Name: characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-12T15:00:00
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Os autores agradecem a Swiss National Foundation for Science (SNF) pelo apoio financeiro (Grant Number P2ELP2_162116 e P300P2_171219), o Darwin College, programa Erasmus + para o apoio financeiro (Grant Number 2018-1-LT01-KA103-046719 -15400-P3) e o investigação que conduz a estes resultados recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito do sétimo programa-quadro da União Europeia (7. º PQ/2007-2013) através da subvenção do CEI PhysProt (acordo n. º 337969), da Fundação Newman (T.P.J.K.) e da Centro de Cambridge para doenças misfolding (CG, T.P.J.K.).

1. ensaios de agregação em leitores de placas de fluorescência
Nota: o protocolo aqui descrito é um exemplo de como estudar a agregação de qualquer proteína ou peptídeo por cinética química. Em particular, descreve um protocolo otimizado para estudar a agregação do peptídeo aβ 42, que está envolvido no início e progressão da doença de Alzheimer58,59. Um protocolo semelhante pode ser ajustado e adotado para estudar a agr...

O primeiro passo crítico neste protocolo é a preparação de proteínas monoméricas, como no caso da solução aβ 42 descrita nas etapas 1,1 e 1,2. É essencial iniciar o processo de agregação a partir de uma solução monomérica altamente pura, pois a presença de espécies oligoméricas ou agregadas pode resultar em baixa reprodutibilidade da cinética de agregação58e induzir artefatos no AFM medidas (por exemplo, as espécies fibrilares serão evidentes nas fases iniciais da agregaçã...

Mais de 40 milhões pessoas em todo o mundo são atualmente afetadas por distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer (AD)1 e Parkinson (PD)2 doenças. Mais geralmente, mais de 50 patologias estão associadas a nível molecular com desdobramento de proteínas e agregação, um processo que leva à proliferação de agregados protéicos insolúveis fibrilantes, conhecidos como depósitos amilóides3, 4. as origens moleculares da neurodegeneração e suas ligações com as mudanças conformacional da proteína das proteínas que conduzem à formação do amilóide, entretanto, permanecem obscuras, na grande parte por causa do nível elevado de heterogeneidade, de natureza transiente e de nanoescala dimensões dos agregados patológicos4,5.
Investigações altamente bem-sucedidas de estruturas proteicas nas últimas décadas têm sido amplamente baseadas no uso de métodos a granel, incluindo cristalografia de raios-X, microscopia crioeletrônica e espectroscopia de ressonância magnética nuclear5, 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9. dentro desta classe de técnicas, a espectroscopia infravermelha (ir) surgiu como uma ferramenta analítica sensível para desvendar as propriedades químicas dos sistemas biológicos, como as proteínas8. Os métodos do ir permitem a quantificação de mudanças estruturais secundárias e Quaternário da proteína durante seu proteínas e agregação. Além disso, a fim de decifrar mais a nível microscópico os detalhes mecanísticos envolvidos nas complexas paisagens energéticas livres de proteínas durante a sua agregação, um avanço importante tem sido o desenvolvimento de ferramentas de cinética química para estender a complexa caminhos de automontagem, incluindo formação de fibrilas amilóides5,6,7,10,11,12. No entanto, os métodos espectroscópicos em massa fornecem apenas informações médias sobre o conjunto heterogêneo de espécies presentes em solução ou envolvidas em etapas microscópicas específicas, tornando assim a investigação das propriedades biofísicas de indivíduos espécies agregadas desafiadoras no nível de nanoescala13,14.
Várias técnicas de microscopia com a capacidade de operar em escalas menores do que o limite de difração de luz emergiram nas últimas décadas. Esta classe de métodos inclui microscopia eletrônica (EM) e microscopia de força atômica (AFM). Enquanto a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornecem imagens bidimensionais (2D) de um espécime, AFM emergiu nas últimas décadas como uma técnica poderosa e versátil para estudar morfologias tridimensionais (3D), como bem como as propriedades Nanomecânica de uma amostra com resolução sub-nanômetro13,14,15,16,17,18,19, 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27. a fundamentação subjacente ao estudo da agregação proteica via AFM é que essa abordagem possibilita a investigação da morfologia de espécies individuais presentes na solução13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Em particular, ao monitorar a amostra em função do tempo, o AFM possibilita a investigação da evolução da morfologia das espécies dentro da amostra, o que possibilita acompanhar e visualizar as vias de formação de amiloides23, 25,38,39,40,41,42. Além disso, a AFM possibilita a quantificação de parâmetros estruturais como alturas transversais e comprimentos das espécies individuais presentes na solução13,19,30,31 ,32,33,34,35,36, 37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. no entanto, o estudo de uma única propriedade biofísica, como a morfologia, muitas vezes não é suficiente quando se estuda sistemas biológicos heterogêneos e complexos. Os métodos de imagem AFM, SEM ou TEM sozinhos não revelam prontamente as propriedades químicas de espécies heterogêneas de agregados amilóides na nanoescala.
Um avanço importante para a análise de amostras biológicas heterogêneas nesta escala foi feito recentemente com o desenvolvimento e a aplicação ao campo da agregação da proteína da nanoespectroscopia infravermelha (AFM-ir)24,26, 38,42,49,50,51,52. Este método inovativo explora a combinação da definição espacial de AFM (~ 1 − 10 nanômetro) com o poder da análise química do IR. A técnica AFM-IR é baseada na mensuração do efeito de ressonância induzida fototermal conduzido por um laser de infravermelho, e na mensuração da expansão térmica da amostra investigação pela ponta AFM. A amostra pode ser iluminada pelo laser do ir diretamente da parte superior ou da parte inferior na reflexão interna total, similarmente como na espectroscopia infravermelha convencional24,42,52,53 . O laser do IR pode ser pulsado com freqüências típicas na ordem de centenas de kilohertz (1 − 1000 quilohertz) e ajustado sobre uma escala espectral larga, tipicamente entre 1000 − 3300 cm-1. Embora a fonte de laser cubra uma área de ~ 30 μm de diâmetro, a resolução espacial da técnica AFM-IR é determinada nominalmente pelo diâmetro da ponta AFM, que detecta a expansão térmica local do sistema. AFM-ir é poço-serido para estudar amostras biológicas porque o sinal do ir é proporcional a sua espessura até 1 − 1.5 μm, e os espectros resultantes do ir são geralmente de acordo com os espectros correspondentes da transmissão de FTIR13,54 ,55. Por esta razão, métodos de análise estabelecidos na espectroscopia podem ser prontamente aplicados, como o estudo de turnos químicos, mudança de forma de banda e de-convolução pela segunda análise de derivativos52. Globalmente, combinando a resolução espacial do AFM com o poder de reconhecimento químico da espectroscopia IR, AFM-IR permite a aquisição simultânea de uma ampla gama de propriedades morfológicas, mecânicas e químicas de uma amostra na nanoescala.
Aqui, ilustramos um protocolo para a caracterização do processo de agregação proteica que explora a combinação de ensaios de fluorescência in vitro, imagem AFM de alta resolução e AFM-IR de nanoescala. Esta abordagem combinada já se destacou no fornecimento de resultados detalhados no estudo das propriedades químicas e estruturais de microgotas individuais formadas por agregados proteicos, em estudos de separação de fase proteica líquido-líquido, e em investigando a heterogeneidade e as propriedades biofísicas de espécies agregadas individuais na nanoescala23,26,38,45,50,53, 56,57.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM-IR system</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>nanoIR 2 or 3</td>
			<td>Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminium Sealing Tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Adhesive Discs</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGG3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>415-101</td>
			<td>Platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica Disc 10mm V1</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Park NX10 AFM system</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platypus Ultra-Flat Gold Chips</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPP-NCHR-10 cantilevers</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>PPP-NCHR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LowBind Tubes, 2.0mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gold coated cantilevers</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>PR-EX-nIR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPM Specimen Discs 12mm</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy

O fenômeno de desdobramento de proteínas e agregação resulta na formação de agregados proteicos altamente heterogêneos, que estão associados a condições neurodegenerativas, como as doenças de Alzheimer e Parkinson. Em particular os agregados de baixo peso molecular, oligomers do amilóide, foram mostrados para possuir Propriedades citotóxica genéricas e são implicados como neurotoxinas em muitas formas de demência. Nós ilustramos o uso de métodos baseados na microscopia de força atômica (AFM) para abordar a tarefa desafiadora de caracterizar as propriedades morfológicas, estruturais e químicas desses agregados, que são difíceis de estudar usando estruturas estruturais convencionais métodos ou métodos biofísicos em massa devido à sua heterogeneidade e natureza transitória. Abordagens de microscopia de sonda de varredura agora são capazes de investigar a morfologia de agregados amilóides com resolução de subnanômetro. Mostramos aqui que a nanoespectroscopia de infravermelho (IR) (AFM-IR), que explora simultaneamente a alta resolução do AFM e o poder de reconhecimento químico da espectroscopia IR, pode ir mais longe e possibilitar a caracterização das propriedades estruturais de indivíduos agregados proteicos e, assim, oferecem insights sobre os mecanismos de agregação. Desde que a aproximação que nós descrevemos pode ser aplicada também às investigações das interações de conjuntos da proteína com moléculas e anticorpos pequenos, pode entregar a informação fundamental para desenvolver compostos terapêuticos novos para diagnosticar ou tratar distúrbios neurodegenerativos.

Um curso de tempo representativo da agregação aβ 42, medido pelo ensaio de fluorescência ThT, é mostrado na Figura 1. O processo de agregação é comumente caracterizado por uma curva sigmoidal, onde uma fase de retardo é inicialmente observada, e é seguida por uma fase de crescimento íngreme, antes que a curva atinja um planalto quando um estado estacionário de equilíbrio é atingido6,7 , 58</...

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Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Nós descrevemos a aplicação da nanoespectroscopia infravermelha e da microscopia de alta resolução da força atômica para visualizar o processo do self-assembly da proteína em agregados oligoméricas e em fibrilas do amilóide, que é associada pròxima com o início e o desenvolvimento de uma ampla gama de distúrbios neurodegenerativos humanos.

Caracterização de agregados proteicos individuais por Nanoespectroscopia infravermelha e microscopia de força atômica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Métodos baseados na microscopia de força atômica possibilitam caracterizar processos biomoleculares na escala nano com resolução química ou estrutural morfológica, finalmente abrindo uma nova janela frontal de observação sobre biologia. Métodos de molécula única permitem sondar sistemas altamente heterogêneos, uma característica que é particularmente relevante para a compreensão da agregação de proteínas. Combinando moléculas únicas com abordagens traseiras, podemos obter informações fundamentais sobre o comportamento das proteínas, suas ligações com doenças humanas e projetar intervenções farmacológicas que podem ser bem sucedidas.Além disso, este método pode ser aplicado com sucesso para estudar as propriedades químicas e estruturais dos biomateriais para a entrega de medicamentos, aplicações e outros fins biotecnológicos. Pode ser desafiador inicialmente definir os parâmetros AFM corretos para alta resolução e é fácil configurar seu AFM enquanto mede seus agregados de fibrilar. 30 minutos antes da imagem AFM, ligue o sistema AFM e clique em configurar e sondar.Na janela de alteração da sonda, clique ao lado para preparar o estágio de foco Z. Desligue o interruptor de feixe AFM se estiver ligado e desbloqueie as fechaduras do rabo de pomba. Desconecte a cabeça do sistema e na janela de mudança da sonda, clique em seguida.Monte o cantilever AFM no suporte da sonda. Conecte a cabeça ao sistema e bloqueie as travas do rabo de pomba. Ligue o interruptor de raio laser AFM e na janela de mudança da sonda, clique em seguida.Na janela pop up, clique em não se o tipo cantilever não mudou e ajuste os botões de alinhamento óptico para encontrar o cantilever. Ajuste o foco no cantilever e clique em seguida. Na janela pop-up, clique em sim se o foco estiver no cantilever.Use os botões de raio laser de detecção para posicionar o raio laser no final do cantilever. Use os botões de feixe laser desviados para maximizar o sinal total medido pelo diodo fotográfico de quatro quadrantes a pelo menos mais de um volt. Na janela de mudança da sonda, clique em seguida e feche.Depois de esperar 15 minutos para que o cantilever atinja a estabilidade térmica, reajuste a posição do raio laser desviado no diodo fotográfico sensível da posição, se necessário. Clique em NCM sweep, selecione a amplitude desejada de oscilação, clique na fase de uso e clique em auto. Sintonize a cantilever perto do máximo de sua primeira ressonância livre de oscilação para aproximadamente 300 kilohertz para um cantilever com uma constante de mola de 40 newtons por metro.Coloque a amostra no suporte da amostra. Clique na área de digitalização e defina a resolução entre 256 por 256 e 1024 por 1024 pixels e, em seguida, defina o tamanho da varredura e o número do pixel. Defina a taxa de digitalização para 0,3 para um hertz para uma área de varredura de um a cinco por cinco micrômetros ao quadrado.Concentre a visão óptica na amostra e clique na abordagem para se aproximar da superfície da amostra. Em seguida, clique em levantar 100 micrômetros para levantar a ponta AFM 100 micrômetros acima da superfície da amostra e clique em expandir na imagem óptica da amostra. Clique na barra de estágio de foco para focar a visão na superfície da amostra e use as setas para se mover na região da amostra de interesse.Clique na abordagem para engajar a superfície e clique na varredura da linha para verificar se a ponta está seguindo bem a superfície. Ajuste o ponto de ajuste conforme necessário. Em seguida, clique na varredura para começar a imagem da superfície da amostra, mantendo um regime constante de mudança de fase não excedendo delta 20 durante a imagem para evitar uma grande força de imagem e manter a consistência entre amostras independentes.Para imagens de nanoespectroscopia ir, 30 a 60 minutos antes da análise, ligue o sistema AFM IR e o laser IR. Abra o software incorporado para controlar o instrumento e clique no arquivo e novo para abrir um novo arquivo nano IR. Clique em inicializar para iniciar o sistema AFM IR e abrir a tampa do instrumento.Monte uma sonda revestida de ouro de silicone com um raio nominal de 30 nanômetros e uma constante de mola de 0,2 newtons por metro no sistema AFM IR para medir a amostra no modo de contato. Clique em carregar na seção sonda AFM e em seguida. Use o foco em setas de sonda para focar a câmera no cantilever e use a ponta para mirar para colocar a mira no final do cantilever.Gire os botões que controlam a posição do laser de detecção para posicionar o laser no final do cantilever. Gire os botões laser para detectar e maximizar a soma medida pelo diodo fotográfico de quatro quadrantes a um valor superior a três volts. Gire o botão de deflexão para ajustar a deflexão cantilever para menos um volt e clique em seguida.Em seguida, feche a tampa do instrumento. Use o foco em setas de sonda para focar a câmera na amostra e ponta para mirar setas para mover-se na região de interesse da amostra. Clique em seguida e engaje.Na janela do microscópio, selecione altura para morfologia, amplitude dois para a absorção de IR e frequência PLL para mapear a ponta para amostrar ressonância de contato. Na seção de varredura AFM, defina os parâmetros como demonstrado para a imagem AFM e clique em digitalizar para adquirir um mapa de morfologia. Quando o mapeamento da morfologia estiver concluído, na janela do microscópio, clique no mapa de altura para posicionar a sonda na parte superior de um agregado.Na seção nano IR, clique em iniciar IR para iluminar a amostra com o laser IR. Para focar o laser infravermelho no cantilever, clique em otimizar e digite 1655 centímetros para o número de ondas. Clique em adicionar e digitalizar para determinar a posição do laser IR e clique na atualização e tudo bem para alinhar sua posição com o cantilever.Na seção geral, digite um número de ondas para o qual se espera uma alta absorção no campo relativo e desative a opção de filtro de passe de banda. Clique em iniciar ir, em seguida, verifique a leitura do medidor e o FFT da resposta cantilever. Na janela FFT, mova o cursor verde para ler a frequência de ressonância do cantilever.Um valor típico da FFT da ressonância dos cantilevers é de cerca de 200 kilohertz. Digite o valor de frequência de ressonância gerada na seção geral no campo central de frequência e use uma janela de frequência de 50 quilohertz. Clique na janela de sintonia de pulso laser para selecionar o modo aprimorado de ressonância e definir uma taxa de pulso de 222 kilohertz, uma faixa de melodia de 50 kilohertz e um ciclo de serviço a laser de 5%Clique para varrer a pulsação do laser.Use o cursor para ajustar o pulso laser à frequência da resposta mecânica da expansão térmica da amostra absorvendo a luz IR. Em seguida, selecione o loop bloqueado de fase para monitorar a ressonância de contato entre a amostra e a ponta e clique em zero. Para outras propriedades químicas na escala nano, rastreie a ressonância de contato durante a aquisição de espectros para garantir que o espectro amostral não seja afetado pelo superaquecimento e amolecimento.Selecione ativar para rastrear a amostra para a ressonância de contato de ponta e selecione um ganho integral de 0,5 e um ganho proporcional de 10, em seguida, clique em OK. Na janela de otimização, clique no comprimento de onda e escaneie para localizar o laser IR para pelo menos três números de ondas correspondentes às principais bandas de absorção da amostra e para pelo menos um número de ondas para cada chip do laser. Clique em ferramentas, calibração de fundo ir e novo, e defina os números de ondas entre 1200 e 1800 centímetros. Defina os fundos como médio para um, o ciclo de trabalho de 5% e a velocidade de varredura para 100 centímetros ao quadrado.Clique em adquirir para medir o fundo do laser IR para normalização do espectro localizado em escala nano medido, salve o arquivo e feche a janela. Nas configurações de espectro de RI, selecione uma resolução de espectro IR entre um e quatro centímetros e um número de co-médias de pelo menos 64 vezes. Em seguida, clique em adquirir para medir um espectro de IR localizado em nano escala na faixa de proteína.Para adquirir um mapa químico resolvido em escala nano, selecione 1655 centímetros e imagens de RI e clique em digitalizar na janela de varredura AFM. Quando o mapeamento estiver concluído, salve as medidas. Em seguida, use o software de processamento de imagem AFM incorporado para analisar os mapas adquiridos de morfologia, ressonância de contato e química e espectros localizados em escala nano.É um passo crítico para obter uma solução monomérica altamente pura, pois a presença de espécies agregadas pode resultar em baixa reprodutibilidade da cinética e introduzir artefatos em suas medições. Um fator fundamental para o estudo com sucesso de amostras biológicas com alta heterogeneidade é a posição correta dos substratos sólidos. A deposição de spray microfluido pode ser explorada em vez de manual, a fim de preservar a arquitetura da amostra e a heterogeneidade.Esses métodos abrem caminho para desvendar a estrutura química e as propriedades das biomoléculas individuais e suas interações no ambiente fisiológico e líquido nativo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Bioquímica

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Proteína de filme infravermelho eletroquímica demonstrada por estudo de oxidação de2 H pela hidrogenase [NiFe]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Análise de β-amiloide-induzida de anormalidades na estrutura do coágulo de fibrina por espectroscopia e microscopia eletrônica

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...