Name: single synapse indicators of glutamate release and uptake in acute brain slices from normal and huntington mice
Uploaded: 2020-03-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice at JoVE.com

这项工作得到了CHDI（A-12467）、德国研究基金会（Exc 257/1和DFG项目ID327654276 + SFB 1315）和Charité校内研究基金的支持。我们感谢伦敦圣乔治大学K.Türék和利物浦大学的N.Helassa，感谢他们的iGluu质粒和许多有益的讨论。D. 贝坦斯和A.舍恩赫尔提供了出色的技术援助。

所有工作均按照欧盟第2010/63/欧盟动物实验指令进行，并在柏林卫生保护和技术安全办公室（G0233/14和G0218/17）注册。
注：Q175 野生类型 （WT） 和异种 （HETs） 的录音可以在任何年龄和性别进行。在这里，我们研究了51至76周的男性和女性。
1. 注射谷氨酸传感器 iGluu，用于在科蒂科斯塔阿克斯中表达
<ol><li>使用移液器拉拔器（一步模?...

实验涉及一个普遍感兴趣的问题 ——突触不依赖及其在神经退化过程中可能失去的问题，我们描述了一种识别老年（>1年）小鼠急性脑切片中受影响的突触的新方法。利用最近引入的谷氨酸传感器 iGluu的改进动力学特性，实验以前所未有的方式阐明突触谷氨酸释放和服用之间的关系。
谷氨酸清除对突触功能和维持的影响没有很好地阐明，虽然谷氨酸引起的兴奋毒性可...

属于"单一连接"（即2个神经细胞之间的连接）的每个突触终端的相对影响通常由其对脑后神经元11、22的初始部分的影响来评估。体素和/或从后鼻神经神经元的树突状记录代表最常见的，直到现在，也是澄清自上而下或垂直透视33，4，54,5下信息处理的最有效手段。然而，星形细胞的存在及其离散和（在啮齿动物）非重叠区域可能有助于一个水平视角，基于在突触站点66，7，8，9，107,8,9,10的局部信号交换、集成和同步机制。
因为,众所周知，天体胶原体在神经退行性疾病11、12,12的发病机制中起着重要作用，特别是在谷胱甘肽突触13、14、15、1614的维持和可塑性方面起着重要作用13，可以想象，突触性能的变化会随着星形细胞在不同来源的共享靶区状态而演变。15,16为了进一步探索在健康和疾病方面目标/天体胶衍生的局部监管机制，有必要评估单个突触。制定本办法是为了估计功能性谷氨酸释放和清除指标的范围，并确定可用于识别与运动启动最密切相关的大脑区域（即首先在运动皮层和背纹体）中功能失调（或恢复）突触的标准。
纹状体缺乏内在谷胱甘肽神经元。因此，相对容易识别外分源的谷氨酸。后者主要起源于丘脑中和大脑皮层（见17，18，19，2018,19,20更多）。17皮质科斯特里亚特突触是由在皮质层2/3和5中局部的金字塔神经元的斧子形成的。各自的斧头通过更具有组织性地构成金字塔地带（PT）的光纤系统形成双端脑内 （IT） 连接或 ipsi边连接。另据介绍，IT型和PT型终端的发布特性和尺寸21、22,22不同。鉴于这些数据，人们也可以预期在谷氨酸的处理上会有一些差异。
纹状体是亨廷顿舞蹈症（HD）5中受影响最大的脑区。人类HD是一种严重的遗传性神经退行性疾病。Q175鼠标模型提供了一个机会来研究低动力学刚性形式的HD的细胞基础，这种状态与帕金森主义有很多共同之处。从大约1岁开始，同源Q175小鼠（HOM）表现出低血症的迹象，通过测量在开放场23中不运动所花的时间来揭示出来。目前对异血Q175小鼠（HET）的实验证实了在HOM观察到的先前运动缺陷，此外，观察到的马达缺陷伴随着在皮质分泌突触终端24附近出现星形外皮氨基酸输送器2蛋白（EAAT2）水平的下降。因此，人们推测，天体性谷氨酸的缺乏可能导致功能障碍，甚至失去各自的突触25，26。25,
在这里，我们描述了一种新方法，它允许人们根据释放的神经递质的量评估单个突触谷氨酸间隙。新的谷氨酸传感器iGluu在皮质激素金字塔神经元中表达。它由卡塔林Türük27开发，代表了先前引入的高亲和力，但缓慢的谷氨酸传感器iGluSnFR28的修改。两个传感器都是增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的衍生物。有关光谱和动力学特性，请参阅赫拉萨等人27。简而言之，iGluu是一种低亲和力传感器，具有快速去活化动力学，因此特别适合研究谷氨酸释放突触端子的谷氨酸间隙。iGluu的分离时间常数是在停止流装置中确定的，在 20°C 下，Tau的脱位值为 2.1 毫秒，但推断到温度为 34 °C27时为 0.68 毫秒。在2光子显微镜下，在有机细胞海马培养的CA1区域，在34°C下探测的单舍弗辅助终端，平均衰变时间常数为2.7毫秒。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereo microsope</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PZMIII</td>
			<td>Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51500D</td>
			<td>Digital Lab New Standard stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed drill equipment</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>514439V</td>
			<td>Foredom K1070 cromoter Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53311</td>
			<td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 5 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>75RN Syr (26s/51/2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser positioning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA-40</td>
			<td>UGA-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue laser for iGluu excitation</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-473-020-S</td>
			<td>473 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for 473 nm</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>ROE TB-355-405-473</td>
			<td>Dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1P upright microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1066-600</td>
			<td>Axioskop 2 FS Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 63x/1.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>421480-9900</td>
			<td>W Plan-Apochromat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>44-00-20</td>
			<td>Achroplan 4x/0,10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for iGluu</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>XF2030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for iGluu</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>XF3086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>QMAX_DI580LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for autofluorescence subtr.</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>QMAX EM600-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>ZYLA4.2PCL10</td>
			<td>ZYLA 4.2MP Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqusition software</td>
			<td>Andor</td>
			<td>4.30.30034.0</td>
			<td>Solis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895035</td>
			<td>InstruTECH LIH8+8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquisition software</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895153</td>
			<td>TIDA5.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode positioning system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical stimulator</td>
			<td>Charite workshops</td>
			<td>STIM-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td>Vibrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown/Flaming-type puller</td>
			<td>Sutter Instr</td>
			<td>SU-P1000</td>
			<td>P-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes for injection pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes forstimulation pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>R100-F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120054</td>
			<td>TTX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iGluu plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>106122</td>
			<td>pCI-syn-iGluu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q175 mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>27410</td>
			<td>Z-Q175-KI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single synapse indicators of glutamate release and uptake in acute brain slices from normal and huntington mice

突触是高度分节的功能单元，相互独立地运行。在亨廷顿舞蹈症 （HD） 和其他神经退行性疾病中，由于谷氨酸清除不足以及由此产生的溢出和溢出效应，这种独立性可能会受到损害。前突起性终端和/或树突脊柱的天体细胞覆盖率改变，谷氨酸释放部位谷氨酸转运器簇的缩小，都与导致头晕/超激症症状的疾病发病机制有关。然而，导致HD谷胱甘肽突触功能障碍的机制并不十分了解。改进和应用突触成像，我们获得了数据，为阻碍运动启动的机制提供了新的曙光。在这里，我们描述了一种相对便宜的方法，通过使用新的基因编码的超快谷氨酸传感器iGluu，宽场光学，科学的CMOS（sCMOS）相机，473纳米激光和激光定位系统，以评估从年龄适当的健康或患病小鼠急性切片皮质分泌突触的状态，实现单突触分辨率的原理元素。谷氨酸瞬变由单像素或多个像素构造，根据活性区旁边的谷氨酸浓度[Glu]的最大海拔获得谷氨酸释放估计值，ii） 谷氨酸上升，反映在阴囊 [Glu] 的衰减时间常数 （TauD） 中。休息的回合大小和短期可塑性对比模式的差异是确定属于端脑内 （IT） 或金字塔道 （PT） 路径的皮质质间端子的标准。使用这些方法，我们发现，在有症状的HD小鼠+40%的PT型皮质突触显示谷氨酸间隙不足，这表明这些突触可能面临兴奋毒性损伤的风险。研究结果强调了TauD作为亨廷顿小鼠功能失调突触的生物标志物的效用，这种生物标志物具有低动力学表型。

两种皮质质谷类性变异性鉴定 IT 和 PT 亲和力分别源自第 2/3 层和第 5 层，在 ipsi边和反向（仅限 IT 终端）纹状体中表现出差分冲压和终止模式。仍然鲜为人知的谷氨酸释放和清除在重复激活条件下的特性，在运动开始期间观察到，但它是有充分记录，相应的谷氨酸释放变数在大小22不同。应用尺寸标准，发现IT和PT终端呈现出对比形式的短期可塑性24?...

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Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

我们提出了一个协议，以评估成年小鼠急性切片中单皮质谷胱甘肽突触的谷氨酸释放和间隙之间的平衡。该协议使用荧光传感器iGluu进行谷氨酸检测，sCMOS摄像机用于信号采集和用于聚焦激光照明的设备。

正常小鼠和亨廷顿小鼠急性脑切片中谷氨酸释放和服用的单突触指标

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

单突触的高分辨率成像表示快速谷氨酸传感器，可检测发射机释放和吸收之间的局部不匹配。在疾病的情况下，此方法可用于识别功能失调的突触。对于自动荧光校正，首先，将感兴趣的小鼠的脑片放入单光子显微镜的录音室。将切片浸入氧化的人工脑脊液中，并使用 20 倍水浸目标定位后体线状体。在铂琴上用尼龙网格固定切片，以最大限度地减少组织运动，并切换到 63 倍水浸目标。使用 510 纳米的高通滤波器，一起获取自动荧光和谷氨酸传感器正结构的图像。使用 600 纳米的高通滤波器，单独获取自动荧光结构的第二个图像。要定义范围，请使用 10 个最亮像素和 10 个最暗像素的均值强度缩放红色和黄色图像。然后，对黄色减去红色图像进行减法，重新缩放减去的图像，以生成标准 8 位 TIFF 文件，以方便地可视化感兴趣的回合。要搜索响应灵敏的电管，您需要一个合适的玻璃微管进行电刺激。使用微移管拉拔器从内尖直径约一微米的硅酸盐玻璃毛细管中产生刺激移液器。要从一组候选的电毒中寻找谷氨酸的操作潜在依赖释放，请选择 63 倍放大倍率和 510 纳米发射过滤器。加载减除的图像，以便将玻璃刺激电极放置在荧光度旁边，避免靠近额外的轴子。在什么变种与最大分叉或分配在切片的更深部分。将刺激电极放在感兴趣的电位附近并关闭灯，因为录音必须在完全黑暗中进行。然后，打开多通道浴池应用系统，一个通道提供标准沐浴解决方案，其他通道提供离子通道、运输器或膜受体（包括四恶英）的必要阻滞剂，以阻止作用潜在的生成。控制记录现场的流量，打开刺激器，向刺激移液器提供2至10微安的去极化电流脉冲。释放现在通过直接钙通过电压门控通道流入激活。要在间隙中可视化谷氨酸释放，使用显微镜 X、Y 驱动器，将测试的谷氨酸传感器阳性 bouton 置于视场中心附近。停止采集后，单击鼠标左键的图像以确定休息的回合中心的 X、Y 位置。将显示设置光标的 X、Y 坐标。使用校准数据，使用指示的公式计算应发送激光束以激发谷氨酸传感器荧光的站点的坐标。若要在激光控制软件中创建一个点序列，请在激光控制软件序列页面上的"添加到序列"框中选择点，并将运行和运行延迟设置为零，并在 TLL 上运行序列。然后，单击"开始"序列。在摄像机控制软件中，选择适当的成像参数，然后为触发模式选择外部启动。单击相机控制软件中的接收信号。然后，启动为触发装置制定的实验协议，并在适当的时间轴上实现实验协议试验，使摄像机在一次试验中获得400帧，频率为2.48千赫，重复频率为0.1赫兹或更低。要识别病理突触，请打开高程例程并计算所选感兴趣区域的荧光强度、平均值和标准偏差。确定和装箱由荧光强度大于平均值加上三个标准差的像素占用的区域，并假设以超阈值区域的圆形形式以微米为单位的虚拟直径。根据时间绘制荧光强度，因为实际荧光强度值与休息时荧光强度值之间的差值除以余点荧光强度值。确定荧光响应的峰值振幅。对荧光响应峰值的衰变执行单一远位拟合，并确定衰减的时间常数 TauD。要估计给定突触的最大振幅，请选择荧光强度变化最大的像素，这是向突触的间隙机械呈现的谷氨酸负载的最佳指标。单突触成像可用于使用大小和配对脉冲比标准识别两类皮质突触。在20至50毫秒的刺激间隔下，较小的肠内间终端容易成对脉冲凹陷，而较大的金字塔路端子则显示配对脉冲促进。对表达亨廷顿表型的野生型小鼠和小鼠进行的运动行为测试，揭示了在开放领域中运行的总路径结果与延迟步骤之间的显著正相关关系。此外，单突触谷氨酸成像显示，有症状的亨廷顿舞蹈鼠表现出的朱克斯塔辛帕氏谷氨酸衰变速度的不足，反映在谷氨酸对单突触刺激反应的TauD值中。在野生类动物中，只有在使用选择性的、不可运输的谷氨酸吸收抑制剂后，才观察到这种延长。对野生型小鼠切片中给定 TauD 值的发生概率的评估，以及表达亨廷顿舞蹈症症状的小鼠，发现在野生型动物中，TauD 的发生概率永远不会超过 15 毫秒。然而，在症状性亨廷顿舞蹈症中，40%的突触在16至58毫秒之间表现出TauD值，尽管释放的谷氨酸的量有减少的趋势。因此，TauD可能被视为亨廷顿舞蹈症中功能失调突触的生物标志物，并可能进一步用于验证针对星体谷氨酸运输的实验中的功能恢复。这种在单个皮质突触中谷氨酸监测的协议可能有助于澄清谷氨酸吸收缺乏在神经退行性疾病发病机制中的作用。单突触成像对于探索兴奋突触的突触前位点特别有用。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

突触改变老化过程中淀粉样蛋白病理研究从大鼠和转基因小鼠海马急性片的制备

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

科研

神经科学

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

在大鼠脑片的单通道和补品GABA激活电流

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

双突触诱发的星形胶质细胞和神经元的反应，在急性海马脑片电生理记录

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

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成神经细胞迁移的小鼠急性脑片在体内电穿孔产后和时间推移成像

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

神经微电路急性脑片电生理和形态特征采用配对膜片钳记录

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

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用优化的n-甲基 d-葡乙胺保护恢复法制备急性脑切片

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

小容积回收-灌注-浸没式室系统中维持的急性海马切片的突触可塑性记录

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

海马鼠脑切片的突触密度评价

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

粉扑诱导的全细胞电流在脑切片中的应用

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

Evaluation of Hemisphere Lateralization with Bilateral Local Field Potential Recording in Secondary Motor Cortex of Mice

小鼠二次运动皮质中双边局部场电位记录半球横向化评价

This article demonstrates complete, detailed procedures for both in vivo bilateral recording and analysis of local field potential (LFP) in the cortical ...