Name: in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure
Uploaded: 2019-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure at JoVE.com

この研究は、健康効果研究所ウォルターA.ローゼンブリス賞とNIEHS R01ES028829(K.M.Gに)によって資金提供されています。肺胞マクロファージの代表的な画像を得る支援をいただいたダイアン・ウォルターズ博士(ECU生理学科)に感謝します。

すべての方法は、イーストカロライナ大学の機関動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. オゾン(O3)とろ過空気暴露(1日目)
<ol><li>最大12匹のメスC57BL/6Jマウス(生後8~12週齢)を、金網蓋付きのスチールケージ(12個の別々のコンパートメント付き)に入れ、O3露光室に入れます。</li>
	<li>温度と湿度を正確に記録するために、ケージと露出室に...

<ol>
	<li>Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+macrophages+as+the+guardians+of+tissue+repair+in+the+lung.">Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung.</a> Immunology and Cell Biology. , (2019).</li><li>Gregoire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+efferocytosis+and+neutrophil+extracellular+trap+clearance+by+macrophages+in+ARDS.">Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS.</a> European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).</li><li>Fan, E. K. Y., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alveolar+macrophage+death+in+acute+lung+inflammation.">Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation.</a> Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).</li><li>Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+dying+cells+and+autoimmunity.">Clearance of dying cells and autoimmunity.</a> Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).</li><li>Bhattacharya, J., Westphalen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-epithelial+interactions+in+pulmonary+alveoli.">Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli.</a> Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).</li><li>Donnelly, L. E., Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+in+airways+disease.">Defective phagocytosis in airways disease.</a> Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).</li><li>Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+efferocytosis+by+alveolar+macrophages+in+IPF+patients.">Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients.</a> Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).</li><li>Vandivier, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibits+phagocytosis+of+apoptotic+cells+with+proinflammatory+consequences.">Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).</li><li>Grabiec, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+airway+macrophage+expression+of+the+Axl+receptor+tyrosine+kinase+is+associated+with+defective+efferocytosis+in+asthma.">Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).</li><li>Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+released+by+apoptotic+T+cells+contributes+to+an+immunosuppressive+milieu.">TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu.</a> Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).</li><li>Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiinflammatory+effects+of+CD95+ligand+(FasL)-induced+apoptosis.">Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).</li><li>O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+beta-cells+is+reduced+in+neonatal+autoimmune+diabetes-prone+rats.">Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats.</a> Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).</li><li>Shen, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mineralocorticoid+Receptor+Deficiency+in+Macrophages+Inhibits+Atherosclerosis+by+Affecting+Foam+Cell+Formation+and+Efferocytosis.">Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).</li><li>Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophages+in+the+Resolution+of+Inflammation,+Tissue+Repair,+and+Tolerance+to+Infection.">Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).</li><li>Hamon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bushfire+smoke+is+pro-inflammatory+and+suppresses+macrophage+phagocytic+function.">Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function.</a> Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).</li><li>Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+as+a+regulator+of+macrophage+chemokine+receptor+expression+and+polarization.">Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization.</a> European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).</li><li>Karaji, N., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+of+Pathogen-Infected+Cells.">Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).</li><li>Brouckaert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+necrotic+cells+by+macrophages+is+phosphatidylserine+dependent+and+does+not+induce+inflammatory+cytokine+production.">Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).</li><li>Gonzalez-Guevara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+ozone+induces+a+systemic+inflammatory+response:+possible+source+of+the+neurological+alterations+induced+by+this+gas.">Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas.</a> Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).</li><li>Robertson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+mediates+endothelial+dysfunction+downstream+of+circulating+factors+induced+by+O3+exposure.">CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure.</a> Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).</li><li>Kilburg-Basnyat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+Pro-Resolving+Lipid+Mediators+Regulate+Ozone-Induced+Pulmonary+and+Systemic+Inflammation.">Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation.</a> Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).</li><li>Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+ozone+on+immune+function.">The effects of ozone on immune function.</a> Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).</li><li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone.">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li><li>Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+In+Vitro+Culture+of+Murine+and+Human+Alveolar+Macrophages.">Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+SR-BI+mediates+efferocytosis+via+Src/PI3K/Rac1+signaling+and+reduces+atherosclerotic+lesion+necrosis.">Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis.</a> Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).</li><li>Coe, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-23+is+a+negative+regulator+of+prenatal+and+postnatal+erythropoiesis.">FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).</li><li>Yong, W. K., Abd Malek, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthohumol+induces+growth+inhibition+and+apoptosis+in+ca+ski+human+cervical+cancer+cells.">Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).</li><li>Van de Laar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+Sac+Macrophages,+Fetal+Liver,+and+Adult+Monocytes+Can+Colonize+an+Empty+Niche+and+Develop+into+Functional+Tissue-Resident+Macrophages.">Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages.</a> Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+and+resident+liver+macrophages+display+unique+transcriptomic+signatures+but+similar+biological+functions.">Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions.</a> Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. , (2019).</li><li>Crowther, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+surfactant+protein+a+inhibits+macrophage+reactive+oxygen+intermediate+production+in+response+to+stimuli+by+reducing+NADPH+oxidase+activity.">Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity.</a> Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).</li><li>Silveyra, P., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variant+associations+of+human+SP-A+and+SP-D+with+acute+and+chronic+lung+injury.">Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury.</a> Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).</li><li>Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+protein+A+enhances+alveolar+macrophage+phagocytosis+of+apoptotic+neutrophils.">Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils.</a> Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).</li><li>Gomez Perdiguero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Nebbioso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+analysis+of+DNA-protein+interactions+in+living+cells+by+UV+laser+pulses.">Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).</li><li>Novak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+different+UV-emitting+light+sources+in+the+induction+of+T-cell+apoptosis.">Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis.</a> Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).</li><li>Park, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAI-1+inhibits+neutrophil+efferocytosis.">PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).</li><li>Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+susceptibility+to+ozone-induced+lung+hyperpermeability:+role+of+toll-like+receptor+4.">Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).</li><li>Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variability+in+the+development+of+pulmonary+tolerance+to+inhaled+pollutants+in+inbred+mice.">Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).</li></ol>

エフェロサイトーシスは、マクロファージがアポトーシス細胞や破片をクリアし、複数の抗炎症メディエーター9、10、11、12、16を産生する抗炎症プロセスです。 、18.エフェロサイトシスの複数のモデルは、マクロファージが炎症6?...

肺は常に肺の炎症を引き起こす空気微粒子、ウイルス、細菌、および酸化性ガスを含む環境侮辱にさらされている1、2、3。これらの侮辱は、ガス交換を危険にさらし、不可逆的な組織損傷4、5を誘発することができます。恒常性におけるマウスおよびヒト肺に見られる免疫細胞の約95%を構成する肺胞マクロファージは、環境侮辱1、2後の肺炎症の重要な調節薬である。3,4,5.肺胞マクロファージは、病原体を食器化および排除することにより宿主防御中に不可欠である。最近、肺胞マクロファージは、組織恒常性および発泡細胞症6、7を介した炎症の解決を促進することが示されている。エフェロサイト症は、マクロファージがアポトーシス細胞8、9、10を巻き込み、排除する食細胞プロセスである。エフェロサイトーシスはまた、プロセスをさらに増強するメディエーター(すなわち、IL-10、TGF-β、PGE2、および一酸化窒素)の産生をもたらし、炎症9、10、11の解決をもたらす ,12,16,18.このプロセスは、二次壊死を予防し、組織恒常性を促進するために必要です12,13,14.いくつかの研究は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、および特発性肺線維症8、9、15を含む様々な慢性肺疾患と損なわれた肺細胞症をリンクしています。 16、17.
O3は、慢性肺疾患19、20、21の発生率を悪化させ、増加させる基準大気汚染物質である。O3は肺炎症および損傷を誘発し、細菌病原体22,23の肺胞マクロファージ性細胞症を損なう知られている。しかし、O3が肺胞マクロファージエフェロサイトーシスを損なうかどうかは不明である。O3-誘導性の肺マクロファージエフェロサイトーシスの改変を調べると、暴露が慢性肺疾患の発生率および悪化につながる方法についての潜在的な洞察を提供する。以下に説明する急性O3曝露後の雌マウスの肺における肺胞マクロファージエフェロサイト症を評価する簡単な方法である。
概説された方法は、高価な蛍光色素、広範なフローサイトメトリー測定、および肺胞マクロファージ24の外生操作の使用を排除することにより、この分野で一般的に使用される他のエフェロサイトーシスプロトコルに対していくつかの利点を有する。 、25.さらに、このプロトコルは、マクロファージ機能に影響を与える可能性のある肺微小環境のコンテキストで肺胞マクロファージエフェロサイトシスを測定します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Kit</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>4830-250-K&#160;</td>
			<td>The TACS&#160;Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2 Jurkat T Cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-2899</td>
			<td>The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff&#160; Reagent 2, Eosin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990706</td>
			<td>Eosin staining that stains cytoplasm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 1, Fixative</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990705</td>
			<td>Fixes cells to be stained by H&#38;E.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990707</td>
			<td>Methylene Blue staining that stains the nucleus.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td>RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker</td>
			<td>Cambridge Scientific&#160;</td>
			<td>16659</td>
			<td>The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T400 ultraviolet light photometer&#160;</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T400</td>
			<td>The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T703 Ozone calibrator</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T703</td>
			<td>Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure

オゾン(O3)は、慢性肺疾患の発生率を悪化させ、増加させる基準である。O3暴露は肺炎症を誘発することが知られているが、暴露が炎症の解決に重要なプロセスをどのように変化させるかについてはほとんど知られていない。エフェロサイト症は、マクロファージがアポトーシス細胞を食細胞化する分解能プロセスである。このプロトコルの目的は、O3誘発性肺損傷および炎症に続く肺胞マクロファージエフェロサイト症を測定することである。エフェロサイトアシスを測定するためのいくつかの方法が記載されています。ただし、ほとんどの場合、ex vivo 操作が必要です。ここでは詳細に説明するO3暴露後の生体内肺胞マクロファージエフェロサイトシス24hで測定するプロトコルであり、マクロファージの排外操作を回避し、摂動を正確に表現するために使用できる簡単な技術として機能する。この解決プロセス。このプロトコルは、全身O3吸入に続いて、全身麻酔下でアポトーシス細胞(すなわち、Jurkat T細胞)の口腔咽頭吸引を伴う技術的に非集中的で比較的安価な方法である。次いで、気管支アルフェオール(BAL)洗浄剤から採取したマクロファージの光顕微鏡検査評価により、肺胞マクロファージエフェロサイト症を測定する。エフェロサイトシスは、最終的に発泡性指数を計算することによって測定される。概説された方法は、生体内の肺における発泡性活性を定量化する一方で、O3または他の吸入された侮辱の負の健康影響を分析するのに役立つ。

O3暴露は肺の炎症および傷害を誘発することが知られており、組織恒常性を維持するためにはエフェロサイトーシスが必要である。C57BL/6J雌マウスを濾過空気(FA)または1ppmO3を3時間曝露し、24時間曝露後に肺炎症および損傷を調べた。O3-露出マウスは、FA対照群と比較して空域におけるマクロファージおよび好中球の有意な増加を示した(<strong cla...

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In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

この原稿は、大気汚染物質であるオゾンへの曝露が生体内の肺胞マクロファージエフェロサイト症を損なうかどうかを決定するためのプロトコルを記述する。このプロトコルは、一般的に使用される試薬および技術を利用し、肺胞マクロファージエフェロサイトシスへの影響を決定するために肺損傷の複数のモデルに適応することができる。

オゾン暴露後の肺胞マクロファージエフェロサイトーシスの生体内評価

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

ここで説明するプロトコルは、基準大気汚染物質オゾンに曝された後の肺マクロファージ・エフェロサイトーシスを測定する。これらのデータは、オゾン暴露が肺胞マクロファージ・エフェロサイトーシスを減少させ、オゾンレベルの上昇が肺疾患の発生率を高める理由のメカニズムとなり得ることを示している。この技術の主な利点は、表現型または機能を変化させる可能性のあるマクロファージのエビボ操作を伴わずに肺胞マクロファージ・エフェロサイトーシスのin vivo評価を可能にすることです。この技術は、大気汚染暴露後に肺が自分自身を修復できない新しいメカニズムを明らかにしました。さらに、この技術は、肺の中でエフェロサイトスを変化させる標的への新しい経路を明らかにすることができる。この方法は、肺の損傷または炎症の任意のモデルに適用することができます。しかし, ユーザーは、肺損傷後のエフェロサイトス症を評価するのが最善であるときに最適化する必要があります。.中咽頭の吸引を行うことは技術的に困難な場合があります。私はあなたがこの手順を実行するためにあなたの技術を最適化していることを確認するためにあなたの獣医スタッフと協力することをお勧めします。37°Cと5%の二酸化炭素で原稿の指示に従って補充基底細胞培養培地でJurkat T細胞を培養することから始めます。Jurkat T細胞は、3日ごとに温め込み前培養培地への通過を通じて維持することができる懸濁細胞株である。アポトーシス細胞を90%の合流度に成長させ、通過後3~4日かかります。5つのT75フラスコで細胞を増殖させ、このプロトコルに十分な数の細胞を得る。細胞の準備ができたら、フラスコの内容物を約24ミリリットル吸引し、50ミリリットルの円錐形チューブに移します。トリパンブルー染色と血球計を使用して細胞を数えます。ペレットは、271回gで5分間遠心分離して細胞を捨てる。次いで、培地中の細胞を再懸濁して、1ミリリットル当たり300万個の細胞を得る。アリコートは、1皿あたり5ミリリットルの細胞を移すことによって、細胞を100 x 20ミリメートルの組織培養皿に入れる。約9種類の文化料理を用意する。1つの皿を露出していないコントロールとして脇に置き、残りの皿をUVにさらす。エネルギーボタンを押して、数字パッドで600を入力することにより、UVクロスリンカーを正しいエネルギーレベルに設定します。UV露光中に組織培養皿の上部カバーを確実に取り除くことを確認するコントロールを除いて、細胞ですべての料理を照射します。その後、細胞培養インキュベーター内のすべての料理を摂氏37度、炭酸ガス5%で4時間インキュベートします。インキュベーション後、照射した細胞をすべて50ミリリットルの円錐形チューブに組み合わせ、271回gで5分間遠心分離してペレット状にします。上清を捨て、滅菌PBSの24ミリリットルで細胞を再懸濁します。チューブを再び遠心分離し、上清を取り除きます。適切な濃度でPBS中で再懸濁してマウスをドーズするための細胞を準備します。マウスが適切に麻酔されたら、半リカンベントのスピージンの位置に置きます。上顎切歯によってマウスを中断するために傾斜したアクリルシート板のペグの間に結ばれた外科ストリングを使用してください。鈍い非隆起鉗子のペアを使用して、マウスの舌をつかんで軽く引っ張り、P200ピペットでアポトーシス細胞を口腔に植え付けます。投与は、マウスが用量を受けてから1~2秒後にパチパチ音を起すと成功する。手袋をはめた指で、舌が引き込まれる間に吸い込まれるまで、マウスの鼻をそっと覆います。口腔内に液体が見えなくなるまで鼻を覆い、マウスが2回以上の吸入を行った状態に保ちます。接種ボードからマウスを取り出し、ケージに戻して麻酔から回復させ、破片がナレスをふさぐのを防ぐためにマウスを背中に置きます。すべてのマウスが麻酔から目覚めた後、肺胞マクロファージがアポトーシス細胞の流入を巻き込むように90分待ちます。洗浄液を収集するには、原稿の指示に従って安楽死させたマウスを準備します。ゆっくりとPBSを肺に押し込んで膨張させ、同じボリュームを引き戻してPBSが鼻孔から出ていないことを確認します。15ミリリットルチューブ内の各マウスからプールされた洗浄を収集します。気管支肺胞洗浄物またはBALを摂氏4度で6分間6分間610倍にして遠心分離し、上澄み物を1.5ミリリットルチューブに集め、マイナス80度で凍結します。ペレットは、気管支胞腔からの細胞を表す。ACK赤血球のリシスバッファーを1ミリリットルペレットに加え、残存赤血球を除去します。渦と溶地を氷の上で1分間、4ミリリットルのPBSを加え、溶出反応を止める。細胞を摂氏4度で6分間6分610倍にして遠心分離し、真空吸引器で上清を吸引する。その後、1ミリリットルのPBSで細胞を10%FBSで再懸濁し、トリパンブルーなしでヘモサイトメーター上の細胞を数える。遠心分離機各サンプルの120マイクロリットルは、中加速度と細胞遠心分離機を使用して3分間、12回gのスライドに置きます。スライドを一晩乾燥させます。翌日、ヘマトキシリンとエオシンでスライドを染色し、細胞数と差動細胞数の両方を計算します。次に、20Xまたは40Xの目的を使用して、生物学的顕微鏡上のBrightfield設定下のスライドを表示します。アポトーシス型のJurkat T細胞をアポトーシス細胞に貪食させた肺胞マクロファージの比率に基づいて、各スライドから少なくとも200個の細胞をカウントすることを確認します。このプロトコルは、肺の炎症に対するオゾン暴露の影響を調べるのに使用された。オゾン暴露マウスは、濾過空気制御群と比較して空域中のマクロファージおよび好中球の増加を示し、肺胞上皮機能不全のマーカーであるBALタンパク質の増加を有した。マウスをドーズする前に、ユールカットT細胞におけるアポトーシスがフローサイトメトリーで確認された。60ミリジュールのUV露光レベルと4時間のインキュベーション時間は、約75%アポトーシス細胞の反復的な結果をもたらした。efferocyticマクロファージは、通常の肺胞マクロファージと比較してJurkat T細胞を巻き込んだマクロファージとして同定された。オゾン誘発性肺炎症がアポトーシス細胞のクリアランスの減少に関連していることを示す濾過された空気制御と比較して、オゾン暴露群の浸透性指数が有意に低下した。この手順では、細部への注意と、観察された違いを書き留めるのが重要です。また、分析のためにサンプルを盲目にし、2人の異なる人々にマクロファージを数えさせるのも推奨されます。分離後、BAL細胞はmRNA分析に使用することができ、免疫蛍光によって追加のマーカーに染色され、および/またはフローサイトメーター上で動作して表皮変化を区別する。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用<em&gt;インビボ</em

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以下の肝臓の生体顕微鏡イメージング<em&gt;リーシュマニア</em&gt;感染症：肝血行動態の評価

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Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

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