Name: characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Авторы благодарят Швейцарский национальный фонд науки (SNF) за финансовую поддержку (грант номер P2ELP2-162116 и P300P2-171219), Дарвинколледж, программа Erasmus для финансовой поддержки (грант номер 2018-1-LT01-KA103-046719-1540-P3) исследования, приведёвшие к этим результатам, получили финансирование от Европейского исследовательского совета в рамках Седьмой Рамочной программы Европейского союза (FP7/2007-2013) через грант ERC PhysProt (соглашение No 337969), Фонд Ньюмана (T.P.J.K.) и The Кембриджский центр по неиспужным заболеваниям (C.G., M.V., и T.P.J.K.).

1. Агрегация анализы на флуоресценции пластины читателей
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный здесь протокол является примером того, как изучать агрегацию любого белка или пептида химической кинетикой. В частности, он описывает оптимизированный протокол для изучения агрегации пептида...

Первым важным шагом в этом протоколе является подготовка мономерных белков, например, в случае решения АЗ42, описанного в шагах 1.1 и 1.2. Важно инициировать процесс агрегации из высоко чистого, мономерного раствора, так как наличие олигомерных или агрегированных видов может привести к пло...

Более 40 миллионов человек во всем мире в настоящее время страдают от нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (AD)1 и Паркинсона (PD)2 заболеваний. В более общем плане, более пятидесяти патологий связаны на молекулярном уровне с протеином misfolding и агрегации, процесс, который приводит к распространению нерастворимых фибриллярных белковых агрегатов, известных как амилоидные отложения3, 4. Молекулярное происхождение нейродегенерации и ее связи с белковыми конформанформашническими изменениями белков, приводящими к образованию амилоидов, однако, остаются неясными, в значительной степени из-за высокого уровня неоднородности, преходящей природы и наномасштаба размеры патологических агрегатов4,5.
Высоко успешные исследования белковых структур в последние несколько десятилетий были широко основаны на использовании массовых методов, включая рентгеновскую кристаллографию, криоэлектронную микроскопию и ядерную магнитно-резонансную спектроскопию5, 6 , 7 (г. , 8 , 9. В рамках этого класса методов, инфракрасная (ИК) спектроскопия стала чувствительным аналитическим инструментом, чтобы разгадать химические свойства биологических систем, таких как белки8. Методы ИК позволяют количественно освящать вторичные и четырехнорные структурные изменения во время их неправильного сворачивания и агрегации. Кроме того, для дальнейшей расшифровки на микроскопическом уровне механистических деталей, участвующих в сложных ландшафтах свободной энергии белка во время их агрегации, важным достижением стала разработка инструментов химической кинетики, которые будут распространяться на сложные самосборки пути, включая амилоидные фибрилиды формирования5,6,7,10,11,12. Однако массовые спектроскопические методы обеспечивают только среднюю информацию о неоднородном ансамбле видов, присутствующих в растворе или участвующих в конкретных микроскопических шагах, тем самым делая исследование биофизических свойств человека агрегированные виды, бросающие вызов на наноуровне13,14.
За последние десятилетия появилось несколько методов микроскопии, способных работать на масштабах меньше, чем предел дифракции света. Этот класс методов включает электронную микроскопию (EM) и атомную силовую микроскопию (AFM). В то время как сканирование электронной микроскопии (SEM) и трансмиссионная электронная микроскопия (TEM) обеспечивают двумерные (2D) изображения образца, AFM появился в последние десятилетия как мощный и универсальный метод для изучения трехмерных (3D) морфологий, как а также наномеханические свойства образца с субнанометровымразрешением13,14,15,16,18,19, 20 , 21 год , 22 Г. , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. Обоснование изучения агрегации белка через AFM является то, что этот подход позволяет исследования морфологии отдельных видов, присутствующих в решении13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. В частности, путем мониторинга образца в качестве функции времени, AFM позволяет иссмотреть эволюцию морфологии видов в образце, что позволяет следить и визуализировать пути формирования амилоидов23, 25,38,39,40,41,42. Кроме того, AFM позволяет количественно определить структурные параметры, такие как поперечные высоты и длины отдельных видов, присутствующих в растворе13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 г. , 46 , 47 год , 48. Однако, изучение одного биофизического свойства, такого как морфология, часто недостаточно при изучении неоднородных и сложных биологических систем. AFM, SEM или TEM методы визуализации сами по себе не легко выявить химические свойства неоднородных видов амилоидных агрегатов на наноуровне.
Основной прогресс в анализе неоднородных биологических образцов такого масштаба был сделан недавно с развитием и применением в области агрегации белка инфракрасной наноспектроскопии (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Этот инновационный метод использует сочетание пространственного разрешения AFM (1–10 нм) с химическим анализом ИК. Техника AFM-IR основана на измерении фототермального индуцированного резонансного эффекта, управляемого ИК-лазером, и на измерении теплового расширения образца, исследуемого по наконечнику AFM. Образец может быть освещен ИК-лазером непосредственно сверху или снизу в общем внутреннем отражении, так же, как и в обычной инфракрасной спектроскопии24,42,52,53 . ИК-лазер может пульсировать с типичными частотами в порядке сотен килогерц (1-1000 кГц) и настроен на широкий спектральный диапазон, как правило, между 1000-3300 см-1. Хотя лазерный источник охватывает область диаметром 30 мкм, пространственное разрешение метода AFM-IR номинально определяется диаметром наконечника AFM, который обнаруживает локальное тепловое расширение системы. AFM-IR хорошо подходит для изучения биологических образцов, потому что ИК-сигнал пропорционален их толщине до 1,1,5 мкм, и полученные спектры ИК, как правило, в согласии с соответствующими спектрами передачи FTIR13,54 ,55. По этой причине, установленные методы анализа в спектроскопии могут быть легко применены, такие как изучение химических сдвигов, изменение формы полосы и де-свертывания второй анализ производных52. В целом, сочетая пространственное разрешение AFM с химической силой распознавания ИК-спектроскопии, AFM-IR позволяет одновременно приобрести широкий спектр морфологических, механических и химических свойств образца на наноуровне.
Здесь мы иллюстрируем протокол для характеристики процесса агрегации белка, который использует сочетание in vitro флуоресценции анализы, с высоким разрешением AFM изображений и наномасштабных AFM-ИК. Этот комбинированный подход уже преуспел в предоставлении подробных результатов в изучении химических и структурных свойств отдельных микрокапель, образованных белковыми агрегатами, в изучении разделения фаз жидко-жидкого белка, а также в изучение неоднородности и биофизических свойств отдельных агрегированных видов на наномасштабе23,26,38,45,50,53, 56,57.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM-IR system</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>nanoIR 2 or 3</td>
			<td>Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Microplate Aluminium Sealing Tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Adhesive Discs</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGG3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>415-101</td>
			<td>Platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica Disc 10mm V1</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Park NX10 AFM system</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platypus Ultra-Flat Gold Chips</td>
			<td>Platypus Technologies</td>
			<td>AU.1000.SWTSG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPP-NCHR-10 cantilevers</td>
			<td>Park Systems</td>
			<td>PPP-NCHR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LowBind Tubes, 2.0mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gold coated cantilevers</td>
			<td>Anasys Instruments</td>
			<td>PR-EX-nIR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPM Specimen Discs 12mm</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGF7001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing individual protein aggregates by infrared nanospectroscopy and atomic force microscopy

Феномен неправильного сворачивания и агрегации белка приводит к образованию высокоразногенных белковых агрегатов, которые связаны с нейродегенеративными состояниями, такими как болезни Альцгеймера и Паркинсона. В частности, низкий молекулярный вес агрегатов, амилоидных олигомеров, было показано, обладают общими цитотоксическими свойствами и причастны как нейротоксины во многих формах слабоумия. Мы иллюстрируем использование методов, основанных на атомной микроскопии силы (AFM) для решения сложной задачи характеристики морфологических, структурных и химических свойств этих агрегатов, которые трудно изучить с помощью обычных структурных методы или объемные биофизические методы из-за их неоднородности и преходящей природы. Подходы к микроскопии сканирования теперь способны исследовать морфологию амилоидных агрегатов с субнанометровым разрешением. Мы показываем здесь, что инфракрасная (ИК) наноспектрокопия (AFM-IR), которая одновременно использует высокое разрешение AFM и химическую силу распознавания ИК-спектроскопии, может пойти дальше и позволить характеристику структурных свойств отдельных белок агрегатирует, и таким образом предлагает проницательность в механизмы агрегации. Поскольку подход, который мы описываем, может быть применен также к исследованиям взаимодействий белковых сборок с небольшими молекулами и антителами, он может предоставить фундаментальную информацию для разработки новых терапевтических соединений для диагностики или лечения нейродегенеративных расстройств.

Репрезентативный временной курс агрегации АЗ42, измеряемый по оценке флуоресценции ThT, показан на рисунке 1. Процесс агрегации обычно характеризуется сигмоидальной кривой, где фаза запаздывания первоначально наблюдается, и сопровождается крутой фазой роста, прежде чем ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Мы описываем применение инфракрасной наноспектроскопии и атомной микроскопии высокого разрешения для визуализации процесса самосборки белка в олигомерные агрегаты и амилоидные фибрилты, которые тесно связаны с началом и развитием широкого спектра нейродегенеративных расстройств человека.

Характеристика индивидуальных белковых агрегатов с помощью инфракрасной наноспектроскопии и микроскопии атомной силы

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Методы, основанные на атомной силовой микроскопии, позволяет охарактеризовать биомолекулярные процессы в наномасштабе с морфологическим химическим или структурным разрешением, наконец, открыв новое переднее окно наблюдения по биологии. Методы одной молекулы позволяют зондировать высокогетерогенные системы, особенность, которая особенно актуальна для понимания агрегации белка. Объединив отдельные молекулы с подходами к спине, мы можем получить фундаментальную информацию о поведении белков, их связи с болезнью человека и разработать фармакологические вмешательства, которые могут быть успешными.Кроме того, этот метод может быть успешно применен для изучения химических и структурных свойств биоматериалов для доставки наркотиков, применения и других биотехнологических целей. Это может быть сложной задачей на начальном этапе установить правильные параметры AFM для высокого разрешения, и это легко настроить AFM при измерении фибриллярдных агрегатов. За 30 минут до изображения AFM включите систему AFM и нажмите кнопку настройки и зонда.В окне изменения зонда нажмите рядом, чтобы подготовить стадию фокусировки. Выключите переключатель пучка AFM, если он находится на и разблокировать замки голубятни. Отключите головную голову от системы и в окне изменения зонда щелкните далее.Гора кантилевер AFM на держатель зонда. Подключите головную голову к системе и заблокировой замки голубятни. Включите переключатель лазерного луча AFM и в окне изменения зонда, нажмите дальше.Во всплывающем окне щелкните нет, если тип кантилевера не изменился, и отрегулируйте оптические ручки выравнивания, чтобы найти кантилевер. Отрегулируйте фокус на кантилевер и нажмите далее. В всплывающем окне нажмите "да", если основное внимание уделяется кантилеверу.Используйте ручки обнаружения лазерного луча для позиционирования лазерного луча в конце кантилевера. Используйте отклоняется лазерный луч ручки, чтобы максимизировать общий сигнал измеряется четыре квадранта фото диод, по крайней мере больше, чем один вольт. В окне изменения зонда щелкните рядом и закройте.Прождя 15 минут для кантилевера, чтобы достичь тепловой стабильности, скорректировать положение отклоняется лазерный луч на позиции чувствительных фото диод, если это необходимо. Нажмите NCM развертки, выберите желаемую амплитуду колебаний, нажмите кнопку фазы использования и нажмите авто. Настройте кантилевер близко к максимуму своего первого свободного резонанса колебаний примерно до 300 килогерц для кантилевера с пружинной константой 40 ньютонов на метр.Поместите образец на держатель образца. Нажмите область сканирования и установите разрешение между 256 на 256 и 1024 на 1024 пикселей, а затем установить размер сканирования и число пикселей. Установите скорость сканирования до 0,3 к одному герцу для сканирования области от одного на один до пяти на пять микрометров в квадрате.Сосредоточьте оптический вид на образец и нажмите на подход, чтобы приблизиться к поверхности образца. Затем нажмите поднимите 100 микрометров, чтобы поднять наконечник AFM на 100 микрометров над поверхностью образца и нажмите расширить оптическое изображение образца. Нажмите на бар фокус-сцены, чтобы сосредоточить представление на поверхности образца и использовать стрелки для перемещения в области образца интереса.Нажмите подход, чтобы привлечь поверхности и нажмите линии сканирования, чтобы проверить, если кончик следует поверхности хорошо. Отрегулируйте установленную точку по мере необходимости. Затем нажмите сканирование, чтобы начать визуализацию поверхности образца, поддерживая постоянный режим фазовой смены, не превышающей дельту 20 во время изображения, чтобы избежать большой силы изображения и поддерживать согласованность между независимыми образцами.Для ИК-наноспектроскопии изображения, за 30 до 60 минут до анализа, включите ИК-систему AFM и ИК-лазер. Откройте встроенное программное обеспечение для управления инструментом и нажмите файл и новый, чтобы открыть новый иК-файл nano. Нажмите инициализировать, чтобы начать систему ИК AFM и открыть крышку инструмента.Намонтировать силиконовый золотой зонд с номинальным радиусом 30 нанометров и пружинной константой 0,2 ньютона на метр на ИК-систему AFM для измерения образца в контактном режиме. Нажмите нагрузки в разделе зонда AFM и далее. Используйте акцент на стрелки зонда, чтобы сосредоточить камеру на кантилевере и использовать наконечник для перекрестия, чтобы поместить перекрестие в конце кантилевера.Поверните ручки, контролирующие положение лазера обнаружения, чтобы распоидать лазер в конце кантилевера. Поверните лазерные ручки, чтобы обнаружить и максимизировать сумму, измеренную четырех квадрантным фото диодом, до значения, больше трех вольт. Поверните ручку отклонения, чтобы настроить отклонение кантилевера до минус одного вольта и нажмите дальше.Затем закройте крышку инструмента. Используйте фокус на стрелки зонда, чтобы сосредоточить камеру на образец и наконечник для перекрестия стрелки двигаться в области интересов образца. Нажмите дальше и заниматься.В окне микроскопа выберите высоту для морфологии, амплитуду две для поглощения ИК и частоту PLL, чтобы сопоставить наконечник для образца контактного резонанса. В разделе AFM установите параметры, продемонстрированные для изображения AFM, и нажмите на сканирование, чтобы получить карту морфологии. Когда морфология отображение закончено, в окне микроскопа, нажмите карту высоты, чтобы распоставить зонд на верхней части одного агрегата.В разделе ИК нано нажмите кнопку "Начать ИК", чтобы осветить образец ИК-лазером. Чтобы сфокусировать инфракрасный лазер на кантилевере, нажмите оптимизацию и введите 1655 сантиметров для волнового света. Нажмите добавить и сканировать, чтобы определить положение ИК-лазера и нажмите обновление и хорошо, чтобы выровнять свое положение с cantilever.В общем разделе введите волновой номер, для которого ожидается высокая абсорбация в относительном поле, и деактивировать опцию фильтра прохода полосы. Нажмите начать ИК затем проверить показания счетчика и FFT реакции кантилевера. В окне FFT переместите зеленый курсор, чтобы прочитать резонансную частоту кантилевера.Типичное значение FFT резонанса кантилеверов составляет около 200 килогерц. Введите генерируемое значение частоты резонанса в общем разделе в поле центра частоты и используйте частотное окно 50 килогерц. Нажмите лазерного импульса настроить окно, чтобы выбрать резонанс расширенный режим и установить скорость пульса 222 килогерц, диапазон настройки 50 килогерц и лазерный цикл службы 5%Нажмите приобрести, чтобы подмести пульс лазера.Используйте курсор для настройки лазерного импульса на частоту механической реакции теплового расширения образца, поглощая ИК-свет. Затем выберите фазу заблокирован цикл для мониторинга контактного резонанса между образцом и кончиком и нажмите ноль. Для других химических свойств в нано-масштабе, отслеживать контактный резонанс во время приобретения спектров, чтобы гарантировать, что спектр образца не зависит от перегрева и размягчения.Выберите позволяют отслеживать образец наконечник контакт резонанса и выбрать интегральный выигрыш 0,5 и пропорциональное увеличение 10 затем нажмите OK. В окне оптимизации щелкните длину волны и сканируйте, чтобы найти ИК-лазер по крайней мере для трех волновых намерий, соответствующих основным диапазонам абсорбанса образца и по крайней мере для одного волнового номера для каждого чипа лазера. Нажмите инструменты, ИК фон калибровки и новые, и установить волновые намерия между 1200 и 1800 сантиметров. Установите фоны в среднем до одного, цикл службы 5%и скорость развертки до 100 сантиметров в квадрате.Нажмите приобрести для измерения ИК лазерного фона для нормализации измеренной нано шкалы локализованных спектров, сохранить файл и закрыть окно. В ИК-спектрах выберите разрешение ИК-спектра от одного до четырех сантиметров и ряд со-средних показателей не менее 64 раз. Затем нажмите приобрести для измерения нано-шкалы локализованного спектра ИК в диапазоне белка.Чтобы получить наномасштабную химическую карту, выберите 1655 сантиметров и ИК-изображения и нажмите сканирование в окне сканирования AFM. Когда отображение будет завершено, сохраните измерения. Затем используйте встроенное программное обеспечение для обработки изображений AFM для анализа приобретенных карт морфологии, контактного резонанса и химии и локализованных спектров наномасштаба.Это критический шаг для получения очень чистого мономерного решения, так как наличие агрегированных видов может привести к плохой воспроизводимости кинетики и ввести артефакты в ваши измерения. Фундаментальным фактором для успешного изучения биологических образцов, которые имеют высокую неоднородность, является правильное положение твердых субстратов. Микрофлюидное осаждение брызг может быть использовано вместо ручного, чтобы сохранить архитектуру образца и неоднородность.Эти методы прокладывают путь для распутывания химической структуры и свойств отдельных биомолекул и их взаимодействия в физиологической и родной жидкой среде.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Обогащение моющего средства нерастворимого белка агрегатов от мозга человека посмертный

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Белка инфракрасный электрохимии фильм продемонстрировано [NiFe] Hydrogenase для изучения окисления2 H

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Спектроскопия силы одного белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

ДНК-полимераза деятельности пробирного с использованием флуоресцентных помечены ДНК ближней ИК-области визуализирована электрофорезом геля акриламида

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Анализ отклонений β-амилоид индуцированной фибринового сгустка структуры спектроскопии и растровая электронная микроскопия

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Проверка структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии изображений

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...