Name: in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure
Uploaded: 2019-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure at JoVE.com

Questo studio è finanziato dal premio Walter A. Rosenblith Award e dal NIEHS R01ES028829 (a K. M. G). Ringraziamo la dott.ssa Dianne Walters (Dipartimento di Fisiologia, ECU) per la sua assistenza nell'ottenere immagini rappresentative dei macrofagi alveolar.

Tutti i metodi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della East Carolina University.
1. Ozono (O3)e esposizioni all'aria filtrate (giorno 1)
<ol><li>Collocare un massimo di 12 topi C57BL/6J femminili, di 8-12 settimane, in una gabbia d'acciaio (con 12 scomparti separati) con coperchi a rete metallica in una camera di esposizione O3.</li>
	<li>Posizionare il termometro nella camera di esposizione con la gabbia per registrare con pr...

<ol>
	<li>Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+macrophages+as+the+guardians+of+tissue+repair+in+the+lung.">Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung.</a> Immunology and Cell Biology. , (2019).</li><li>Gregoire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+efferocytosis+and+neutrophil+extracellular+trap+clearance+by+macrophages+in+ARDS.">Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS.</a> European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).</li><li>Fan, E. K. Y., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alveolar+macrophage+death+in+acute+lung+inflammation.">Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation.</a> Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).</li><li>Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+dying+cells+and+autoimmunity.">Clearance of dying cells and autoimmunity.</a> Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).</li><li>Bhattacharya, J., Westphalen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-epithelial+interactions+in+pulmonary+alveoli.">Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli.</a> Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).</li><li>Donnelly, L. E., Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+in+airways+disease.">Defective phagocytosis in airways disease.</a> Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).</li><li>Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+efferocytosis+by+alveolar+macrophages+in+IPF+patients.">Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients.</a> Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).</li><li>Vandivier, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibits+phagocytosis+of+apoptotic+cells+with+proinflammatory+consequences.">Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).</li><li>Grabiec, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+airway+macrophage+expression+of+the+Axl+receptor+tyrosine+kinase+is+associated+with+defective+efferocytosis+in+asthma.">Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).</li><li>Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+released+by+apoptotic+T+cells+contributes+to+an+immunosuppressive+milieu.">TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu.</a> Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).</li><li>Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiinflammatory+effects+of+CD95+ligand+(FasL)-induced+apoptosis.">Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).</li><li>O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+beta-cells+is+reduced+in+neonatal+autoimmune+diabetes-prone+rats.">Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats.</a> Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).</li><li>Shen, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mineralocorticoid+Receptor+Deficiency+in+Macrophages+Inhibits+Atherosclerosis+by+Affecting+Foam+Cell+Formation+and+Efferocytosis.">Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).</li><li>Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophages+in+the+Resolution+of+Inflammation,+Tissue+Repair,+and+Tolerance+to+Infection.">Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).</li><li>Hamon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bushfire+smoke+is+pro-inflammatory+and+suppresses+macrophage+phagocytic+function.">Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function.</a> Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).</li><li>Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+as+a+regulator+of+macrophage+chemokine+receptor+expression+and+polarization.">Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization.</a> European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).</li><li>Karaji, N., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+of+Pathogen-Infected+Cells.">Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).</li><li>Brouckaert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+necrotic+cells+by+macrophages+is+phosphatidylserine+dependent+and+does+not+induce+inflammatory+cytokine+production.">Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).</li><li>Gonzalez-Guevara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+ozone+induces+a+systemic+inflammatory+response:+possible+source+of+the+neurological+alterations+induced+by+this+gas.">Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas.</a> Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).</li><li>Robertson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+mediates+endothelial+dysfunction+downstream+of+circulating+factors+induced+by+O3+exposure.">CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure.</a> Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).</li><li>Kilburg-Basnyat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+Pro-Resolving+Lipid+Mediators+Regulate+Ozone-Induced+Pulmonary+and+Systemic+Inflammation.">Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation.</a> Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).</li><li>Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+ozone+on+immune+function.">The effects of ozone on immune function.</a> Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).</li><li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone.">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li><li>Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+In+Vitro+Culture+of+Murine+and+Human+Alveolar+Macrophages.">Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+SR-BI+mediates+efferocytosis+via+Src/PI3K/Rac1+signaling+and+reduces+atherosclerotic+lesion+necrosis.">Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis.</a> Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).</li><li>Coe, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-23+is+a+negative+regulator+of+prenatal+and+postnatal+erythropoiesis.">FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).</li><li>Yong, W. K., Abd Malek, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthohumol+induces+growth+inhibition+and+apoptosis+in+ca+ski+human+cervical+cancer+cells.">Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).</li><li>Van de Laar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+Sac+Macrophages,+Fetal+Liver,+and+Adult+Monocytes+Can+Colonize+an+Empty+Niche+and+Develop+into+Functional+Tissue-Resident+Macrophages.">Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages.</a> Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+and+resident+liver+macrophages+display+unique+transcriptomic+signatures+but+similar+biological+functions.">Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions.</a> Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. , (2019).</li><li>Crowther, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+surfactant+protein+a+inhibits+macrophage+reactive+oxygen+intermediate+production+in+response+to+stimuli+by+reducing+NADPH+oxidase+activity.">Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity.</a> Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).</li><li>Silveyra, P., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variant+associations+of+human+SP-A+and+SP-D+with+acute+and+chronic+lung+injury.">Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury.</a> Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).</li><li>Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+protein+A+enhances+alveolar+macrophage+phagocytosis+of+apoptotic+neutrophils.">Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils.</a> Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).</li><li>Gomez Perdiguero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Nebbioso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+analysis+of+DNA-protein+interactions+in+living+cells+by+UV+laser+pulses.">Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).</li><li>Novak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+different+UV-emitting+light+sources+in+the+induction+of+T-cell+apoptosis.">Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis.</a> Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).</li><li>Park, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAI-1+inhibits+neutrophil+efferocytosis.">PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).</li><li>Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+susceptibility+to+ozone-induced+lung+hyperpermeability:+role+of+toll-like+receptor+4.">Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).</li><li>Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variability+in+the+development+of+pulmonary+tolerance+to+inhaled+pollutants+in+inbred+mice.">Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).</li></ol>

L'efferocitosi è un processo antinfiammatorio in cui i macrofagi eliminano le cellule apoptotiche e i detriti, nonché producono più mediatori antinfiammatori9,10,11,12,16 ,18. Diversi modelli di efferocitosi hanno fornito informazioni su come il macrofago sia una cellula critica nella risoluzione dell'infiammazione<sup cl...

Il polmone è costantemente esposto a insulti ambientali, tra cui particolato d'aria, virus, batteri e gas ossidanti che innescano l'infiammazione polmonare1,2,3. Questi insulti possono compromettere lo scambio di gas e indurre lesioni vissutali irreversibili4,5. I macrofagi alveolar, che costituiscono circa il 95% delle cellule immunitarie presenti nei polmoni murini e umani all'omeostasi, sono regolatori critici dell'infiammazione polmonare dopo gli insulti ambientali1,2, 3,4,5. I macrofagi alveolar sono essenziali durante la difesa dell'ospite facendo agoccitizzando ed eliminando gli agenti patogeni. Recentemente, i macrofagi alveolar hanno dimostrato di promuovere l'omeostasi dei tessuti e la risoluzione dell'infiammazione attraverso l'efferocitosi6,7. L'efferocitosi è un processo fagocitico in cui i macrofagi inghiottiscono ed eliminano le cellule apoptotiche8,9,10. L'efferocitosi si traduce anche nella produzione di mediatori (ad es. IL-10, TGF-z, PGE2e ossido nitrico) che aumentano ulteriormente il processo, con conseguente risoluzione di infiammazione9,10,11 ,12,16,18. Questo processo è necessario per prevenire la necrosi secondaria e promuovere l'omeostasi dei tessuti12,13,14. Diversi studi hanno collegato l'efferocitosi alterata con varie malattie polmonari croniche, tra cui asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva, e fibrosi polmonare idiopatica8,9,15, 16,17.
O3 è un criterio di inquinante atmosferico che esacerba e aumenta l'incidenza delle malattie polmonari croniche19,20,21. O3 induce infiammazione polmonare e lesioni ed è noto per compromettere la fagocitosi del macrofago alveo di patogeni batterici22,23. Tuttavia, non è noto se O3 imponga l'efferocitosi del macrofago alveolar. Lo studio delle alterazioni indotte da O3nell'efferocitosi del macrofalo alveo fornirà una possibile comprensione di come l'esposizione possa portare all'incidenza e all'esacerbazione delle malattie polmonari croniche. Descritto di seguito è un metodo semplice per valutare l'efferocitosi del macrofago alveolare nei polmoni dei topi femminili dopo l'esposizione acuta di O3. 
Il metodo delineato possiede diversi vantaggi rispetto ad altri protocolli di efferocitosi comunemente utilizzati sul campo eliminando l'uso di costosi coloranti fluorescenti, misurazioni di citometria a flusso estese e manipolazione ex vivo di macrofagi alveolar24 ,25. Inoltre, questo protocollo misura l'efferocitosi del macrofago alveolare nel contesto del microambiente polmonare, che può influenzare la funzione del macrofago.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Kit</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>4830-250-K&#160;</td>
			<td>The TACS&#160;Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2 Jurkat T Cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-2899</td>
			<td>The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff&#160; Reagent 2, Eosin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990706</td>
			<td>Eosin staining that stains cytoplasm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 1, Fixative</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990705</td>
			<td>Fixes cells to be stained by H&#38;E.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990707</td>
			<td>Methylene Blue staining that stains the nucleus.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td>RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker</td>
			<td>Cambridge Scientific&#160;</td>
			<td>16659</td>
			<td>The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T400 ultraviolet light photometer&#160;</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T400</td>
			<td>The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T703 Ozone calibrator</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T703</td>
			<td>Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure

L'ozono (O3)è un criterio di inquinamento atmosferico che esacerba e aumenta l'incidenza di malattie polmonari croniche. O3 esposizione è noto per indurre infiammazione polmonare, ma poco si sa per quanto riguarda come l'esposizione altera i processi importanti per la risoluzione dell'infiammazione. L'efferocitosi è un processo di risoluzione, in cui i macrofagi fagagocitizzano le cellule apoptotiche. Lo scopo di questo protocollo è quello di misurare l'efferocitosi del macrofago alveolare in seguito a una lesione polmonare e un'infiammazione polmonari indotta da O3. Sono stati descritti diversi metodi per misurare l'efferocitosi; tuttavia, la maggior parte richiede manipolazioni ex vivo. Descritto in dettaglio qui è un protocollo per misurare in vivo alveolare macrophage efferocytosis 24 h dopo l'esposizione O3, che evita la manipolazione ex vivo di macrofagi e serve come una semplice tecnica che può essere utilizzata per rappresentare con precisione le questo processo di risoluzione. Il protocollo è un metodo tecnicamente non intensivo e relativamente poco costoso che coinvolge l'inalazione di tutto il corpo O3 seguita dall'aspirazione orofanginale delle cellule apoptotiche (cioè, cellule T Jurkat) durante l'anestesia generale. L'efferocitosi del macrofago alveolar viene quindi misurata mediante la valutazione della microscopia leggera dei macrofagi raccolti dalla lavanda bronchoalveolar (BAL). L'efferocitosi viene infine misurata calcolando un indice efferocitico. Collettivamente, i metodi delineati quantificano l'attività efferocitica nel polmone in vivo, servendo anche per analizzare gli effetti negativi sulla salute di O3 o di altri insulti inalati.

O3 esposizione è noto per indurre infiammazione polmonare e lesioni, ed efferocitosi è necessaria per mantenere l'omeostasi dei tessuti. I topi femminili C57BL/6J sono stati esposti all'aria filtrata (FA) o 1 ppm O3 per 3 h e necropsie 24 h post-esposizione per esaminare l'infiammazione polmonare e le lesioni. O3-bambiniesposti hanno mostrato un aumento significativo dei macrofagi e neutrofili nello spazio aereo rispetto al gruppo di controllo FA (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure at JoVE.com

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Questo manoscritto descrive un protocollo per determinare se l'esposizione all'ozono, un criterio di inquinante dell'aria, imponga l'efferocitosi alveolar in vivo. Questo protocollo utilizza reagenti e tecniche di uso comune e può essere adattato a più modelli di lesione polmonare per determinare gli effetti sull'efferocitosi del macrofagio alveolar.

Valutazione In Vivo dell'efferocitosi del macrofago alveo dopo l'esposizione all'ozono

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Il protocollo qui descritto misura l'efferocitosi dei macrofagi polmonari dopo l'esposizione a criteri di ozono inquinante nell'aria. Questi dati indicano che l'esposizione all'ozono diminuisce l'efferocitosi macrofagia alveolare e potrebbe quindi essere un meccanismo per cui elevati livelli di ozono aumentano l'incidenza delle malattie polmonari. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una valutazione in vivo dell'efferocitosi macrofagia alveolare senza alcuna manipolazione ex vivo dei macrofagi che può alterare il loro fenotipo o funzione.Questa tecnica ha rivelato un nuovo meccanismo con cui il polmone non può ripararsi dopo l'esposizione all'inquinamento atmosferico. Inoltre, questa tecnica può rivelare nuove vie verso bersagli che alterano l'efferocitosi nel polmone. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi modello di lesione polmonare o infiammazione.Tuttavia, l'utente dovrà ottimizzare quando è meglio valutare l'efferocitosi dopo la lesione polmonare. Eseguire l'aspirazione orofaringea può essere tecnicamente impegnativo. Consiglierei di lavorare con il tuo personale veterinario per assicurarti di aver ottimizzato la tua tecnica per eseguire questa procedura.Inizia coltivando cellule Jurkat T in un mezzo di coltura cellulare basale integrato secondo le direzioni del manoscritto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Le celle Jurkat T sono una linea cellulare a sospensione che può essere mantenuta attraverso la passatura in mezzi di coltivazione pre-riscaldati ogni tre giorni. Preparare le cellule apoptotiche facendole crescere al 90% di confluenza che richiede da tre a quattro giorni dopo la passaging.Far crescere le cellule in cinque contenitori T75 per ottenere un numero sufficiente di celle per questo protocollo. Una volta che le cellule sono pronte, aspirare il contenuto del pallone di circa 24 millilitri e trasferirli in un tubo conico da 50 millilitri. Contare le cellule usando la colorazione Trypan Blue e un emocitometro.Pellettare le cellule per centrifugazione a 271 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante. Quindi, rimospendare le cellule nei media per ottenere tre milioni di cellule per millilitro. Aliquota le cellule in piatti di coltura tissutale da 100 per 20 millimetri trasferendo cinque millilitri di cellule per piatto.Preparare circa nove piatti della cultura. Mettere da parte un piatto come controllo non esposto ed esporre i piatti rimanenti ai raggi UV. Impostare il retino UV al livello di energia corretto premendo il pulsante energia e inserendo 600 con la tastiera numerica. Irradiare tutti i piatti con le cellule ad eccezione del controllo assicurandosi di rimuovere la copertura superiore del piatto di coltura tissutale durante l'esposizione ai raggi UV.Quindi, incubare tutti i piatti in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro ore. Dopo l'incubazione, unire tutte le cellule irradiate in un tubo conico da 50 millilitri e pelletarle per centrifugazione a 271 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 24 millilitri di PBS sterile.Centrifugare di nuovo il tubo e rimuovere il supernatante. Preparare le cellule per il dosamento dei topi riutilizzandoli in PBS alla concentrazione appropriata. Una volta che il mouse è correttamente anestetizzato, posizionarlo in una posizione supina semi-reclinata.Utilizzare una corda chirurgica legata tra pioli su un foglio di acrilico inclinato per sospendere il mouse dagli incisivi mascellari. Utilizzare un paio di pini smussati non increspati per afferrare e tirare leggermente la lingua del topo e infondere le cellule apoptotiche nella cavità orale con una pipetta P200. Il dosing ha successo quando i topi fanno un rumore scoppiettante da uno a due secondi dopo aver ricevuto la dose.Con un dito guantato, coprire delicatamente il naso del topo fino a quando non inala mentre la lingua è retratti. Tenere il naso coperto fino a quando non è visibile alcun liquido nella cavità orale e il mouse ha assunto due o più inalazioni. Rimuovere il mouse dalla tavola di inoculazione e restituirlo alla gabbia per consentirgli di riprendersi dall'anestesia assicurandosi di posizionare il mouse sulla schiena per evitare che i detriti blocchino i nares.Dopo che tutti i topi si sono svegliati dall'anestesia, attendere 90 minuti per consentire ai macrofagi alveolari di inghiottire l'afflusso di cellule apoptotiche. Per raccogliere il liquido di lavanda, preparare il topo eutanasiato secondo le indicazioni del manoscritto. Spingere lentamente pbs nei polmoni permettendo loro di gonfiarsi, quindi tirare indietro lo stesso volume assicurandosi che il PBS non esevolva dalle narici.Raccogliere la lavanda in piscina da ogni topo in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare il lavaggio broncoalveolare o BAL a 610 volte g per sei minuti a quattro gradi Celsius, raccogliere il supernatante in un tubo da 1,5 millilitri e congelarlo a meno 80 gradi Celsius. Il pellet rappresenta le cellule dello spazio broncoalveolare.Aggiungere un millilitro di tampone dilisi dei globuli rossi ACK al pellet per rimuovere i globuli rossi residui. Vortice e liscivie per un minuto sul ghiaccio, quindi aggiungere quattro millilitri di PBS per fermare la reazione di lisi. Centrifugare le cellule a 610 volte g per sei minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il supernatante con un aspiratore sottovuoto.Quindi, rimescolare le cellule in un millilitro di PBS con 10%FBS e contare le cellule su un emocitometro senza Trypan Blue. Centrifuga 120 microlitri di ogni campione su scivoli a 12 volte g per tre minuti utilizzando un'accelerazione media e un citocentrifugo. Lasciare asciugare gli scivoli durante la notte.Il giorno dopo, macchiare le diapositive con ematossilina ed eosina per calcolare sia il numero di cellule efferocitiche che differenziali. Quindi, visualizza le diapositive sotto un'impostazione Brightfield su un microscopio biologico utilizzando un obiettivo 20X o 40X. Calcolare l'indice efferocitico in base al rapporto tra macrofagi alveolari che hanno fagocitosto cellule Jurkat T apoptotiche a macrofagi alveolari senza assorbimento di cellule apoptotiche assicurandosi di contare almeno 200 cellule da ogni diapositiva.Questo protocollo è stato utilizzato per studiare l'effetto dell'esposizione all'ozono sull'infiammazione polmonare. I topi esposti all'ozono hanno mostrato un aumento dei macrofagi e dei neutrofili nello spazio aereo rispetto al gruppo di controllo dell'aria filtrato e hanno avuto un aumento della proteina BAL, un marcatore della disfunzione epiteliale alveolare. Prima di dosare i topi, l'apoptosi nelle cellule T di Jurkat è stata confermata con citometria a flusso.Il livello di esposizione ai raggi UV di 60 milli joule e il tempo di incubazione di quattro ore hanno portato a risultati ripetitivi di circa il 75% di cellule apoptotiche. I macrofagi efferocitici sono stati identificati come macrofagi che avevano inghiottito una cellula Jurkat T rispetto ai normali macrofagi alveolari. L'indice efferocitico del gruppo esposto all'ozono è diminuito in modo significativo rispetto ai controlli dell'aria filtrati, il che indica che l'infiammazione polmonare indotta dall'ozono è associata a una diminuzione della clearance delle cellule apoptotiche.L'attenzione ai dettagli e la scrittura di eventuali differenze osservate è fondamentale durante questa procedura. Si consiglia inoltre di accecare i campioni per l'analisi e fare in modo che due persone diverse contino i macrofagi. Dopo l'isolamento, le cellule BAL possono essere utilizzate per l'analisi dell'mRNA, macchiate per marcatori aggiuntivi per immunofluorescenza e /o eseguite su un citometro a flusso per distinguere i cambiamenti fenotipiche.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

L&#39;uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravitale Microscopia Imaging del Fegato seguente<em&gt; Leishmania</em&gt; Infezione: Valutazione della epatiche Emodinamica

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Valutazione del roditore Plasmodium parassitemia e merozoite Invasion di Citometria a flusso

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flusso analisi di citometria di Particle-bound Bet v 1 allergene in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Metodo dell&#39;agitatore magnetico per la rilevazione di<em&gt; Trichinella</em&gt; Le larve in campioni di muscolo

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...