Name: in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure
Uploaded: 2019-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure at JoVE.com

Este estudio está financiado por el Instituto de Efectos para la Salud Walter A. Rosenblith Award y NIEHS R01ES028829 (a K. M. G). Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Dianne Walters (Departamento de Fisiología, ECU) por su ayuda para obtener imágenes representativas de los macrófagos alveolares.

Todos los métodos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Este.
1. Ozono (O3) y exposiciones al aire filtrado (Día 1)
<ol><li>Coloque un máximo de 12 hembras de ratones C57BL/6J, de 8 a 12 semanas de edad, en una jaula de acero (con 12 compartimentos separados) con tapas de malla de alambre en una cámara de exposición O3.</li>
	<li>Coloque el termómetro en la cámara de exposición con ...

<ol>
	<li>Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+macrophages+as+the+guardians+of+tissue+repair+in+the+lung.">Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung.</a> Immunology and Cell Biology. , (2019).</li><li>Gregoire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+efferocytosis+and+neutrophil+extracellular+trap+clearance+by+macrophages+in+ARDS.">Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS.</a> European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).</li><li>Fan, E. K. Y., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alveolar+macrophage+death+in+acute+lung+inflammation.">Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation.</a> Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).</li><li>Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+dying+cells+and+autoimmunity.">Clearance of dying cells and autoimmunity.</a> Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).</li><li>Bhattacharya, J., Westphalen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-epithelial+interactions+in+pulmonary+alveoli.">Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli.</a> Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).</li><li>Donnelly, L. E., Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+in+airways+disease.">Defective phagocytosis in airways disease.</a> Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).</li><li>Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+efferocytosis+by+alveolar+macrophages+in+IPF+patients.">Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients.</a> Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).</li><li>Vandivier, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibits+phagocytosis+of+apoptotic+cells+with+proinflammatory+consequences.">Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).</li><li>Grabiec, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+airway+macrophage+expression+of+the+Axl+receptor+tyrosine+kinase+is+associated+with+defective+efferocytosis+in+asthma.">Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).</li><li>Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+released+by+apoptotic+T+cells+contributes+to+an+immunosuppressive+milieu.">TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu.</a> Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).</li><li>Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiinflammatory+effects+of+CD95+ligand+(FasL)-induced+apoptosis.">Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).</li><li>O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+beta-cells+is+reduced+in+neonatal+autoimmune+diabetes-prone+rats.">Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats.</a> Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).</li><li>Shen, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mineralocorticoid+Receptor+Deficiency+in+Macrophages+Inhibits+Atherosclerosis+by+Affecting+Foam+Cell+Formation+and+Efferocytosis.">Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).</li><li>Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophages+in+the+Resolution+of+Inflammation,+Tissue+Repair,+and+Tolerance+to+Infection.">Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).</li><li>Hamon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bushfire+smoke+is+pro-inflammatory+and+suppresses+macrophage+phagocytic+function.">Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function.</a> Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).</li><li>Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+as+a+regulator+of+macrophage+chemokine+receptor+expression+and+polarization.">Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization.</a> European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).</li><li>Karaji, N., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+of+Pathogen-Infected+Cells.">Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).</li><li>Brouckaert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+necrotic+cells+by+macrophages+is+phosphatidylserine+dependent+and+does+not+induce+inflammatory+cytokine+production.">Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).</li><li>Gonzalez-Guevara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+ozone+induces+a+systemic+inflammatory+response:+possible+source+of+the+neurological+alterations+induced+by+this+gas.">Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas.</a> Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).</li><li>Robertson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+mediates+endothelial+dysfunction+downstream+of+circulating+factors+induced+by+O3+exposure.">CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure.</a> Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).</li><li>Kilburg-Basnyat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+Pro-Resolving+Lipid+Mediators+Regulate+Ozone-Induced+Pulmonary+and+Systemic+Inflammation.">Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation.</a> Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).</li><li>Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+ozone+on+immune+function.">The effects of ozone on immune function.</a> Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).</li><li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone.">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li><li>Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+In+Vitro+Culture+of+Murine+and+Human+Alveolar+Macrophages.">Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+SR-BI+mediates+efferocytosis+via+Src/PI3K/Rac1+signaling+and+reduces+atherosclerotic+lesion+necrosis.">Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis.</a> Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).</li><li>Coe, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-23+is+a+negative+regulator+of+prenatal+and+postnatal+erythropoiesis.">FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).</li><li>Yong, W. K., Abd Malek, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthohumol+induces+growth+inhibition+and+apoptosis+in+ca+ski+human+cervical+cancer+cells.">Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).</li><li>Van de Laar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+Sac+Macrophages,+Fetal+Liver,+and+Adult+Monocytes+Can+Colonize+an+Empty+Niche+and+Develop+into+Functional+Tissue-Resident+Macrophages.">Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages.</a> Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+and+resident+liver+macrophages+display+unique+transcriptomic+signatures+but+similar+biological+functions.">Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions.</a> Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. , (2019).</li><li>Crowther, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+surfactant+protein+a+inhibits+macrophage+reactive+oxygen+intermediate+production+in+response+to+stimuli+by+reducing+NADPH+oxidase+activity.">Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity.</a> Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).</li><li>Silveyra, P., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variant+associations+of+human+SP-A+and+SP-D+with+acute+and+chronic+lung+injury.">Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury.</a> Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).</li><li>Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+protein+A+enhances+alveolar+macrophage+phagocytosis+of+apoptotic+neutrophils.">Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils.</a> Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).</li><li>Gomez Perdiguero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Nebbioso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+analysis+of+DNA-protein+interactions+in+living+cells+by+UV+laser+pulses.">Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).</li><li>Novak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+different+UV-emitting+light+sources+in+the+induction+of+T-cell+apoptosis.">Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis.</a> Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).</li><li>Park, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAI-1+inhibits+neutrophil+efferocytosis.">PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).</li><li>Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+susceptibility+to+ozone-induced+lung+hyperpermeability:+role+of+toll-like+receptor+4.">Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).</li><li>Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variability+in+the+development+of+pulmonary+tolerance+to+inhaled+pollutants+in+inbred+mice.">Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).</li></ol>

La eferocitosis es un proceso antiinflamatorio en el que los macrófagos limpian las células apoptoticas y los desechos, así como producen múltiples mediadores antiinflamatorios9,10,11,12,16 ,18. Múltiples modelos de efferocittosis han proporcionado información sobre cómo el macrófago es una célula crítica en la res...

El pulmón está constantemente expuesto a insultos ambientales, incluyendo partículas de aire, virus, bacterias y gases oxidantes que desencadenan inflamación pulmonar1,2,3. Estos insultos pueden comprometer el intercambio de gas e inducir lesiones de tejidoirreversibles 4,5. Los macrófagos alveolares, que constituyen aproximadamente el 95% de las células inmunitarias que se encuentran en los pulmones murinos y humanos en la homeostasis, son reguladores críticos de la inflamación pulmonar después de los insultos ambientales1,2, 3,4,5. Los macrófagos alveolares son esenciales durante la defensa del huésped al fagocica y eliminando patógenos. Recientemente, se ha demostrado que los macrófagos alveolares promueven la homeostasis tisular y la resolución de la inflamación a través de la eferocitosis6,7. La efferocitasis es un proceso fagocítico en el que los macrófagos envuelven y eliminan las células apoptóticas8,9,10. La eferocitosis también da lugar a la producción de mediadores (es decir, IL-10, TGF-, PGE2y óxido nítrico) que aumentan aún más el proceso, lo que resulta en la resolución de la inflamación9,10,11 ,12,16,18. Este proceso es necesario para prevenir la necrosis secundaria y promover la homeostasis tisular12,13,14. Varios estudios han relacionado la insuficiencia efefitosis con diversas enfermedades pulmonares crónicas, incluyendo asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y fibrosis pulmonar idiopática8,9,15, 16,17.
O3 es un criterio contaminante del aire que exacerba y aumenta la incidencia de enfermedades pulmonares crónicas19,20,21. O3 induce inflamación pulmonar y lesión y se sabe que afecta la fagocitosis de los patógenos bacterianos22,23. Sin embargo, se desconoce si O3 afecta a la eferocitosis de macrófagos alveolares. La investigación de alteraciones inducidas por O3en la eferocitais de macrófagos alveolares proporcionará una visión potencial de cómo la exposición puede conducir a la incidencia y exacerbación de enfermedades pulmonares crónicas. A continuación se describe un método sencillo para evaluar la eferocítosis de macrófagos alveolares en los pulmones de ratones hembras después de la exposición aguda a O3. 
El método esbozado posee varias ventajas sobre otros protocolos de efferocittosis comúnmente utilizados en el campo al eliminar el uso de costosos colorantes fluorescentes, mediciones extensas de citometría de flujo y manipulación ex vivo de macrófagos alveolares24 ,25. Además, este protocolo mide la eferocítis de macrófagos alveolares en el contexto del microambiente pulmonar, que puede influir en la función de los macrófagos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Kit</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>4830-250-K&#160;</td>
			<td>The TACS&#160;Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2 Jurkat T Cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-2899</td>
			<td>The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff&#160; Reagent 2, Eosin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990706</td>
			<td>Eosin staining that stains cytoplasm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 1, Fixative</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990705</td>
			<td>Fixes cells to be stained by H&#38;E.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990707</td>
			<td>Methylene Blue staining that stains the nucleus.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td>RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker</td>
			<td>Cambridge Scientific&#160;</td>
			<td>16659</td>
			<td>The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T400 ultraviolet light photometer&#160;</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T400</td>
			<td>The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T703 Ozone calibrator</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T703</td>
			<td>Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure

El ozono (O3)es un contaminante del aire criterio que exacerba y aumenta la incidencia de enfermedades pulmonares crónicas. Se sabe que la exposición a O3 induce inflamación pulmonar, pero se sabe poco con respecto a cómo la exposición altera los procesos importantes para la resolución de la inflamación. La efferocitasis es un proceso de resolución, mediante el que los macrófagos fagocytizan las células apoptóticas. El propósito de este protocolo es medir la eferocitis de los macrófagos alveolares después de la lesión pulmonar inducida por O3y la inflamación. Se han descrito varios métodos para medir la eferocitosis; sin embargo, la mayoría requieren manipulaciones ex vivo. Aquí se describe en detalle un protocolo para medir la efistosis de macrófagos alveolares in vivo 24 h después de la exposición a O3, que evita la manipulación ex vivo de los macrófagos y sirve como una técnica simple que se puede utilizar para perturbar con precisión las representaciones en este proceso de resolución. El protocolo es un método técnicamente no intensivo y relativamente barato que implica inhalación de O3 de todo el cuerpo seguida de la aspiración orofaríngea de células apoptóticas (es decir, células T Jurkat) mientras está bajo anestesia general. La eferocitosis de macrófagos alveolares se mide entonces mediante la evaluación por microscopía de luz de macrófagos recogidos del lavado broncoalveolar (BAL). La eferocítis finalmente se mide calculando un índice efferocítico. Colectivamente, los métodos descritos cuantifican la actividad efferocí en el pulmón in vivo mientras que también sirven para analizar los efectos negativos para la salud de O3 u otros insultos inhalados.

Se sabe que la exposición a O3 induce inflamación pulmonar y lesiones, y se requiere eferocitasis para mantener la homeostasis tisular. Los ratones hembra C57BL/6J fueron expuestos a aire filtrado (FA) o 1 ppm O3 durante 3 h y necropsiados 24 h después de la exposición para examinar la inflamación pulmonar y lesiones. Los ratones o3expuestos mostraron un aumento significativo de macrófagos y neutrófilos en el espacio aéreo en comparación con el gr...

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In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Este manuscrito describe un protocolo para determinar si la exposición al ozono, un criterio contaminante del aire, afecta a la eferocítosis in vivo de los macrófagos alveolares. Este protocolo utiliza reactivos y técnicas de uso común y se puede adaptar a múltiples modelos de lesión pulmonar para determinar los efectos sobre la eferocittosis de macrófagos alveolares.

En la evaluación Vivo de la efiytosis de macrófagos alveolares tras la exposición al ozono

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

El protocolo descrito aquí mide la efferocitosis de macrófagos pulmonares después de la exposición a un criterio de ozono contaminante del aire. Estos datos indican que la exposición al ozono disminuye la efferocitosis de macrófagos alveolares y, por lo tanto, podría ser un mecanismo para por qué los niveles elevados de ozono aumentan la incidencia de enfermedades pulmonares. La principal ventaja de esta técnica es que permite una evaluación in vivo de la efferocitosis de macrófagos alveolares sin ninguna manipulación ex vivo de los macrófagos que pueda alterar su fenotipo o función.Esta técnica ha revelado un nuevo mecanismo por el cual el pulmón no puede repararse después de la exposición a la contaminación del aire. Además, esta técnica puede revelar nuevas vías a objetivos que alteran la efferocitosis en el pulmón. Este método se puede aplicar a cualquier modelo de lesión pulmonar o inflamación.Sin embargo, el usuario tendrá que optimizar cuando sea mejor evaluar la efferocitosis después de una lesión pulmonar. Realizar la aspiración orofaríngea puede ser técnicamente difícil. Le aconsejo trabajar con su personal veterinario para asegurarse de que ha optimizado su técnica para realizar este procedimiento.Comience por cultivar células T de Jurkat en medio de cultivo de células basales complementado de acuerdo con las direcciones del manuscrito a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono. Las células T de Jurkat son una línea celular de suspensión que se puede mantener a través del passaging en medios de cultivo precalentó cada tres días. Preparar las células apoptóticas mediante el crecimiento de ellos a 90%confluencia que toma de tres a cuatro días después de la transgredencia.Células de cultivo en cinco matraces T75 para obtener un número suficiente de células para este protocolo. Una vez que las células estén listas, aspirar el contenido del matraz alrededor de 24 mililitros y transferirlos a un tubo cónico de 50 mililitros. Cuente las células usando la tinción De Punta Azul y un hemociclomecómetro.Pele el líquido de las células por centrifugación a 271 veces g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Luego, resuspender las células en medios para obtener tres millones de células por mililitro. Aliquot las células en 100 por 20 milímetros de cultivo de tejido mediante la transferencia de cinco mililitros de células por plato.Preparar aproximadamente nueve platos de cultura. Deje un plato a un lado como un control no expuesto y exponga los platos restantes a los rayos UV. Ajuste el reticulante UV al nivel de energía correcto pulsando el botón de energía e introduciendo 600 con el teclado numérico. Irradiar todos los platos con las células excepto el control asegurándose de retirar la cubierta superior de la placa de cultivo de tejido durante la exposición UV.Luego, incuba todos los platos en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas. Después de la incubación, combinar todas las células irradiadas en un tubo cónico de 50 mililitros y peletizarlas por centrifugación a 271 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 24 mililitros de PBS estéril.Centrifugar el tubo de nuevo y quitar el sobrenadante. Preparar las células para la dosificación de ratones resuspendándolas en PBS en la concentración adecuada. Una vez que el ratón esté correctamente anestesiado, colóquelo en una posición supina semi-recumbent.Utilice una cuerda quirúrgica atada entre clavijas en una placa de lámina de acrílico inclinada para suspender el ratón por los incisivos maxilares. Utilice un par de fórceps sin astillas contundentes para agarrar y tirar ligeramente de la lengua del ratón e inculcar las células apoptóticas en la cavidad oral con una pipeta P200. La dosificación es exitosa cuando los ratones hacen un ruido crepitante de uno a dos segundos después de recibir la dosis.Con un dedo enguantado, cubra suavemente la nariz del ratón hasta que se inhale mientras la lengua se retrae. Mantenga la nariz cubierta hasta que no haya líquido visible en la cavidad oral y el ratón haya tomado dos o más inhalaciones. Retire el ratón de la placa de inoculación y devuélvalo a la jaula para permitir que se recupere de la anestesia asegurándose de colocar el ratón sobre su espalda para evitar que los desechos bloqueen las narinas.Después de que todos los ratones se hayan despertado de la anestesia, espere 90 minutos para permitir que los macrófagos alveolares engullir la afluencia de células apoptóticas. Para recoger el líquido de lavado, prepare el ratón eutanizado de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Empuje lentamente el PBS en los pulmones, lo que les permite inflarse, luego tire del mismo volumen hacia fuera asegurándose de que el PBS no está saliendo de las fosas nasales.Recoger el lavado agrupado de cada ratón en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar el lavado broncoalveolar o BAL a 610 veces g durante seis minutos a cuatro grados Centígrados, recoger el sobrenadante en un tubo de 1,5 mililitros, y congelarlo a menos 80 grados centígrados. El pellet representa las células del espacio broncoalveolar.Añadir un mililitro de tampón de lysis de glóbulos rojos ACK al pellet para eliminar los glóbulos rojos residuales. Vórtice y lese durante un minuto sobre hielo, luego agregue cuatro mililitros de PBS para detener la reacción de la lysis. Centrifugar las células a 610 veces g durante seis minutos a cuatro grados centígrados y aspirar el sobrenadante con un aspirador de vacío.Luego, resuspender las células en un mililitro de PBS con 10%FBS y contar las células en un hemocitometro sin Trypan Blue. Centrifugar 120 microlitros de cada muestra en diapositivas a 12 g durante tres minutos utilizando una aceleración media y una citocentrífuga. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche.Al día siguiente, manche los portaobjetos con hematoxilina y eosina para calcular el recuento de células efferocíticas y diferenciales. A continuación, vea las diapositivas bajo un ajuste de Brightfield en un microscopio biológico utilizando un objetivo 20X o 40X. Calcular el índice efferocítico basado en la proporción de macrófagos alveolares que fagocytosed células T apoptoticas Jurkat a macrófagos alveolar sin absorción de células apoptóticas asegurándose de contar al menos 200 células de cada diapositiva.Este protocolo se utilizó para investigar el efecto de la exposición al ozono en la inflamación pulmonar. Los ratones expuestos al ozono mostraron un aumento de los macrófagos y neutrófilos en el espacio aéreo en comparación con el grupo de control de aire filtrado y tuvieron un aumento en la proteína BAL, un marcador de disfunción epitelial alveolar. Antes de la dosificación de los ratones, se confirmó la apoptosis en las células T de Jurkat con citometría de flujo.El nivel de exposición UV de 60 mililitros y el tiempo de incubación de cuatro horas dieron como resultado resultados repetitivos de aproximadamente 75% células apoptóticas. Los macrófagos efferocitos fueron identificados como macrófagos que habían engullido una célula de Jurkat T en comparación con los macrófagos alveolares regulares. Hubo una disminución significativa en el índice efferocítico del grupo expuesto al ozono en comparación con los controles de aire filtrado que indica que la inflamación pulmonar inducida por el ozono se asocia con una disminución del aclaramiento de las células apoptóticas.La atención al detalle y la escritura de las diferencias observadas es fundamental durante este procedimiento. También se recomienda cegar las muestras para su análisis y hacer que dos personas diferentes cuenten los macrófagos. Después del aislamiento, las células BAL se pueden utilizar para el análisis de ARNm, mancharse para marcadores adicionales por inmunofluorescencia, y/o ejecutarse en un citómetro de flujo para distinguir los cambios fenotípicos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T<em&gt; En vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Investigación

Inmunología e Infección

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Microscopia intravital de imágenes del hígado después<em&gt; Leishmania</em&gt; Infección: Una Evaluación de Hemodinámica hepática

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

En la Evaluación in vivo de roedores Plasmodium parasitemia y Merozoite Invasión por Citometría de Flujo

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Análisis de citometría de flujo de partículas unida a Bet v 1 de alérgenos en el MP10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Método del agitador magnético para la detección de<em&gt; Trichinella</em&gt; Las larvas en muestras de músculo

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...