Name: in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure
Uploaded: 2019-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure at JoVE.com

Bu çalışma Sağlık Etkileri Enstitüsü Walter A. Rosenblith Ödülü ve NIEHS R01ES028829 (K. M. G için) tarafından finanse edilmektedir. Dr. Dianne Walters'a (Fizyoloji Bölümü, ECU) alveoler makrofajların temsili görüntülerini elde etmedeki yardımları için teşekkür ederiz.

Tüm yöntemler, Doğu Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Ozon (O3)ve filtrelenmiş hava maruziyeti (Gün 1)
<ol><li>8-12 haftalık 12 dişi C57BL/6J fareyi, tel örgü kapaklı çelik bir kafese , O3 pozlama odasına yerleştirin.</li>
	<li>Sıcaklığı ve nemi doğru bir şekilde kaydetmek için termometreyi kafesle birlikte pozlama odasına yerleştirin.</li>
	<li>Cihaza bağlı oksijen ve ult...

<ol>
	<li>Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+macrophages+as+the+guardians+of+tissue+repair+in+the+lung.">Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung.</a> Immunology and Cell Biology. , (2019).</li><li>Gregoire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+efferocytosis+and+neutrophil+extracellular+trap+clearance+by+macrophages+in+ARDS.">Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS.</a> European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).</li><li>Fan, E. K. Y., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alveolar+macrophage+death+in+acute+lung+inflammation.">Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation.</a> Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).</li><li>Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+dying+cells+and+autoimmunity.">Clearance of dying cells and autoimmunity.</a> Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).</li><li>Bhattacharya, J., Westphalen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-epithelial+interactions+in+pulmonary+alveoli.">Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli.</a> Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).</li><li>Donnelly, L. E., Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+in+airways+disease.">Defective phagocytosis in airways disease.</a> Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).</li><li>Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+efferocytosis+by+alveolar+macrophages+in+IPF+patients.">Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients.</a> Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).</li><li>Vandivier, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibits+phagocytosis+of+apoptotic+cells+with+proinflammatory+consequences.">Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).</li><li>Grabiec, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+airway+macrophage+expression+of+the+Axl+receptor+tyrosine+kinase+is+associated+with+defective+efferocytosis+in+asthma.">Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).</li><li>Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+released+by+apoptotic+T+cells+contributes+to+an+immunosuppressive+milieu.">TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu.</a> Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).</li><li>Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiinflammatory+effects+of+CD95+ligand+(FasL)-induced+apoptosis.">Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).</li><li>O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+beta-cells+is+reduced+in+neonatal+autoimmune+diabetes-prone+rats.">Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats.</a> Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).</li><li>Shen, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mineralocorticoid+Receptor+Deficiency+in+Macrophages+Inhibits+Atherosclerosis+by+Affecting+Foam+Cell+Formation+and+Efferocytosis.">Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).</li><li>Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophages+in+the+Resolution+of+Inflammation,+Tissue+Repair,+and+Tolerance+to+Infection.">Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).</li><li>Hamon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bushfire+smoke+is+pro-inflammatory+and+suppresses+macrophage+phagocytic+function.">Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function.</a> Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).</li><li>Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+as+a+regulator+of+macrophage+chemokine+receptor+expression+and+polarization.">Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization.</a> European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).</li><li>Karaji, N., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferocytosis+of+Pathogen-Infected+Cells.">Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).</li><li>Brouckaert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+necrotic+cells+by+macrophages+is+phosphatidylserine+dependent+and+does+not+induce+inflammatory+cytokine+production.">Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).</li><li>Gonzalez-Guevara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+ozone+induces+a+systemic+inflammatory+response:+possible+source+of+the+neurological+alterations+induced+by+this+gas.">Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas.</a> Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).</li><li>Robertson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+mediates+endothelial+dysfunction+downstream+of+circulating+factors+induced+by+O3+exposure.">CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure.</a> Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).</li><li>Kilburg-Basnyat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+Pro-Resolving+Lipid+Mediators+Regulate+Ozone-Induced+Pulmonary+and+Systemic+Inflammation.">Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation.</a> Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).</li><li>Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+ozone+on+immune+function.">The effects of ozone on immune function.</a> Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).</li><li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone.">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li><li>Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+In+Vitro+Culture+of+Murine+and+Human+Alveolar+Macrophages.">Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).</li><li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+SR-BI+mediates+efferocytosis+via+Src/PI3K/Rac1+signaling+and+reduces+atherosclerotic+lesion+necrosis.">Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis.</a> Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).</li><li>Coe, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-23+is+a+negative+regulator+of+prenatal+and+postnatal+erythropoiesis.">FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).</li><li>Yong, W. K., Abd Malek, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthohumol+induces+growth+inhibition+and+apoptosis+in+ca+ski+human+cervical+cancer+cells.">Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).</li><li>Van de Laar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+Sac+Macrophages,+Fetal+Liver,+and+Adult+Monocytes+Can+Colonize+an+Empty+Niche+and+Develop+into+Functional+Tissue-Resident+Macrophages.">Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages.</a> Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment.">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+and+resident+liver+macrophages+display+unique+transcriptomic+signatures+but+similar+biological+functions.">Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions.</a> Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. , (2019).</li><li>Crowther, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+surfactant+protein+a+inhibits+macrophage+reactive+oxygen+intermediate+production+in+response+to+stimuli+by+reducing+NADPH+oxidase+activity.">Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity.</a> Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).</li><li>Silveyra, P., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variant+associations+of+human+SP-A+and+SP-D+with+acute+and+chronic+lung+injury.">Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury.</a> Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).</li><li>Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+protein+A+enhances+alveolar+macrophage+phagocytosis+of+apoptotic+neutrophils.">Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils.</a> Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).</li><li>Gomez Perdiguero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Nebbioso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+analysis+of+DNA-protein+interactions+in+living+cells+by+UV+laser+pulses.">Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).</li><li>Novak, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+different+UV-emitting+light+sources+in+the+induction+of+T-cell+apoptosis.">Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis.</a> Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).</li><li>Park, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAI-1+inhibits+neutrophil+efferocytosis.">PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).</li><li>Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+susceptibility+to+ozone-induced+lung+hyperpermeability:+role+of+toll-like+receptor+4.">Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).</li><li>Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variability+in+the+development+of+pulmonary+tolerance+to+inhaled+pollutants+in+inbred+mice.">Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).</li></ol>

Efferocytosis hangi makrofajlar apoptotik hücreleri ve enkaz temizlemek yanı sıra birden fazla anti-inflamatuar mediatör 9 üretmek bir anti-inflamatuar süreçtir9,10,11,12,16 ,18. Eferositoz birden fazla model nasıl makrofaj inflamasyon çözünürlüğünde kritik bir hücre nasıl içgörü sağlamıştır<sup class...

Akciğer sürekli hava partikülleri, virüsler, bakteriler ve akciğer iltihabı tetikleyen oksidan gazlar da dahil olmak üzere çevresel hakaretlere maruz kalmaktadır1,2,3. Bu hakaretler gaz değişimini tehlikeye atabilir ve geri dönüşü olmayan doku yaralanmasına neden olabilir4,5. Homeostazı'nda rürve insan akciğerlerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin yaklaşık %95'ini oluşturan alveoler makrofajlar, çevresel hakaretlerden sonra pulmoner inflamasyonun kritik düzenleyicileridir1,2, 3,4,5. Alveoler makrofajlar fagositosiyon ve patojenleri ortadan kaldırarak konak savunma sırasında esastır. Son zamanlarda, alveoler makrofajlar doku homeostazı ve eferositoz yoluyla inflamasyon çözünürlüğü teşvik gösterilmiştir6,7. Eferositoz hangi makrofajlar yutmak ve apoptotik hücreleri ortadan kaldırmak bir fagositiksüreçtir 8,9,10. Eferositoz aynı zamanda aracıların (il-10, TGF-β, PGE2ve nitrik oksit) üretimine de yol açar ve bu da süreci daha da güçlendirerek inflamasyonun çözülmesiyle sonuçlanır9,10,11 ,12,16,18. Bu süreç sekonder nekroz önlenmesi ve doku homeostaz teşvik etmek için gereklidir12,13,14. Çeşitli çalışmalar astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı ve idiyopatik pulmoner fibrozis8,9,15dahil olmak üzere çeşitli kronik akciğer hastalıkları ile bozulmuş eferositoz bağlantılı var, 16,17.
O3, kronik akciğer hastalıklarının görülme sıklığını arttıran ve artıran bir kriterdir19,20,21. O3 pulmoner inflamasyon ve yaralanma neden olur ve bakteriyel patojenlerin alveoler makrofaj fagositoz bozan bilinmektedir22,23. Ancak, O3 alveoler makrofaj eferositoz bozar olup olmadığı bilinmemektedir. Alveoler makrofaj eferositozda O 3-indüklenen değişikliklerin araştırılması, maruziyetin kronik akciğer hastalığı insidansına ve alevlenmeye nasıl yol açabileceği konusunda potansiyel bir fikir verecektir. Aşağıda açıklanan akut O3 maruziyeti sonrası kadın farelerin akciğerlerinde alveoler makrofaj eferositoz değerlendirmek için basit bir yöntemdir.
Ana hatlarıyla kullanılan yöntem, pahalı floresan boyaların, geniş akış sitometri ölçümlerinin ve alveoler makrofajların ex vivo manipülasyonunun ortadan kaldırılmasıyla bu alanda yaygın olarak kullanılan diğer eferositoz protokollerine göre çeşitli avantajlar sağlar24 ,25. Ayrıca, bu protokol, makrofaj fonksiyonunu etkileyebilen akciğer mikroçevre bağlamında alveoler makrofaj eferositozunu ölçer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC Kit</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>4830-250-K&#160;</td>
			<td>The TACS&#160;Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCL2 Jurkat T Cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-2899</td>
			<td>The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff&#160; Reagent 2, Eosin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990706</td>
			<td>Eosin staining that stains cytoplasm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 1, Fixative</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990705</td>
			<td>Fixes cells to be stained by H&#38;E.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>9990707</td>
			<td>Methylene Blue staining that stains the nucleus.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td>RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker</td>
			<td>Cambridge Scientific&#160;</td>
			<td>16659</td>
			<td>The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T400 ultraviolet light photometer&#160;</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T400</td>
			<td>The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne T703 Ozone calibrator</td>
			<td>Teledyne API</td>
			<td>T703</td>
			<td>Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assessment of alveolar macrophage efferocytosis following ozone exposure

Ozon (O3),kronik akciğer hastalıklarının görülme sıklığını arttıran ve şiddetlendiren bir kriterdir. O3 maruziyetin pulmoner inflamasyonu tetiklemesi bilinmektedir, ancak maruz kalmanın inflamasyonun çözümü için önemli süreçleri nasıl değiştirdiği konusunda çok az şey bilinmektedir. Eferositoz, makrofajların apoptotik hücreleri fagositize ettiği bir çözüm sürecidir. Bu protokolün amacı O3-indüklenen akciğer hasarı ve inflamasyon aşağıdaki alveoler makrofaj eferositoz ölçmektir. Eferositozun ölçümü için çeşitli yöntemler tanımlanmıştır; ancak, çoğu ex vivo manipülasyonlar gerektirir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan o3 pozlama dan sonra 24 saat in vivo alveolar makrofaj efferocytozis ölçmek için bir protokol, hangi makrofajlar ex vivo manipülasyon önler ve doğru pertürbations temsil etmek için kullanılabilecek basit bir teknik olarak hizmet vermektedir bu çözüm süreci. Protokol, genel anestezi altında yken tüm vücut O3 inhalasyonu ve ardından apoptotik hücrelerin orofatojiel aspirasyonu (jurkat T hücreleri) içeren teknik olarak yoğun olmayan ve nispeten ucuz bir yöntemdir. Alveoler makrofaj eferositoz bronkoalveoler (BAL) lavajından toplanan makrofajların ışık mikroskobu ile ölçülür. Eferositoz sonunda bir eferositik indeks hesaplanarak ölçülür. Topluca, ana hatlarıyla yöntemler in vivo akciğerde eferositik aktivite ölçmek de O3 veya diğer inhale hakaret olumsuz sağlık etkilerini analiz etmek için hizmet vermektedir.

O3 maruz ilikanın pulmoner inflamasyon ve yaralanmaya neden olduğu bilinmektedir ve eferositoz doku homeostazını korumak için gereklidir. C57BL/6J dişi fareler, pulmoner inflamasyon ve yaralanmayı incelemek için filtrelenmiş hava (FA) veya 1 ppm O3'e 3 saat ve nekropsi 24 saat sonra maruz kalma ile maruz kaldı. O3-maruz fareler fa kontrol grubuna göre hava sahasında makrofajlar ve nötrofiller önemli bir artış gösterdi(...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure at JoVE.com

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Bu el yazması, hava kirletici bir kriter olan ozon maruziyetinin alveoler makrofaj efferositozisinin in vivo'yu bozup bozmadığını belirleyen bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol yaygın olarak kullanılan reaktifler ve teknikler kullanır ve alveoler makrofaj eferositoz üzerindeki etkilerini belirlemek için pulmoner yaralanma birden fazla modeladapte edilebilir.

Ozon Maruziyetinden Sonra Alveoler Makrofaj Eferositozun Vivo Değerlendirilmesi

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Burada açıklanan protokol, hava kirletici ozona maruz kaldıktan sonra akciğer makrofajesitoz uyguluyor. Bu veriler ozon maruziyetinin alveoler makrofaj eferositozunun azaldığını ve bu nedenle ozon seviyesinin yükselmesinin akciğer hastalıklarının görülme sıklığını neden artırdığını gösteren bir mekanizma olabileceğini göstermektedir. Bu tekniğin en büyük avantajı, fenotip veya fonksiyonlarını değiştirebilecek makrofajların ex vivo manipülasyonları olmaksızın alveoler makrofaj eferositozun in vivo değerlendirilmesidir.Bu teknik, akciğerin hava kirliliğine maruz kaldıktan sonra kendini onaramayacağı yeni bir mekanizmaortaya koymuştur. Ayrıca, bu teknik akciğerde eferositoz değiştirmek hedeflere yeni yollar ortaya çıkarabilir. Bu yöntem akciğer yaralanması veya iltihabı herhangi bir model uygulanabilir.Ancak, kullanıcı akciğer hasarı sonrasında eferositoz değerlendirmek için en iyi zaman optimize etmek gerekir. Orofayngeal aspirasyon gerçekleştirmek teknik olarak zor olabilir. Bu işlemi gerçekleştirmek için tekniğinizi optimize ettiğinizden emin olmak için veteriner personeliniz ile çalışmanızı tavsiye ederim.37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit el yazması yönlere göre takviye bazal hücre kültürü orta Jurkat T hücreleri kültürlenme ile başlayın. Jurkat T hücreleri, her üç günde bir önceden ısıtılmış kültür ortamına geçerek muhafaza edilebilen bir süspansiyon hücre hattıdır. Apoptotik hücreleri %90'a kadar büyüterek hazırlayın ve bu hücreler passiyetten sonra 3-4 gün sürer.Bu protokol için yeterli sayıda hücre elde etmek için beş T75 şişesinde hücreleri büyütün. Hücreler hazır olduktan sonra, yaklaşık 24 mililitre lik şişe içeriğini aspire edin ve bunları 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Trypan Mavi boyama ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın.5 dakika boyunca 271 kez g santrifüj ile hücreleri pelet ve supernatant atın. Daha sonra, mililitre başına üç milyon hücre elde etmek için medya hücreleri resuspend. Aliquot hücreleri içine 100 tarafından 20 milimetre doku kültürü yemekleri çanak başına hücrelerin beş mililitre aktararak.Yaklaşık dokuz kültür yemeği hazırlayın. Bir tabak bir kenara maruz kalmamış bir kontrol olarak koyun ve UV kalan yemekleri maruz. UV crosslinker'ı enerji düğmesine basarak ve sayı pedi ile 600'e girerek doğru enerji seviyesine ayarlayın. UV maruziyeti sırasında doku kültürü çanak üst kapağı kaldırmak için emin kontrol dışında hücreleri ile tüm yemekleri ışınlamak.Sonra, bir hücre kültürü kuluçka makinesindeki tüm tabakları 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle dört saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, tüm ışınlanmış hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe birleştirin ve 271 kez g'de beş dakika santrifüj le peletleyin. Supernatant atın ve steril PBS 24 mililitre hücreleri resuspend.Tüpü tekrar santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Uygun konsantrasyonda PBS onları resuspend tarafından dosing fareler için hücreleri hazırlayın. Fare düzgün bir şekilde anestezi edildikten sonra, yarı recumbent omurga pozisyonuna yerleştirin.Maksiller kesici dişler tarafından fareaskıya eğimli akrilik levha levha üzerinde mandal arasında bağlı cerrahi dize kullanın. Fare dilini hafifçe kapmak ve çekmek ve p200 pipetile apoptotik hücreleri ağız boşluğuna sokmak için bir çift künt çıkıntılı olmayan forceps kullanın. Dozlama fareler dozu aldıktan sonra bir ila iki saniye çatırtı gürültü yapmak başarılı olur.Eldivenli bir parmakla, dil geri çekilirken nefes alana kadar farenin burnunu nazikçe kapatın. Ağız boşluğunda sıvı görünmeyene ve fare iki veya daha fazla teneffüs edilene kadar burnu kapalı tutun. Fareyi aşı panosundan çıkarın ve enkazın nares'i engellemesini önlemek için fareyi sırtına yerleştirmeyi sağlayan anesteziden kurtulmasını sağlamak için kafese geri verin.Tüm fareler anestezi uyandıktan sonra, alveoler makrofajlar apoptotik hücrelerin akını yutmak için izin vermek için 90 dakika bekleyin. Lavaj sıvısı toplamak için, el yazması talimatlara göre ötenazi fare hazırlamak. PBS'yi yavaşça akciğerlere doğru iterek şişirmelerini bekleyin, sonra pbs'nin burun deliklerinden çıkmadığından emin olmak için aynı hacmi geri çekin.15 mililitrelik bir tüp her fareden havuzlu lavaj toplamak. Bronkoalveoler lavaj veya BAL'ı 610 kez g'de dört santigrat derecede altı dakika bekleyin, süpernatantı 1,5 mililitrelik bir tüpe alın ve eksi 80 santigrat derecede dondurun. Pelet bronkoalveolar uzaydan hücreleri temsil eder.Kalıntı kırmızı kan hücrelerini kaldırmak için pelet ack kırmızı kan hücresi lisis tampon bir mililitre ekleyin. Girdap ve buz üzerinde bir dakika lyse, sonra lysis reaksiyonu durdurmak için PBS dört mililitre ekleyin. Hücreleri 610 kez g'de dört santigrat derecede altı dakika santrifüj edin ve süpernatantı vakum aspiratörlü aspire edin.Daha sonra, %10 FBS ile bir mililitre PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve Trypan Blue olmadan hemositometredeki hücreleri sayın. Orta ivme ve sitosantrifüj kullanarak 12 kez g'de her numunenin 120 mikrolitresini üç dakika boyunca kaydıraklarüzerine santrifüj edin. Slaytları bir gecede kurumaya bırakın.Ertesi gün, hem eferositik hem de diferansiyel hücre sayılarını hesaplamak için slaytları hematoksilin ve eozin le lekelayın. Ardından, 20X veya 40X hedefi kullanarak biyolojik bir mikroskop üzerinde Brightfield ayarı altında slaytları görüntüleyin. Apoptotik Jurkat T hücrelerini apoptotik hücre alımı olmadan alveoler makrofajlara fagositli alveoler makrofajların oranına göre eferositik indeksini hesaplayın ve her slayttan en az 200 hücre sayın.Bu protokol ozon maruziyetinin akciğer iltihabı üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılmıştır. Ozon maruz fareler filtrelenmiş hava kontrol grubuna göre hava alanında makrofajlar ve nötrofiller bir artış gösterdi ve BAL proteinbir artış vardı, alveoler epitel disfonksiyonu bir belirteç. Farelerin dosing önce, Jurkat T hücrelerinde apoptosis akış sitometri ile doğrulandı.60 milli joule UV maruz kalma düzeyi ve dört saatlik kuluçka süresi yaklaşık% 75 apoptotik hücrelerin tekrarlayan sonuçlar sonuçlandı. Eferositik makrofajlar, normal alveoler makrofajlara göre Jurkat T hücresini içine alan makrofajlar olarak tanımlandı. Ozon maruzkalan grubun eferositik indeksinde ozon kaynaklı pulmoner inflamasyonun apoptotik hücrelerin azalması ile ilişkili olduğunu gösteren filtrelenmiş hava kontrollerine göre anlamlı bir azalma saptandı.Detaylara dikkat etmek ve gözlenen farklılıkların yazılması bu işlem sırasında çok önemlidir. Ayrıca analiz için örnekleri kör ve iki farklı kişi makrofajlar saymak için tavsiye edilir. İzolasyondan sonra BAL hücreleri mRNA analizi için kullanılabilir, immünoresans tarafından ek belirteçler için boyanabilir ve/veya henotik değişiklikleri ayırt etmek için akış sitometresi üzerinde çalıştırılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em&gt; Leishmania</em&gt; Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

Akış Cytometry tarafından Kemirgen Plasmodium parazitemi Vivo Değerlendirilmesi ve Merozoit Invasion

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Tespiti için Manyetik Karıştırıcı Yöntemi<em&gt; Trichinella</emKas Samples&gt; Larva

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Fare kemik iliği ve Periton makrofaj harekete geçirmek antikor bazlı ilaçlara etkileri değerlendirilmesi

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...