、平衡定常状態に達したときに曲線が高原に達する前に急激な成長相が続きます。,58.集約プロセスに関する分子の詳?...

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Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

赤外線ナノ分光法と高分解能原子間近顕微鏡の応用を用いて、タンパク質自己組織化のプロセスをオリゴメラ凝集体とアミロイド線維に可視化し、発症と発達に密接に関連している。ヒト神経変性疾患の広い範囲の。

赤外線ナノ分光法と原子間力顕微鏡による個々のタンパク質凝集物の特徴付け

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

原子間力顕微鏡に基づく方法により、ナノスケールで生体分子プロセスを形態学的化学的または構造的分解能で特徴付け、最終的に生物学に関する新たな前線の展望を開く。単一分子法は、タンパク質凝集の理解に特に関連する特徴である、非常に異種系の調査を可能にする。単一分子と逆アプローチを組み合わせることで、タンパク質の挙動、ヒト疾患との関連、薬理学的介入の設計に関する基本的な情報を得ることができます。さらに、この方法は、薬物送達、用途および他のバイオテクノロジーの目的のための生体材料の化学的および構造的特性を研究するためにうまく適用することができる。最初は高解像度の正しい AFM パラメータを設定するのが難しい場合があり、フィブリラの凝集体を測定しながら AFM を簡単に設定できます。AFMイメージングの30分前に、AFMシステムの電源を入れ、セットアップとプローブをクリックします。プローブ変更ウィンドウで、次のをクリックして Z フォーカスステージを準備します。AFMビームスイッチがオンの場合はオフにし、鳩尾ロックのロックを解除します。ヘッドをシステムから取り外し、プローブチェンジウィンドウで[次へ]をクリックします。AFMカンチレバーをプローブホルダーに取り付けます。ヘッドをシステムに接続し、鳩尾ロックをロックします。AFMレーザービームスイッチをオンにして、プローブチェンジウィンドウで[次へ]をクリックします。ポップアップ ウィンドウで、カンチレバーの種類が変更されない場合は [いいえ] をクリックし、オプティカル アライメント ノブを調整してカンチレバーを見つけます。カンチレバーにフォーカスを合わせ、[次へ]をクリックします。ポップアップ ウィンドウで、カンチレバーにフォーカスがある場合は [はい] をクリックします。検出レーザービームノブを使用して、レーザービームをカンチレバーの端に配置します。偏向したレーザービームノブを使用して、4つの象限フォトダイオードで測定された総信号を少なくとも1ボルトより大きく最大化します。プローブ変更ウィンドウで、[次へ] をクリックして閉じます。カンチレバーが熱安定性に達するまで15分待った後、必要に応じて位置感度フォトダイオード上の偏向レーザー光の位置を調整する。NCM スイープをクリックし、振動の希望する振幅を選択し、使用フェーズをクリックして[自動]をクリックします。カンチレバーを、1メートルあたり40ニュートンのスプリング定数でカンチレバーの振動の最初の自由共鳴の最大値に近い約300キロヘルツに調整します。サンプルホルダーにサンプルを置きます。スキャン領域をクリックし、解像度を 256 x 256 ~ 1024 x 1024 ピクセルに設定し、スキャン サイズとピクセル数を設定します。スキャン速度を 0.3 に 1 ヘルツに設定し、スキャン領域を 1 ~ 5 x 5 x 5 マイクロメートル平方に設定します。サンプルに光学ビューを焦点を当て、サンプルサーフェスにアプローチするアプローチをクリックします。次に、100マイクロメートルを持ち上げてサンプルの表面から100マイクロメートル上にAFMチップを上げ、サンプルの光学画像を拡大します。フォーカスステージバーをクリックして、サンプルのサーフェスにビューをフォーカスし、矢印を使用して目的のサンプルの領域を移動します。アプローチをクリックしてサーフェスをエンゲージし、ラインスキャンをクリックして、先端がサーフェスウェルに従っているかどうかを確認します。必要に応じて、設定点を調整します。次にスキャンをクリックしてサンプル表面のイメージングを開始し、イメージング中にデルタ20を超えない位相変化の一定のレジームを維持し、大きなイメージング力を回避し、独立したサンプル間の一貫性を維持します。IRナノスペクトロスコピーイメージングの場合、分析の30〜60分前に、AFM IRシステムとIRレーザーをオンにします。内蔵のソフトウェアを開いて機器を制御し、ファイルと新しいファイルをクリックして新しいナノIRファイルを開きます。AFM IRシステムを起動し、計測器カバーを開くには、初期化をクリックします。公称半径30ナノメートル、1メートル当たり0.2ニュートンのスプリング定数を持つシリコンゴールドコーティングプローブをAFM IRシステムに取り付け、接触モードでサンプルを測定します。AFM プローブセクションと次の[負荷]をクリックします。プローブ矢印にフォーカスを使用してカメラを片持ちレバーに焦点を当て、先端を使用して十字線を片持ちの端に配置します。検出レーザーの位置をコントロールするノブを回転させ、レーザーをカンチレバーの端に配置します。レーザーノブを回転させて、4つの象限フォトダイオードで測定した合計を3ボルトより大きい値に検出して最大化します。偏向ノブを回転させて片持ち偏向をマイナス1ボルトに調整し、次をクリックします。その後、楽器のカバーを閉じます。プローブ矢印に焦点を当てて、カメラをサンプルに焦点を当て、先端をクロスヘアの矢印に合わせ、サンプルの対象領域を移動します。次をクリックして、エンゲージします。顕微鏡ウィンドウで、形態の高さ、IR吸収のための振幅2、サンプル接触共鳴にチップをマッピングするPLL周波数を選択します。AFM スキャン セクションで、AFM イメージングの例に示すようにパラメータを設定し、スキャンをクリックして形態図を取得します。モルフォロジーマッピングが完了したら、顕微鏡ウィンドウで高さマップをクリックして、プローブを 1 つの集合体の上に配置します。ナノ IR セクションで、[IR の開始] をクリックして、サンプルを IR レーザーで照らします。カンチレバーに赤外線レーザーを集中するには、「最適化」をクリックし、波数として1655センチメートルを入力します。[追加] をクリックして IR レーザーの位置を決定し、[更新] をクリックして、その位置を片持ちレバーに合わせます。一般セクションで、相対フィールドの吸光度が高いと予想される波番号を入力し、バンドパスフィルタオプションを無効にします。[IRの開始]をクリックし、メーターの読み取りとカンチレバー応答のFFTを確認します。FFT ウィンドウで、緑色のカーソルを動かして、カンチレバーの共振周波数を読み取ります。カンチレバーの共振のFFTの典型的な値は約200キロヘルツである。生成された共振周波数値を周波数中心フィールドの一般セクションに入力し、50キロヘルツの周波数ウィンドウを使用します。レーザーパルスチューンウィンドウをクリックして共振強化モードを選択し、222キロヘルツのパルスレート、50キロヘルツのチューニング範囲、レーザーデューティサイクル5%を設定して、レーザーのパルスレートをスイープします。カーソルを使用して、赤外線を吸収するサンプルの熱膨張の機械的応答の周波数にレーザーパルスを調整します。次に、フェーズロックループを選択して、サンプルとチップの間の接触共鳴を監視し、ゼロをクリックします。ナノスケールでの他の化学特性については、スペクトル取得中に接触共鳴を追跡し、サンプルスペクトルが過熱および軟化の影響を受けないようにします。[Enable] を選択してサンプルを追跡して接触共鳴を追跡し、積分ゲイン 0.5、比例ゲインを 10 に選択して、[OK] をクリックします。最適化ウィンドウで、波長とスキャンをクリックして、サンプルの主要な吸光度バンドに対応する少なくとも3つの波数、およびレーザーの各チップに少なくとも1つの波数を求めます。ツール、IRバックグラウンドキャリブレーション、新しいをクリックし、波の数を1200〜1800センチメートルに設定します。背景を平均1に、デューティサイクルを5%、掃引速度を100センチメートル平方に設定します。測定されたナノスケールの局在スペクトルの正規化のためのIRレーザーの背景を測定するために、取得をクリックし、ファイルを保存し、ウィンドウを閉じます。IR スペクトル設定で、1 ~ 4 センチメートルの間の IR スペクトル解像度と、少なくとも 64 回の共平均の数を選択します。次に、獲得をクリックして、タンパク質範囲内のナノスケールの局在IRスペクトルを測定します。ナノスケール分解された化学地図を取得するには、1655センチメートルとIRイメージングを選択し、AFMスキャンウィンドウでスキャンをクリックします。マッピングが完了したら、測定値を保存します。次に、AFM画像処理ソフトウェアに組み込まれたものを使用して、取得した形態、接触共鳴および化学、およびナノスケールの局在スペクトルを分析します。凝集した種の存在は、動態の再現性が悪く、測定値にアーティファクトを導入する可能性があるため、非常に純粋な単量体溶液を得ることは重要なステップです。不均質性の高い生体試料の研究に成功するための基本的な要因は、固体基質の位置を正しくすることです。サンプルアーキテクチャと異種性を維持するために、手動の代わりにマイクロ流体噴霧堆積物を利用することができます。これらの方法は、個々の生体分子の化学構造と特性、および生理学的およびネイティブな液体環境におけるそれらの相互作用を解明するための道を開きます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

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Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

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Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

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Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析

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High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

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Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...