Name: single synapse indicators of glutamate release and uptake in acute brain slices from normal and huntington mice
Uploaded: 2020-03-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par CHDI (A-12467), la Fondation allemande de recherche (Exc 257/1 et DFG Project-ID 327654276 - SFB 1315) et les Fonds de recherche intra-muros de la Charité. Nous remercions K. Tûrôk, St. George’s, Université de Londres, et N. Helassa, Université de Liverpool, pour l’iGluu plasmid et de nombreuses discussions utiles. D. Betances et A. Schonherr ont fourni une excellente assistance technique.

Tous les travaux ont été effectués conformément à la directive de l’UE 2010/63/UE pour les expériences animales et ont été enregistrés au Bureau de la protection de la santé et de la sécurité technique de Berlin (G0233/14 et G0218/17).
REMARQUE : Les enregistrements de type sauvage Q175 (WT) et hétérozygotes (HET) peuvent être effectués à tout âge et sexe. Ici, nous avons étudié les hommes et les femmes à un âge de 51 à 76 semaines.
1...

Les expériences concernent une question d’intérêt général — l’indépendance synapse et sa perte possible au cours de la neurodégénérescence, et nous décrivons une nouvelle approche pour identifier les synapses affectées dans les tranches cérébrales aigues des souris âgées (1 an). Profitant des caractéristiques cinétique améliorées du capteur de glutamate récemment introduit iGluu les expériences éclairent la relation entre la libération synaptique de glutamate et l’absorption d’...

L’impact relatif de chaque terminal synaptique appartenant à une « connexion unitaire » (c.-à-d. la connexion entre 2 cellules nerveuses) est généralement évalué par son influence sur le segment initial du neurone postynaptique1,2. Les enregistrements somatiques et/ou dendritiques des neurones postsynaptiques représentent les moyens les plus courants et, jusqu’à présent, aussi les moyens les plus productifs de clarifier le traitement de l’information sous une perspective descendante ou verticale3,4,5. Cependant, la présence d’astrocytes avec leurs territoires discrets et (chez les rongeurs) non-overlapping peut contribuer à une perspective horizontale qui est basée sur les mécanismes locaux d’échange de signaux, d’intégration et de synchronisation aux sites synaptiques6,7,8,9,10.
Parce qu’on sait que les astroglias jouent, en général, un rôle majeur dans la pathogénie de la maladie neurodégénérative11,12 et, en particulier, un rôle dans l’entretien et la plasticité des synapses glutamatergiques13,14,15,16, il est concevable que les modifications de la performance synaptique évoluent en fonction de l’état des astrocytes dans la zone cible partagée des fibres afferentes avec diverses origines. Pour explorer davantage les mécanismes de réglementation locaux dérivés de la cible/astroglia dans la santé et la maladie, il est nécessaire d’évaluer les synapses individuelles. La présente approche a été élaborée pour estimer la gamme d’indicateurs fonctionnels de rejet et de dégagement du glutamate et pour définir des critères qui peuvent être utilisés pour identifier les synapses dysfonctionnelles (ou récupérées) dans les zones du cerveau les plus étroitement liées à l’initiation des mouvements (c.-à-d. tout d’abord dans le cortex moteur et le striatum dorsale).
Le striatum manque de neurones glutamatergiques intrinsèques. Par conséquent, il est relativement facile d’identifier les afferents glutamatergiques d’origine extrastriatale. Ce dernier provient principalement du thalamus médial et du cortex cérébral (voir17,18,19,,20 pour plus). Les synapses corticostriatales sont formées par les axones des neurones pyramidaux localisés dans les couches corticales 2/3 et 5. Les axones respectifs forment des connexions bilatérales intra-télencéphaliques (IT) ou des connexions ipsilateral via un système de fibres qui constitue plus caudally le tractus pyramidal (PT). Il a également été suggéré que les terminaux de type IT et PT diffèrent dans leurs caractéristiques de libération et la taille21,22. Compte tenu de ces données, on pourrait également s’attendre à des différences dans le traitement du glutamate.
Le striatum est la zone du cerveau la plus touchée dans la maladie de Huntington (HD)5. La MH humaine est un trouble neurodégénératif génétiquement héréditaire grave. Le modèle de souris Q175 offre l’occasion d’étudier la base cellulaire de la forme hypokinétique-rigide de la MH, un état qui a beaucoup en commun avec le parkinsonisme. À partir d’un âge d’environ 1 an, les souris homozygote Q175 (HOM) présentent des signes d’hypokinésie, comme révélé en mesurant le temps passé sans mouvement dans un champ ouvert23. Les expériences actuelles avec des souris hétérozygote Q175 (HET) ont confirmé les déficits moteurs précédents observés dans LE CDM et, en outre, ont montré que les déficits moteurs observés étaient accompagnés d’un niveau réduit du transporteur d’acide aminé excitatoire astrocytique 2 protéine (EAAT2) dans le voisinage immédiat des terminaux synaptiques corticostriatal24. Il a donc été supposé qu’un déficit dans l’absorption astrocytique de glutamate pourrait conduire à un dysfonctionnement ou même à la perte de synapses respectives25,26.
Ici, nous décrivons une nouvelle approche qui permet d’évaluer le dégagement unique de glutamate de synapse par rapport à la quantité du neurotransmetteur libéré. Le nouveau capteur de glutamate iGluu a été exprimé dans les neurones pyramidaux corticostriatal. Il a été développé par Katalin Târôk27 et représente une modification du capteur de glutamate de haute affinité précédemment introduit mais lent iGluSnFR28. Les deux capteurs sont des dérivés de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP). Pour les caractéristiques spectrales et cinétiques, voir Helassa et al.27. En bref, iGluu est un capteur de faible affinité avec une cinétique rapide de désactivation et donc particulièrement bien adapté pour étudier le dégagement de glutamate aux terminaux synaptiques de glutamate-libération. La constante de temps de dissociation d’iGluu a été déterminée dans un dispositif d’arrêt-flux, qui a rendu un Tauhors valeur de 2,1 ms à 20 oC, mais 0,68 ms lorsqu’il est extrapolé à une température de 34 oC27. Les terminaux collatéraux Schaffer simples sondés à 34 oC avec balayage de laser en spirale dans la région de CA1 des cultures hippocampales organotypiques sous un microscope de 2-photon ont montré une constante moyenne de temps de décomposition de 2,7 ms.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereo microsope</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PZMIII</td>
			<td>Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51500D</td>
			<td>Digital Lab New Standard stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed drill equipment</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>514439V</td>
			<td>Foredom K1070 cromoter Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53311</td>
			<td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 5 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>75RN Syr (26s/51/2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser positioning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA-40</td>
			<td>UGA-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue laser for iGluu excitation</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-473-020-S</td>
			<td>473 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for 473 nm</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>ROE TB-355-405-473</td>
			<td>Dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1P upright microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1066-600</td>
			<td>Axioskop 2 FS Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 63x/1.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>421480-9900</td>
			<td>W Plan-Apochromat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>44-00-20</td>
			<td>Achroplan 4x/0,10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for iGluu</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>XF2030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for iGluu</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>XF3086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>QMAX_DI580LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for autofluorescence subtr.</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>QMAX EM600-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>ZYLA4.2PCL10</td>
			<td>ZYLA 4.2MP Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqusition software</td>
			<td>Andor</td>
			<td>4.30.30034.0</td>
			<td>Solis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895035</td>
			<td>InstruTECH LIH8+8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquisition software</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895153</td>
			<td>TIDA5.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode positioning system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical stimulator</td>
			<td>Charite workshops</td>
			<td>STIM-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td>Vibrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown/Flaming-type puller</td>
			<td>Sutter Instr</td>
			<td>SU-P1000</td>
			<td>P-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes for injection pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes forstimulation pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>R100-F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120054</td>
			<td>TTX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iGluu plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>106122</td>
			<td>pCI-syn-iGluu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q175 mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>27410</td>
			<td>Z-Q175-KI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single synapse indicators of glutamate release and uptake in acute brain slices from normal and huntington mice

Les synapses sont des unités fonctionnelles hautement compartimentées qui fonctionnent indépendamment les unes sur les autres. Dans la maladie de Huntington (MH) et d’autres troubles neurodégénératifs, cette indépendance pourrait être compromise en raison de l’élimination insuffisante du glutamate et des effets de déversement et de déversement qui en résultent. La couverture astrocytique altérée des terminaux et/ou des épines dendritiques altérées ainsi qu’une taille réduite des grappes de transport de glutamate aux sites de rejet de glutamate ont été impliquées dans la pathogénie des maladies ayant pour résultat des symptômes de dys-/hyperkinésie. Cependant, les mécanismes menant au dysfonctionnement des synapses glutamatergiques dans la MH ne sont pas bien compris. Améliorer et appliquer l’imagerie synapse, nous avons obtenu des données jetant un nouvel éclairage sur les mécanismes empêchant l’initiation des mouvements. Ici, nous décrivons les principaux éléments d’une approche relativement peu coûteuse pour atteindre une seule résolution synapse en utilisant le nouveau capteur de glutamate ultra-rapide génétiquement codé iGluu, optique à champ large, une caméra scientifique CMOS (sCMOS), un laser de 473 nm et un système de positionnement laser pour évaluer l’état des synapses corticostriatales dans les tranches aigues de souris saines ou malades appropriées de l’âge. Les transitoires de glutamate ont été construites à partir de pixels simples ou multiples pour obtenir des estimations de la libération de glutamate i) basée sur l’élévation maximale de la concentration de glutamate [Glu] à côté de la zone active et ii) l’absorption de glutamate comme reflété dans la constante de temps de décomposition (TauD) du perisynaptique [Glu]. Les différences dans la taille du bouton de repos et les modèles contrastés de plasticité à court terme ont servi de critères pour l’identification des terminaux corticostriatal comme appartenant à la voie intratelencéphalique (IT) ou du tractus pyramidal (PT). En utilisant ces méthodes, nous avons découvert que chez les souris MH symptomatiques - 40% des synapses corticostriatal de type PT présentaient un dégagement insuffisant de glutamate, ce qui suggère que ces synapses pourraient être à risque de dommages excitoxiques. Les résultats soulignent l’utilité du TauD en tant que biomarqueur des synapses dysfonctionnelles chez les souris Huntington avec un phénotype hypokinétique.

Identification de deux types de varicosses glutamatergiques corticostriatale Les afferents d’it et de PT proviennent respectivement des couches 2/3 et 5, et présentent des modèles différentiels de ramification et de terminaison dans le striatum ipsilateral et contralatéral (terminaux IT seulement). On sait encore peu de choses sur les propriétés de la libération et du dégagement du glutamate dans des conditions d’activation répétitives observées lors de l’initiation des mouvements, ma...

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Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Nous présentons un protocole pour évaluer l’équilibre entre la libération de glutamate et le dégagement aux synapses glutamatergics corticostriatal simples dans des tranches aigues des souris adultes. Ce protocole utilise le capteur fluorescent iGluu pour la détection de glutamate, une caméra sCMOS pour l’acquisition du signal et un dispositif pour l’éclairage laser focal.

Indicateurs synapses uniques de la libération et de l’absorption des glutamates dans les tranches cérébrales aigues des souris normales et huntingtones

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

L’imagerie haute résolution de synapses simples exprimant un capteur de glutamate rapide permet de détecter l’inadéquation locale entre la libération de l’émetteur et l’absorption. Dans le cas de la maladie, cette méthode peut être utilisée pour identifier les synapses dysfonctionnelles. Pour la correction de l’autofluorescence, d’abord, placez une tranche de cerveau de la souris d’intérêt dans la chambre d’enregistrement d’un microscope à un photon.Submergez la tranche dans du liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné et utilisez l’objectif d’immersion d’eau 20x pour localiser le striatum dorsal. Fixez les tranches avec une grille en nylon sur une harpe platine pour minimiser le mouvement des tissus et passez à l’objectif d’immersion d’eau 63x. À l’aide d’un filtre à passage élevé à 510 nanomètres, acquérir ensemble une image des structures positives du capteur autofluorescent et glutamate.À l’aide d’un filtre à passage élevé à 600 nanomètres, acquérir une deuxième image des structures autofluorescentes seules. Pour définir la plage, utilisez les intensités moyennes des 10 pixels les plus brillants et les 10 pixels les plus foncés pour mettre à l’échelle les images rouges et jaunes. Ensuite, effectuez une soustraction de l’image jaune moins rouge et recalez l’image soustraite pour générer un fichier TIFF 8 bits standard pour une visualisation pratique du bouton d’intérêt.Pour effectuer une recherche de boutons réactifs, vous avez besoin d’une micropipette en verre appropriée pour la stimulation électrique. Utilisez un puller à micropipette pour produire des pipettes de stimulation à partir de capillaires en verre borosilicate avec des diamètres internes d’environ un micromètre. Pour sonder la libération potentielle dépendante d’action du glutamate à partir d’un ensemble de boutons candidats, sélectionnez un grossissement 63x et un filtre à émission de 510 nanomètres.Chargez l’image soustraite pour permettre le placement d’une électrode de stimulation en verre à côté d’une varicosité fluorescente, en évitant la proximité d’axones supplémentaires. Dans quelles varicosités associées à une bifurcation ou une allocation maximale dans une partie plus profonde de la tranche. Placez l’électrode de stimulation près du bouton d’intérêt et éteignez la lumière, car les enregistrements doivent être exécutés dans l’obscurité totale.Ensuite, allumez le système d’application de bain multicanal, avec un canal fournissant la solution de bain standard et les autres canaux fournissant les bloqueurs nécessaires des canaux iions, transporteurs, ou récepteurs membranaires, y compris la tétrototoxine pour bloquer la génération potentielle d’action. Contrôler le débit sur le site de l’enregistrement et allumer le stimulateur pour fournir des impulsions actuelles dépolarisantes de deux à 10 microampes à la pipette de stimulation. La libération est maintenant activée par l’afflux direct de calcium par des canaux fermés de tension.Pour visualiser la libération de glutamate dans le dégagement, en utilisant le microscope X, Y lecteurs, placer le capteur de glutamate testé bouton positif près du centre viewfield. Après avoir arrêté l’acquisition, cliquez sur l’image avec le bouton de la souris gauche pour déterminer la position X et Y du centre bouton de repos. Les coordonnées X et Y du curseur de l’ensemble seront affichées.À l’aide des données d’étalonnage, calculer les coordonnées du site où le faisceau laser doit être envoyé pour l’excitation de la fluorescence du capteur de glutamate en utilisant les formules comme indiqué. Pour créer une séquence d’un point dans le logiciel de contrôle laser, sélectionnez le point dans la boîte ajouter à la séquence sur la page de séquence du logiciel de contrôle laser et définir les courses et exécuter le retard à zéro, et la séquence à exécuter à TLL. Ensuite, cliquez sur séquence de démarrage.Dans le logiciel de contrôle de la caméra, sélectionnez les paramètres d’imagerie appropriés et sélectionnez le démarrage externe pour le mode déclencheur. Cliquez sur prendre le signal dans le logiciel de contrôle de la caméra. Ensuite, lancez le protocole expérimental établi pour le dispositif déclencheur, et implémentez l’essai de protocole expérimental avec la chronologie appropriée, de sorte que la caméra va acquérir 400 images avec une fréquence de 2,48 kilohertz au cours d’un essai, avec une fréquence de répétition de 0,1 hertz ou inférieure.Pour identifier les synapses pathologiques, activez les routines d’élévation et calculez l’intensité de fluorescence, l’écart moyen et type pour la région d’intérêt choisie au repos. Déterminer et boxer la zone occupée par des pixels dont l’intensité de fluorescence est supérieure à la moyenne plus trois écarts types, et déterminer un diamètre virtuel en microns en supposant une forme circulaire de la zone supra-seuil. Tracez l’intensité de fluorescence par rapport au temps, car la différence entre la valeur réelle d’intensité de fluorescence et la valeur d’intensité de fluorescence au repos divisée par la valeur d’intensité de fluorescence au repos.Déterminer l’amplitude maximale de la réponse à la fluorescence. Effectuez un raccord monoexponentiel pour la désintégration à partir du pic de la réponse de fluorescence, et déterminez la constante de temps de décomposition, TauD. Pour estimer l’amplitude maximale à une synapse donnée, sélectionnez le pixel avec le changement le plus élevé de l’intensité de fluorescence, qui est le meilleur indicateur de la charge de glutamate présentée aux machines de dégagement de la synapse.L’imagerie synapse unique peut être utilisée pour identifier deux classes de synapses cortostriatales en utilisant les critères de taille et de rapport d’impulsion appariés. À des intervalles de stimulus de 20 à 50 millisecondes, les plus petits terminaux interenterochephalic sont enclins à la dépression appariée d’impulsion, alors que les plus grands terminaux pyramidaux de région ont montré la facilitation appariée d’impulsion. Les essais sur le comportement moteur effectués sur des souris et des souris de type sauvage exprimant un phénotype huntington, révèlent une coorélation positive significative entre les résultats obtenus pour la course totale de chemin dans le champ ouvert, et l’étape au-dessus de la latence.En outre, la formation image simple de glutamate de synapse montre que les souris symptomatiques de Huntington ont exhibé un déficit dans la vitesse de la décomposition juxtasynpatic de glutamate comme reflété dans les valeurs de TauD des réponses de glutamate à la stimulation simple de synapse. Chez les animaux de type sauvage, une telle prolongation n’a été observée qu’après l’application d’un inhibiteur sélectif et non transportable de l’absorption du glutamate. L’évaluation de la probabilité d’occurrence d’une valeur taud donnée en tranches de souris de type sauvage, et des souris exprimant les symptômes de la maladie de Huntington, a révélé que chez les animaux de type sauvage, taud ne dépasse jamais 15 millisecondes.Dans la maladie symptomatique de Huntington cependant, 40% des synapses montrent des valeurs de TauD entre 16 et 58 millisecondes, en dépit d’une tendance pour une réduction de la quantité de glutamate libéré. Par conséquent, taud pourrait être considéré comme un biomarqueur pour les synapses dysfonctionnelles dans la maladie de Huntington, et peut encore être utilisé pour vérifier la récupération fonctionnelle dans des expériences ciblant le transport astrocytique glutamate. Ce protocole pour la surveillance de glutamate aux synapses corticostriatal individuelles peut aider à clarifier le rôle de l’insuffisance d’absorption de glutamate dans la pathogénie de la maladie neurodegenerative.L’imagerie synapse unique est particulièrement utile pour explorer les sites présynaptiques des synapses excitatrices.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Préparation des coupes d&#39;hippocampe aiguë chez des rats et des souris transgéniques pour l&#39;étude des altérations synaptiques au cours du vieillissement et de l&#39;amylose pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

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