Name: in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure
Uploaded: 2019-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure at JoVE.com

Deze studie wordt gefinancierd door het Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award en NIEHS R01ES028829 (naar K. M. G). We willen Dr. Dianne Walters (departement fysiologie, ECU) bedanken voor haar hulp bij het verkrijgen van representatieve beelden van alveolaire macrofagen.

Alle methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de East Carolina University.
1. ozon (O3) en gefilterde lucht blootstellingen (dag 1)
<ol><li>Plaats een maximum van 12 vrouwelijke C57BL/6J muizen, 8-12 weken oud, in een stalen kooi (met 12 afzonderlijke compartimenten) met gaas deksels in een O3 belichtings kamer.</li>
	<li>Plaats de thermometer in de belichtings kamer met de kooi om de temperatuur en vochtigheid nauwkeu...

<ol>
	<li>Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+macrophages+as+the+guardians+of+tissue+repair+in+the+lung.">Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung.</a> Immunology and Cell Biology. , (2019).</li><li>Gregoire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+efferocytosis+and+neutrophil+extracellular+trap+clearance+by+macrophages+in+ARDS.">Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS.</a> European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).</li><li>Fan, E. K. Y., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alveolar+macrophage+death+in+acute+lung+inflammation.">Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation.</a> Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).</li><li>Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+dying+cells+and+autoimmunity.">Clearance of dying cells and autoimmunity.</a> Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).</li><li>Bhattacharya, J., Westphalen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-epithelial+interactions+in+pulmonary+alveoli.">Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli.</a> Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).</li><li>Donnelly, L. E., Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+in+airways+disease.">Defective phagocytosis in airways disease.</a> Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).</li><li>Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+efferocytosis+by+alveolar+macrophages+in+IPF+patients.">Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients.</a> Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).</li><li>Vandivier, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibits+phagocytosis+of+apoptotic+cells+with+proinflammatory+consequences.">Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).</li><li>Grabiec, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+airway+macrophage+expression+of+the+Axl+receptor+tyrosine+kinase+is+associated+with+defective+efferocytosis+in+asthma.">Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).</li><li>Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+released+by+apoptotic+T+cells+contributes+to+an+immunosuppressive+milieu.">TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu.</a> Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).</li><li>Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiinflammatory+effects+of+CD95+ligand+(FasL)-induced+apoptosis.">Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).</li><li>O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+beta-cells+is+reduced+in+neonatal+autoimmune+diabetes-prone+rats.">Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats.</a> Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).</li><li>Shen, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mineralocorticoid+Receptor+Deficiency+in+Macrophages+Inhibits+Atherosclerosis+by+Affecting+Foam+Cell+Formation+and+Efferocytosis.">Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).</li><li>Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophages+in+the+Resolution+of+Inflammation,+Tissue+Repair,+and+Tolerance+to+Infection.">Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).</li><li>Hamon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bushfire+smoke+is+pro-inflammatory+and+suppresses+macrophage+phagocytic+function.">Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function.</a> Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).</li><li>Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+as+a+regulator+of+macrophage+chemokine+receptor+expression+and+polarization.">Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization.</a> European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).</li><li>Karaji, N., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+of+Pathogen-Infected+Cells.">Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).</li><li>Brouckaert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+necrotic+cells+by+macrophages+is+phosphatidylserine+dependent+and+does+not+induce+inflammatory+cytokine+production.">Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).</li><li>Gonzalez-Guevara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+ozone+induces+a+systemic+inflammatory+response:+possible+source+of+the+neurological+alterations+induced+by+this+gas.">Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas.</a> Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).</li><li>Robertson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+mediates+endothelial+dysfunction+downstream+of+circulating+factors+induced+by+O3+exposure.">CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure.</a> Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).</li><li>Kilburg-Basnyat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+Pro-Resolving+Lipid+Mediators+Regulate+Ozone-Induced+Pulmonary+and+Systemic+Inflammation.">Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation.</a> Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).</li><li>Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+ozone+on+immune+function.">The effects of ozone on immune function.</a> Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).</li><li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone.">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li><li>Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+In+Vitro+Culture+of+Murine+and+Human+Alveolar+Macrophages.">Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+SR-BI+mediates+efferocytosis+via+Src/PI3K/Rac1+signaling+and+reduces+atherosclerotic+lesion+necrosis.">Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis.</a> Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).</li><li>Coe, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-23+is+a+negative+regulator+of+prenatal+and+postnatal+erythropoiesis.">FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).</li><li>Yong, W. K., Abd Malek, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthohumol+induces+growth+inhibition+and+apoptosis+in+ca+ski+human+cervical+cancer+cells.">Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).</li><li>Van de Laar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+Sac+Macrophages,+Fetal+Liver,+and+Adult+Monocytes+Can+Colonize+an+Empty+Niche+and+Develop+into+Functional+Tissue-Resident+Macrophages.">Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages.</a> Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+and+resident+liver+macrophages+display+unique+transcriptomic+signatures+but+similar+biological+functions.">Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions.</a> Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. , (2019).</li><li>Crowther, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+surfactant+protein+a+inhibits+macrophage+reactive+oxygen+intermediate+production+in+response+to+stimuli+by+reducing+NADPH+oxidase+activity.">Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity.</a> Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).</li><li>Silveyra, P., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variant+associations+of+human+SP-A+and+SP-D+with+acute+and+chronic+lung+injury.">Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury.</a> Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).</li><li>Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+protein+A+enhances+alveolar+macrophage+phagocytosis+of+apoptotic+neutrophils.">Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils.</a> Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).</li><li>Gomez Perdiguero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Nebbioso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+analysis+of+DNA-protein+interactions+in+living+cells+by+UV+laser+pulses.">Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).</li><li>Novak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+different+UV-emitting+light+sources+in+the+induction+of+T-cell+apoptosis.">Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis.</a> Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).</li><li>Park, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAI-1+inhibits+neutrophil+efferocytosis.">PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).</li><li>Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+susceptibility+to+ozone-induced+lung+hyperpermeability:+role+of+toll-like+receptor+4.">Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).</li><li>Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variability+in+the+development+of+pulmonary+tolerance+to+inhaled+pollutants+in+inbred+mice.">Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).</li></ol>

Efferocytose is een ontstekingsremmend proces waarbij macrofagen de apoptotische cellen en het puin duidelijk maken en meerdere ontstekingsremmende mediatoren9,10,11,12,16 ,18. Meerdere modellen van efferocytose hebben inzicht gegeven in hoe de macrofaag een kritieke cel is in de resolutie van ontsteking6</...

De Long wordt voortdurend blootgesteld aan milieu-beledigingen, waaronder lucht deeltjes, virussen, bacteriën en oxidanten gassen die leiden tot pulmonale ontstekingen1,2,3. Deze beledigingen kunnen gas uitwisseling in gevaar brengen en induceren onomkeerbaar weefsel letsel4,5. Alveolaire macrofagen, die ongeveer 95% van de immuuncellen in de muriene en menselijke longen in de homeostase vormen, zijn kritische regulatoren van pulmonale ontsteking na milieu-insulten1,2, 3,4,5. Alveolaire macrofagen zijn essentieel tijdens de host verdediging door fagocytizing en elimineren van pathogenen. Onlangs, alveolaire macrofagen is aangetoond dat het bevorderen van weefselhomeostase en de resolutie van ontsteking door efferocytose6,7. Efferocytose is een fagocytisch proces waarbij macrofagen de apoptotische cellen8,9,10overspoelen en elimineren. Efferocytose resulteert ook in de productie van mediatoren (dat wil zeggen, Il-10, TGF-β, PGE2, en stikstofmonoxide) die het proces verder vergroten, resulterend in de resolutie van de ontsteking9,10,11 ,12,16,18. Dit proces is noodzakelijk voor het voorkomen van secundaire necrose en bevordering van weefselhomeostase12,13,14. Verschillende studies hebben een verstoorde efferocytose met verschillende chronische longziekten, waaronder astma, chronische obstructieve longziekte, en idiopathische pulmonale fibrose8,9,15, 16,17.
O3 is een criterium luchtverontreiniging die de incidentie van chronische longziekten19,20,21vererveert en verhoogt. O3 induceert pulmonale ontsteking en letsel en is gekend om de aantasting van alveolaire macrofaag fagocytose van bacteriële pathogenen22,23. Het is echter niet bekend of O3 de alveolaire macrofaag efferocytose schaadt. Onderzoeken van O3-geïnduceerde veranderingen in alveolaire macrofaag efferocytose zal potentiële inzicht geven in hoe blootstelling kan leiden tot chronische longziekte incidentie en exacerbatie. Hieronder beschreven is een eenvoudige methode om alveolaire macrofaag efferocytose in de longen van vrouwelijke muizen te evalueren na blootstelling aan acute O3 .
De beschreven methode bezit verschillende voordelen ten opzichte van andere efferocytose-protocollen die vaak worden gebruikt in het veld door het elimineren van het gebruik van dure fluorescerende kleurstoffen, uitgebreide Flowcytometrie-metingen en ex vivo-manipulatie van alveolaire macrofagen24 ,25. Daarnaast meet dit protocol alveolaire macrofaag efferocytose in de context van de Long microomgeving, die de macrofaag functie kan beïnvloeden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Kit</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>4830-250-K&#160;</td>
			<td>The TACS&#160;Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2 Jurkat T Cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-2899</td>
			<td>The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff&#160; Reagent 2, Eosin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990706</td>
			<td>Eosin staining that stains cytoplasm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 1, Fixative</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990705</td>
			<td>Fixes cells to be stained by H&#38;E.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990707</td>
			<td>Methylene Blue staining that stains the nucleus.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td>RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker</td>
			<td>Cambridge Scientific&#160;</td>
			<td>16659</td>
			<td>The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T400 ultraviolet light photometer&#160;</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T400</td>
			<td>The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T703 Ozone calibrator</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T703</td>
			<td>Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure

Ozon (O3) is een criterium luchtverontreiniging die de incidentie van chronische longziekten vererveert en verhoogt. O3 blootstelling is bekend voor het induceren van pulmonale ontsteking, maar er is weinig bekend over hoe blootstelling processen belangrijk voor de resolutie van ontsteking verandert. Efferocytose is een proces van de afwikkeling, waarbij macrofagen fagocytize apoptotic cellen. Het doel van dit protocol is het meten van alveolaire macrofaag efferocytose na O3-geïnduceerde long letsel en ontsteking. Er zijn verschillende methoden beschreven voor het meten van efferocytose; echter, de meeste vereisen ex vivo manipulaties. In detail beschreven hier is een protocol voor het meten in vivo alveolaire macrofaag efferocytose 24 h na O3 blootstelling, die ex vivo manipulatie van macrofagen vermijdt en dient als een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om nauwkeurig te vertegenwoordigen perturbaties in Dit afwikkelingsproces. Het protocol is een technisch niet-intensieve en relatief goedkope methode waarbij hele lichaam O3 inademing gevolgd door orofaryngeale aspiratie van apoptotic cellen (dat wil zeggen, Jurkat T cellen) terwijl onder algemene anesthesie. Alveolaire macrofaag efferocytose wordt vervolgens gemeten aan de hand van een lichte microscopie van de macrofagen verzameld uit bronchoalveolaire (bal) lavage. Efferocytose wordt uiteindelijk gemeten door berekening van een efferocytische index. Collectief, de beschreven methoden kwantificeren efferocytische activiteit in de longen in vivo terwijl ook dienen voor het analyseren van de negatieve gezondheidseffecten van O3 of andere geïnhaleerde insulten.

O3 blootstelling is bekend voor het opwekken van pulmonale ontsteking en letsel, en efferocytose is vereist voor het handhaven van weefselhomeostase. C57BL/6j vrouwelijke muizen werden blootgesteld aan gefilterde lucht (FA) of 1 ppm O3 voor 3 uur en geobduceerd 24 h na-blootstelling om pulmonale ontsteking en letsel te onderzoeken. O3-blootgestelde muizen hebben een significante toename van macrofagen en neutrofielen in het luchtruim weergegeven in vergeli...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure at JoVE.com

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Dit manuscript beschrijft een protocol om te bepalen of blootstelling aan ozon, een criterium luchtverontreinigende stof, in vivo alveolaire macrofaag-efferocytose belemmert. Dit protocol maakt gebruik van veelgebruikte reagentia en technieken en kan worden aangepast aan meerdere modellen van long letsel om de effecten op alveolaire macrofaag efferocytose te bepalen.

In vivo beoordeling van alveolaire macrofaag Efferocytose na blootstelling aan ozon

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Het hier beschreven protocol meet longmacrophage-efferocytose na blootstelling aan een criterium dat luchtverontreinigende stoffen ozon hebben. Deze gegevens geven aan dat blootstelling aan ozon de alveololische macrofaag-efferocytose vermindert en dus een mechanisme kan zijn waarom verhoogde ozonniveaus de incidentie van longziekten verhogen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een in vivo beoordeling van alveolaat macrofaag efferocytose mogelijk maakt zonder enige ex vivo manipulaties van de macrofagen die hun fenotype of functie kunnen veranderen.Deze techniek heeft een nieuw mechanisme onthuld waarmee de long zichzelf niet kan herstellen na blootstelling aan luchtvervuiling. Bovendien kan deze techniek nieuwe paden onthullen naar doelen die efferocytose in de long veranderen. Deze methode kan worden toegepast op elk model van longletsel of ontsteking.Echter, de gebruiker zal moeten optimaliseren wanneer het het beste is om efferocytose te beoordelen na longletsel. Het uitvoeren van de oropharyngeal aspiratie kan technisch uitdagend zijn. Ik zou adviseren om samen met uw veterinair personeel om ervoor te zorgen dat u uw techniek hebt geoptimaliseerd om deze procedure uit te voeren.Begin met het kweken van Jurkat T-cellen in basale celkweekmedium aangevuld volgens de handschriftrichtingen bij 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Jurkat T cellen zijn een suspensie cel lijn die kan worden gehandhaafd door het passeren van het passeren in voorverwarmde culturing media om de drie dagen. Bereid apoptotische cellen door ze te laten groeien tot 90%-samenvloeiing, wat drie tot vier dagen na het doorgeven duurt.Kweek cellen in vijf T75 kolven om een voldoende aantal cellen te verkrijgen voor dit protocol. Zodra de cellen klaar zijn, aspirate de fles inhoud ongeveer 24 milliliter en breng ze naar een 50 milliliter conische buis. Tel de cellen met behulp van Trypan Blue kleuring en een hemocytometer.Pellet de cellen door centrifugatie op 271 keer g gedurende vijf minuten en gooi de supernatant. Vervolgens, resuspend de cellen in de media om drie miljoen cellen per milliliter te verkrijgen. Aliquot de cellen in 100 bij 20 millimeter weefsel cultuur gerechten door de overdracht van vijf milliliter cellen per schotel.Bereid ongeveer negen cultuurgerechten. Zet een schotel opzij als een onbelichte controle en bloot de resterende gerechten aan UV. Stel de UV-crosslinker in op het juiste energieniveau door op de energieknop te drukken en 600 in te voeren met het nummerpad. Bestralen alle gerechten met de cellen, behalve voor de controle ervoor te zorgen dat de bovenste deksel van het weefsel cultuur schotel te verwijderen tijdens UV-blootstelling.Dan, inculbateren alle gerechten in een cel cultuur incubator op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide voor vier uur. Combineer na de incubatie alle bestraalde cellen in een conische buis van 50 milliliter en pellet ze door middel van centrifugatie op 271 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de cellen in 24 milliliter steriele PBS.Centrifuge de buis opnieuw en verwijder de supernatant. Bereid de cellen voor op het doseren van muizen door ze opnieuw in PBS op de juiste concentratie. Zodra de muis goed is verdoofd, plaats deze in een semi-ligfiets supine positie.Gebruik chirurgische string gebonden tussen pinnen op een schuine acryl plaat om de muis op te schorten door de maxillaire snijtanden. Gebruik een paar stompe niet-geribbelde tangen om de muistong licht vast te grijpen en te trekken en de apoptotische cellen in de mondholte te druppelen met een P200 pipet. Dosering is succesvol wanneer muizen een knetterend geluid een tot twee seconden na ontvangst van de dosis.Bedek met een gehandschoende vinger voorzichtig de neus van de muis totdat deze inademt terwijl de tong wordt ingetrokken. Houd de neus bedekt totdat er geen vloeistof zichtbaar is in de mondholte en de muis twee of meer inhalaties heeft ingenomen. Verwijder de muis van het inentingsbord en breng hem terug naar de kooi om hem te laten herstellen van anesthesie om ervoor te zorgen dat de muis op zijn rug wordt geplaatst om te voorkomen dat vuil de nares blokkeert.Nadat alle muizen zijn ontwaakt uit anesthesie, wacht 90 minuten om alveolaire macrofagen toe te staan om de toestroom van apoptotische cellen te overspoelen. Om lavage vloeistof te verzamelen, bereid de geëuthanaseerde muis volgens de handschrift richtingen. Langzaam duwen PBS in de longen waardoor ze op te blazen, trek dan hetzelfde volume terug uit ervoor te zorgen dat de PBS is niet verlaten van de neusgaten.Verzamel de gepoolde lavage van elke muis in een 15 milliliter buis. Centrifugeer de bronchoalveolaire lavage of BAL op 610 keer g gedurende zes minuten bij vier graden Celsius, verzamel het supernatant in een buis van 1,5 milliliter en vries deze in bij min 80 graden Celsius. De pellet vertegenwoordigt de cellen uit de bronchoalveolaire ruimte.Voeg een milliliter ACK rode bloedcel lyse buffer aan de pellet om de resterende rode bloedcellen te verwijderen. Vortex en lyse voor een minuut op ijs, voeg dan vier milliliter PBS om de lyse reactie te stoppen. Centrifugeer de cellen op 610 keer g gedurende zes minuten bij vier graden Celsius en aspirate de supernatant met een vacuüm aspirator.Dan, resuspend de cellen in een milliliter PBS met 10%FBS en tel de cellen op een hemocytometer zonder Trypan Blue. Centrifuge 120 microliter van elk monster op dia's op 12 keer g gedurende drie minuten met behulp van medium acceleratie en een cytocentrifuge. Laat de glijbanen 's nachts drogen.De volgende dag, vlek de dia's met hematoxylin en eosine om zowel efferocytische en differentiële cel telt te berekenen. Bekijk vervolgens dia's onder een Brightfield-instelling op een biologische microscoop met behulp van een doelstelling van 20X of 40X. Bereken de efferocytische index op basis van de verhouding van alveolaire macrofagen die apoptotische Jurkat T-cellen hebben geprotot tot alveolaire macrofagen zonder apoptotische celopname, zodat ten minste 200 cellen van elke dia worden geteld.Dit protocol werd gebruikt om het effect van blootstelling aan ozon op longontsteking te onderzoeken. Ozon blootgestelde muizen vertoonden een toename van macrofagen en neutrofielen in het luchtruim in vergelijking met de gefilterde luchtcontrolegroep en hadden een toename van BAL-eiwit, een marker van alveolaire epitheliale disfunctie. Voorafgaand aan het doseren van de muizen werd apoptose in Jurkat T-cellen bevestigd met stroomcytometrie.De 60 milli joule UV-blootstelling niveau en vier uur incubatietijd resulteerde in repetitieve resultaten van ongeveer 75% apoptotische cellen. Efferocytische macrofagen werden geïdentificeerd als macrofagen die een Jurkat T-cel hadden overspoeld in vergelijking met reguliere alveolaire macrofagen. Er was een aanzienlijke daling van de efferocytische index van de ozongeblote groep in vergelijking met de gefilterde luchtcontroles, wat aangeeft dat door ozon geïnduceerde longontsteking gepaard gaat met verminderde klaring van apoptotische cellen.Aandacht voor detail en het opschrijven van eventuele waargenomen verschillen is van cruciaal belang tijdens deze procedure. Het wordt ook aanbevolen om de monsters blind voor analyse en hebben twee verschillende mensen tellen de macrofagen. Na isolatie kunnen de BAL-cellen worden gebruikt voor mRNA-analyse, gekleurd voor extra markers door immunofluorescentie, en/of op een stroomcytometer worden uitgevoerd om fenotypische veranderingen te onderscheiden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Het gebruik van TL-Target Arrays voor het beoordelen van de T-cel responsen<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravitale Microscopie Imaging van de lever volgende<em&gt; Leishmania</em&gt; Infectie: een beoordeling van de lever Hemodynamica

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In vivo evaluatie van het knaagdier Plasmodium parasitemia en merozoïet Invasion van flowcytometrie

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometrische analyse van deeltjes gebonden Bet v 1 allergeen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magneetroerder werkwijze voor de detectie van<em&gt; Trichinella</em&gt; Larven in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Beoordeling van antilichaam gebaseerde Drugs gevolgen voor lymfkliertest beenmerg en peritoneale Macrophage activering

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...