Name: single synapse indicators of glutamate release and uptake in acute brain slices from normal and huntington mice
Uploaded: 2020-03-11T12:30:00
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इस काम को CHDI (A-12467), जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (Exc 257/1 और DFG प्रोजेक्ट-आईडी 327654276 - SFB 1315) और चारिट के इंट्राम्यूरल रिसर्च फंड्स द्वारा समर्थित किया गया था। हम के Török, सेंट जॉर्ज, लंदन विश्वविद्यालय, और एन Helassa, लिवरपूल विश्वविद्यालय, iGluयू प्लाज्मिड और कई उपयोगी चर्चा के लिए शुक्रिया अदा करते हैं । डी Betances और ए Schönherr उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रदान की है ।

सभी काम यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63/यूरोपीय संघ के अनुसार पशु प्रयोगों के लिए किया गया है और स्वास्थ्य संरक्षण और तकनीकी सुरक्षा के बर्लिन कार्यालय में पंजीकृत किया गया था (G0233/14 और G0218/17) ।
नोट: ...

प्रयोग सामान्य रुचि का सवाल है - न्यूरोडिज़नरेशन के दौरान निर्भरता और इसके संभावित नुकसान की चिंता है, और हम वृद्ध (>1 वर्ष) चूहों से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में प्रभावित सिनेप्स की पहचान करने के लिए एक नए ?...

"एकात्मक कनेक्शन" (यानी, 2 तंत्रिका कोशिकाओं के बीच संबंध) से संबंधित प्रत्येक सिनैप्टिक टर्मिनल का सापेक्ष प्रभाव आमतौर पर पोस्टसिनैप्टिक न्यूरॉन1,,2के प्रारंभिक खंड पर इसके प्रभाव से मूल्यांकन किया जाता है। पोस्टसिनैप्टिक न्यूरॉन्स से दैहिक और/या डेंड्रिटिक रिकॉर्डिंग सबसे आम का प्रतिनिधित्व करती है और अब तक, टॉप-डाउन या वर्टिकल पर्सनैलिटी3,4,4,5के तहत सूचना प्रसंस्करण को स्पष्ट करने का सबसे उत्पादक साधन भी है । हालांकि, उनके असतत और (कृंतक में) गैर-ओवरलैपिंग क्षेत्रों के साथ एस्ट्रोसाइट्स की उपस्थिति एक क्षैतिज परिप्रेक्ष्य में योगदान दे सकती है जो सिनैप्टिक साइटों6,,7,,8,,9,,10पर सिग्नल एक्सचेंज, एकीकरण और सिंक्रोनाइजेशन के स्थानीय तंत्र पर आधारित है।
क्योंकि यह ज्ञात है कि खगोलग्लिया सामान्य रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग11,,12 के रोगजनकों में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं और विशेष रूप से, ग्लूटाजेक्शियल सिनेप्स13,14,,,15,,16के रखरखाव और प्लास्टिसिटी में एक भूमिका, यह बोधगम्य है कि सिनैप्टिक प्रदर्शन में परिवर्तन एस्ट्रोसाइट्स की स्थिति के अनुसार विकसित होता है। स्वास्थ्य और रोग में लक्ष्य/एस्ट्रोग्लिया-व्युत्पन्न स्थानीय नियामक तंत्रों का और पता लगाने के लिए, व्यक्तिगत सिनेप्स का मूल्यांकन करना आवश्यक है । वर्तमान दृष्टिकोण कार्यात्मक ग्लूटामेट रिलीज और निकासी संकेतकों की सीमा का अनुमान लगाने और मानदंडों को परिभाषित करने के लिए तैयार किया गया था जिसका उपयोग मस्तिष्क क्षेत्रों में बेकार (या बरामद) सिनेप्स की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो आंदोलन दीक्षा से निकटता से संबंधित है (यानी, मोटर कॉर्टेक्स और डोर्सल स्ट्रेटम में सबसे पहले)।
स्ट्रेटम में आंतरिक ग्लूटामर्गिक न्यूरॉन्स का अभाव है। इसलिए, एक्स्ट्राट्राइटल मूल के ग्लूटामर्गिक एफ्रेरेंट की पहचान करना अपेक्षाकृत आसान है। उत्तरार्द्ध ज्यादातर मध्यस्थ थैलेसीमिया में और सेरेब्रल कॉर्टेक्स में उत्पन्न होता है (अधिक के लिए17,,18,,19,,20 देखें)। कोर्टिकोस्टल सिनेप्स कॉर्टिकल परतों 2/3 और 5 में स्थानीयकृत पिरामिड न्यूरॉन्स के अक्षों द्वारा बनाए जाते हैं। संबंधित एक्सोन एक फाइबर सिस्टम के माध्यम से द्विपक्षीय इंट्रा-टेलेएन्सेफेलिक (आईटी) कनेक्शन या ipsilateral कनेक्शन बनाते हैं जो अधिक कारण पिरामिड पथ (पीटी) का गठन करता है। यह भी सुझाव दिया गया है कि आईटी और पीटी-प्रकार के टर्मिनल उनकी रिहाई विशेषताओं और आकार21,22में भिन्न होते हैं । इन आंकड़ों को ध्यान में रखते हुए, कोई भी ग्लूटामेट की हैंडलिंग में कुछ मतभेदों की उम्मीद कर सकता है।
स्ट्रेटम हंटिंगटन की बीमारी (एचडी)5में सबसे अधिक प्रभावित मस्तिष्क क्षेत्र है । मानव एचडी एक गंभीर आनुवंशिक रूप से विरासत में मिला न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है। Q175 माउस मॉडल एचडी के हाइपोकाइनेटिक-कठोर रूप के सेलुलर आधार की जांच करने का अवसर प्रदान करता है, एक ऐसा राज्य जो पार्किंसंस के साथ बहुत आम है। लगभग 1 वर्ष की उम्र से शुरू, होमोज़िगोट Q175 चूहों (HOM) हाइपोकिनेसिया के लक्षण प्रदर्शित करते हैं, जैसा कि खुले मैदान23में आंदोलन के बिना बिताए गए समय को मापने से पता चला है। हेट्रोजिगोट Q175 चूहों (एचएटी) के साथ वर्तमान प्रयोगों ने HOM में देखे गए पिछले मोटर घाटे की पुष्टि की और इसके अलावा, यह पता चला कि देखी गई मोटर घाटे के साथ कॉर्टिकोस्टल सिनैप्टिकटर्मिनल2 केतत्काल आसपास एस्ट्रोसाइटिक एक्सेक्टेटरी अमीनो एसिड ट्रांसपोर्टर 2 प्रोटीन (EAAT2) का स्तर कम था। इसलिए यह परिकल्पना की गई है कि एस्ट्रोसाइटिक ग्लूटामेट तेज होने से25,26से संबंधित सिनेप्स की शिथिलता या हानि भी हो सकती है .
यहां, हम एक नए दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं जो जारी न्यूरोट्रांसमीटर की मात्रा के सापेक्ष एकल सिनेप्स ग्लूटामेट निकासी का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। नए ग्लूटामेट सेंसर iGluयू कोर्टिकोस्टरिटल पिरामिड न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था । इसे काटालिन टोरोक27 द्वारा विकसित किया गया था और पहले से पेश किए गए उच्च आत्मीयता लेकिन धीमी ग्लूटामेट सेंसर iGluSnFR28के संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है। दोनों सेंसर बढ़े हुए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) के डेरिवेटिव हैं। स्पेक्ट्रल और गतिज विशेषताओं के लिए, हेलसा एट अल27देखें । संक्षेप में, iGluu तेजी से डी-एक्टिवेशन काइनेटिक्स के साथ एक कम आत्मीयता सेंसर है और इसलिए विशेष रूप से ग्लूटामेट-रिलीजिंग सिनैप्टिक टर्मिनलों पर ग्लूटामेट क्लीयरेंस का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। iGluu के विच्छेदन समय स्थिर एक बंद प्रवाह डिवाइस में निर्धारित किया गया था, जो 20 डिग्री सेल्सियस पर 2.1 एमएस के मूल्यसे एक ताऊ प्रदान की है, लेकिन 0.68 एमएस जब 34 डिग्री सेल्सियस27के तापमान के लिए बहिष्कृत. एकल Schaffer संपाश्र्वक टर्मिनलों एक 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत organotypic हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों के CA1 क्षेत्र में सर्पिल लेजर स्कैनिंग के साथ ३४ डिग्री सेल्सियस पर जांच २.७ एमएस के क्षय के एक मतलब समय निरंतर प्रदर्शित ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereo microsope</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PZMIII</td>
			<td>Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51500D</td>
			<td>Digital Lab New Standard stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed drill equipment</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>514439V</td>
			<td>Foredom K1070 cromoter Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53311</td>
			<td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 5 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>75RN Syr (26s/51/2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser positioning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA-40</td>
			<td>UGA-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue laser for iGluu excitation</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-473-020-S</td>
			<td>473 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for 473 nm</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>ROE TB-355-405-473</td>
			<td>Dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1P upright microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1066-600</td>
			<td>Axioskop 2 FS Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 63x/1.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>421480-9900</td>
			<td>W Plan-Apochromat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>44-00-20</td>
			<td>Achroplan 4x/0,10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for iGluu</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>XF2030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for iGluu</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>XF3086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>QMAX_DI580LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for autofluorescence subtr.</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>QMAX EM600-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>ZYLA4.2PCL10</td>
			<td>ZYLA 4.2MP Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqusition software</td>
			<td>Andor</td>
			<td>4.30.30034.0</td>
			<td>Solis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895035</td>
			<td>InstruTECH LIH8+8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquisition software</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895153</td>
			<td>TIDA5.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode positioning system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical stimulator</td>
			<td>Charite workshops</td>
			<td>STIM-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td>Vibrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown/Flaming-type puller</td>
			<td>Sutter Instr</td>
			<td>SU-P1000</td>
			<td>P-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes for injection pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes forstimulation pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>R100-F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120054</td>
			<td>TTX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iGluu plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>106122</td>
			<td>pCI-syn-iGluu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q175 mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>27410</td>
			<td>Z-Q175-KI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single synapse indicators of glutamate release and uptake in acute brain slices from normal and huntington mice

सिनेप्स अत्यधिक विभाजित कार्यात्मक इकाइयां हैं जो एक दूसरे पर स्वतंत्र रूप से काम करती हैं। हंटिंगटन रोग (एचडी) और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में, अपर्याप्त ग्लूटामेट निकासी और परिणामस्वरूप फैल-इन और फैल-आउट प्रभावों के कारण इस स्वतंत्रता से समझौता किया जा सकता है। प्रेग्नेंसी टर्मिनलों और/या डेंड्रिटिक कताई के साथ-साथ ग्लूटामेट रिलीज साइटों पर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर समूहों के कम आकार के परिवर्तित एस्ट्रोसाइटिक कवरेज को डायस/हाइपरकिनेशिया के लक्षणों के परिणामस्वरूप बीमारियों के रोगजनन में फंसाया गया है । हालांकि, एचडी में ग्लूटाम्जिक सिनेप्स की शिथिलता के लिए अग्रणी तंत्र अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहा है। सुधार और synapse इमेजिंग लागू हम आंदोलनों की दीक्षा में बाधा तंत्र पर नई रोशनी बहा डेटा प्राप्त किया है । यहां, हम नए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अल्ट्राफास्ट ग्लूटामेट सेंसर iGluयू,वाइड-फील्ड ऑप्टिक्स, एक वैज्ञानिक सीएमओएस (sCMOS) कैमरा, एक 473 एनएम लेजर और एक लेजर पोजिशनिंग सिस्टम का उपयोग करके एक अनिवार्य रूप से सस्ती दृष्टिकोण के सिद्धांत तत्वों का वर्णन करते हैं ताकि उम्र उपयुक्त स्वस्थ या रोग से तीव्र स्लाइस में कोर्टिकोस्टल सिनेप्स की स्थिति का मूल्यांकन किया जा सके। ग्लूटामेट क्षणिकों का निर्माण एकल या कई पिक्सल से किया गया था, जो मैं का अनुमान प्राप्त करने के लिए) सक्रिय क्षेत्र के बगल में ग्लूटामेट एकाग्रता [ग्लू] की अधिकतम ऊंचाई के आधार पर ग्लूटामेट रिलीज और 2) ग्लूटामेट तेज के रूप में पेरिसिनैप्टिक [ग्लू] के क्षय (TauD) के निरंतर समय में परिलक्षित होता है। आराम के बावन आकार और अल्पकालिक प्लास्टिसिटी के विषम पैटर्न में अंतर इंट्राटेलेएंसेफेलिक (आईटी) या पिरामिड ट्रैक्ट (पीटी) मार्ग से संबंधित कॉर्टिकोस्टरिटल टर्मिनलों की पहचान के लिए मानदंड के रूप में कार्य करता है। इन तरीकों का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि रोगसूचक एचडी चूहों में ~ 40% पीटी-प्रकार कॉर्टिकोस्टरीटल सिनेप्स ने अपर्याप्त ग्लूटामेट क्लीयरेंस का प्रदर्शन किया, जिससे यह सुझाव दिया गया कि इन सिनेप्स को एक्सिटोटॉक्सिक क्षति का खतरा हो सकता है। परिणाम एक हाइपोकाइनेटिक फेनोटाइप के साथ हंटिंगटन चूहों में बेकार सिनेप्स के बायोमार्कर के रूप में TauD की उपयोगिता को रेखांकित करते हैं।

कॉर्टिकोस्ट्रीटल ग्लूटामर्गिक वैरिकेजिटीज के दो प्रकार की पहचान आईटी और पीटी एफिडेंस क्रमशः परत 2/3 और 5 में उत्पन्न होते हैं, और आईपीएसआइलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल (केवल आईटी टर्मिनल) स्ट्राइटम म?...

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Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

हम वयस्क चूहों से तीव्र स्लाइस में एकल कोर्टिकोस्टल ग्लूटामिटल ग्लूटाएग्नेस सिनेप्स में ग्लूटामेट रिलीज और निकासी के बीच संतुलन का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। यह प्रोटोकॉल ग्लूटामेट डिटेक्शन के लिए फ्लोरोसेंट सेंसर iGluयू, सिग्नल अधिग्रहण के लिए एक एससीएमओएस कैमरा और फोकल लेजर रोशनी के लिए एक डिवाइस का उपयोग करता है।

ग्लूटामेट रिलीज के एकल सिनैप्स संकेतक और सामान्य और हंटिंगटन चूहों से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में तेज

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

एक फास्ट ग्लूटामेट सेंसर व्यक्त करने वाले एकल सिनैप्स का उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग ट्रांसमीटर रिलीज और तेज के बीच स्थानीय बेमेल का पता लगाने की अनुमति देता है। बीमारी के मामले में, इस विधि का उपयोग बेकार सिनेप्स की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। ऑटोफ्लोरेसेंस सुधार के लिए, सबसे पहले, ब्याज के माउस से एक मस्तिष्क टुकड़ा एक फोटॉन माइक्रोस्कोप के रिकॉर्डिंग कक्ष में रखें।ऑक्सीजनयुक्त, कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ में टुकड़ा जलमग्न करें और पृष्ठीय स्ट्राटम का पता लगाने के लिए 20x पानी-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें। ऊतक आंदोलन को कम करने के लिए प्लैटिनम वीणा पर एक नायलॉन ग्रिड के साथ स्लाइस को ठीक करें, और 63x पानी-विसर्जन उद्देश्य पर स्विच करें। 510 नैनोमीटर पर एक उच्च पास फिल्टर का उपयोग करना, ऑटोफ्लोरेट और ग्लूटामेट सेंसर सकारात्मक संरचनाओं की एक छवि को एक साथ प्राप्त करें।600 नैनोमीटर पर एक उच्च पास फ़िल्टर का उपयोग करना, अकेले ऑटोफ्लोरेटेंट संरचनाओं की दूसरी छवि प्राप्त करें। सीमा को परिभाषित करने के लिए, लाल और पीले रंग की छवियों को स्केल करने के लिए 10 प्रतिभाशाली और 10 अंधेरे पिक्सेल की औसत तीव्रता का उपयोग करें। फिर, पीले शून्य से लाल छवि का घटाव करें और ब्याज के बाउटन के सुविधाजनक दृश्य के लिए एक मानक 8-बिट झगड़ा फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए घटाया छवि को फिर से रीस्कैल करें।उत्तरदायी boutons के लिए एक खोज करने के लिए, आप विद्युत उत्तेजना के लिए एक उपयुक्त ग्लास माइक्रोपिपेट की जरूरत है। लगभग एक माइक्रोमीटर के आंतरिक टिप व्यास के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से उत्तेजना पिपेट का उत्पादन करने के लिए माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करें। उम्मीदवार boutons के एक सेट से ग्लूटामेट की संभावित निर्भर रिहाई की कार्रवाई के लिए जांच करने के लिए, एक 63x आवर्धन और एक 510 नैनोमीटर उत्सर्जन फिल्टर का चयन करें।अतिरिक्त एक्सॉन की निकटता से बचने, फ्लोरोसेंट वैरिकासिटी के बगल में ग्लास उत्तेजना इलेक्ट्रोड के प्लेसमेंट की अनुमति देने के लिए घटाया छवि लोड करें। स्लाइस के गहरे हिस्से के भीतर अधिकतम विभाजन या आवंटन से जुड़ी वैरिकोसिटीज में क्या। उत्तेजना इलेक्ट्रोड को ब्याज के बाउटन के पास रखें और प्रकाश को बंद कर दें, क्योंकि रिकॉर्डिंग पूरी अंधेरे में की जानी चाहिए।फिर, मल्टी-चैनल बाथ एप्लीकेशन सिस्टम को चालू करें, जिसमें एक चैनल मानक स्नान समाधान प्रदान करता है और अन्य चैनल कार्रवाई संभावित उत्पादन को अवरुद्ध करने के लिए टेट्रोटोटॉक्सिन सहित आयन चैनलों, ट्रांसपोर्टरों या झिल्ली रिसेप्टर्स के आवश्यक ब्लॉकर्स वितरित करते हैं। रिकॉर्डिंग की साइट पर प्रवाह को नियंत्रित करें और उत्तेजना पिपेट में दो से 10 माइक्रोएम्प्स की वर्तमान दालों को डीपोलराइज करने के लिए उत्तेजक को चालू करें। रिलीज अब वोल्टेज गेटेड चैनलों के माध्यम से सीधे कैल्शियम प्रवाह द्वारा सक्रिय है ।माइक्रोस्कोप एक्स, वाई ड्राइव का उपयोग करके, क्लीयरेंस में ग्लूटामेट रिलीज की कल्पना करने के लिए, परीक्षण किए गए ग्लूटामेट सेंसर सकारात्मक बाउटन को व्यूफील्ड सेंटर के करीब रखें। अधिग्रहण को रोकने के बाद, एक्स, आराम bouton केंद्र की वाई स्थिति निर्धारित करने के लिए बाएं माउस बटन के साथ छवि पर क्लिक करें । सेट कर्सर के एक्स, वाई निर्देशांक प्रदर्शित किए जाएंगे।अंशांकन डेटा का उपयोग करके, साइट के निर्देशांक की गणना करें जहां संकेत के अनुसार सूत्रों का उपयोग करके ग्लूटामेट सेंसर फ्लोरेसेंस के उत्तेजन के लिए लेजर बीम भेजा जाना चाहिए। लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर में एक बिंदु अनुक्रम बनाने के लिए, लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर के अनुक्रम पृष्ठ पर अनुक्रम बॉक्स में जोड़ने में बिंदु का चयन करें और रन सेट और शून्य करने के लिए देरी चलाने के लिए, और अनुक्रम TLL में चलाने के लिए । इसके बाद स्टार्ट सीक्वेंस पर क्लिक करें।कैमरा कंट्रोल सॉफ्टवेयर में, उपयुक्त इमेजिंग पैरामीटर का चयन करें और ट्रिगर मोड के लिए बाहरी शुरुआत का चयन करें। कैमरा कंट्रोल सॉफ्टवेयर में सिग्नल लेने पर क्लिक करें। फिर, ट्रिगर डिवाइस के लिए निर्धारित प्रायोगिक प्रोटोकॉल शुरू करें, और उचित समयरेखा के साथ प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल परीक्षण को लागू करें, ताकि कैमरा एक परीक्षण के दौरान 2.48 किलोहर्ट्ज आवृत्ति के साथ 400 फ्रेम प्राप्त कर सके, जिसमें 0.1 हर्ट्ज या कम पुनरावृत्ति आवृत्ति होगी।रोग synapses की पहचान करने के लिए, ऊंचाई दिनचर्या चालू करें और आराम से ब्याज के चयनित क्षेत्र के लिए फ्लोरेसेंस तीव्रता, मतलब और मानक विचलन की गणना करें। निर्धारित करें और बॉक्स एक फ्लोरेसेंस तीव्रता के साथ पिक्सल द्वारा कब्जा कर लिया क्षेत्र मतलब प्लस तीन मानक विचलन से अधिक आराम पर, और माइक्रोन में एक आभासी व्यास निर्धारित अधिप्रा दहलीज क्षेत्र के एक परिपत्र रूप संभालने । समय के खिलाफ फ्लोरेसेंस तीव्रता को प्लॉट करें, क्योंकि वास्तविक फ्लोरेसेंस तीव्रता मूल्य और फ्लोरेसेंस तीव्रता मूल्य के बीच का अंतर बाकी पर फ्लोरेसेंस तीव्रता मूल्य से विभाजित होता है।फ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया के शिखर आयाम का निर्धारण करें। फ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया के शिखर से क्षय के लिए एक मोनोएक्सोनेंटियल फिटिंग करें, और क्षय, तौड के समय को स्थिर निर्धारित करें। किसी दिए गए सिनेप्स पर अधिकतम आयाम का अनुमान लगाने के लिए, फ्लोरेसेंस तीव्रता में सबसे अधिक परिवर्तन के साथ पिक्सेल का चयन करें, जो सिनेप्स की निकासी मशीनरी को प्रस्तुत ग्लूटामेट लोड का सबसे अच्छा संकेतक है।एकल सिनैप्स इमेजिंग का उपयोग आकार और युग्मित पल्स अनुपात मानदंडों का उपयोग करके कॉर्टिकोस्ट्रिटल सिनेप्स के दो वर्गों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। 20 से 50 मिलीसेकंड के प्रोत्साहन अंतराल पर, छोटे इंटरएंटरोपेफेलिक टर्मिनलों को पल्स डिप्रेशन से जोड़ा जाता है, जबकि बड़े पिरामिड ट्रैक्ट टर्मिनलों ने बनती हुई पल्स सुविधा दिखाई। जंगली प्रकार के चूहों और चूहों पर किए गए परीक्षण हंटिंगटन फेनोटाइप व्यक्त करते हैं, खुले मैदान में कुल पथ चलाने के लिए प्राप्त परिणामों के बीच एक महत्वपूर्ण सकारात्मक कूरिेशन प्रकट करते हैं, और विलंबता पर कदम।इसके अलावा, एकल सिनेप्स ग्लूटामेट इमेजिंग से पता चलता है कि रोगसूचक हंटिंगटन चूहों ने एक सिनेप्स उत्तेजना के लिए ग्लूटामेट प्रतिक्रियाओं के ताऊड मूल्यों में परिलक्षित के रूप में मुक़ाबला ग्लूटामेट क्षय की गति में कमी का प्रदर्शन किया। जंगली प्रकार के जानवरों में, इस तरह के दीर्घीकरण को केवल ग्लूटामेट तेज के चयनात्मक, गैर-परिवहनीय अवरोधक के आवेदन के बाद देखा गया था। जंगली प्रकार के चूहों से स्लाइस में दिए गए TauD मूल्य की घटना की संभावना का मूल्यांकन, और हंटिंगटन रोग के लक्षणों को व्यक्त करने वाले चूहों ने खुलासा किया कि जंगली प्रकार के जानवरों में, TauD कभी भी 15 मिलीसेकंड से अधिक नहीं होता है।रोगसूचक हंटिंगटन की बीमारी में हालांकि, 40% सिनेप्स जारी ग्लूटामेट की मात्रा में कमी की प्रवृत्ति के बावजूद, 16 और 58 मिलीसेकंड के बीच TauD मूल्यों का प्रदर्शन करते हैं। इसलिए, TauD को हंटिंगटन रोग में बेकार सिनेप्स के लिए एक बायोमार्कर के रूप में माना जा सकता है, और आगे एस्ट्रोसाइटिक ग्लूटामेट परिवहन को लक्षित करने वाले प्रयोगों में कार्यात्मक वसूली को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। व्यक्तिगत कोर्टिकोस्ट्रिटल सिनेप्सेस में ग्लूटामेट निगरानी के लिए यह प्रोटोकॉल न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के रोगजनकों में ग्लूटामेट तेज की कमी की भूमिका को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है।एकल सिनेप्स इमेजिंग उत्तेजक सिनेप्स की पूर्व-सिनेप्टिकल साइटों की खोज के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

चूहे और ट्रांसजेनिक चूहों से एजिंग और Amyloid पैथोलॉजी के दौरान Synaptic बदलाव के अध्ययन के लिए तीव्र hippocampal स्लाइस की तैयारी

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

चूहा मस्तिष्क स्लाइसें में GABA सक्रिय एकल चैनल और टॉनिक धाराओं

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

तीव्र hippocampal स्लाइस में Synaptically पैदा Astroglial और neuronal प्रतिक्रियाएँ की दोहरी electrophysiological रिकॉर्डिंग

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

माउस तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में Neuroblast प्रवासन के विवो प्रसव के बाद electroporation में और समय चूक इमेजिंग

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में neuronal microcircuits के electrophysiological और morphological विशेषता बनती पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

एक अनुकूलित N-मिथाइल-D-glucamine सुरक्षात्मक वसूली विधि का उपयोग कर तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

एक छोटी मात्रा रीसाइक्लिंग में बनाए रखा तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस में Synaptic प्लास्टिक रिकॉर्डिंग-, छिड़काव-, और डुबकी-प्रकार चैंबर प्रणाली

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

हिप्पोकैम्पस कुतर ब्रेन स्लाइसेस में Synapse घनत्व का मूल्यांकन

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

पूरे सेल धाराओं मस्तिष्क स्लाइस में गाबा के कश आवेदन द्वारा प्रेरित

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

Evaluation of Hemisphere Lateralization with Bilateral Local Field Potential Recording in Secondary Motor Cortex of Mice

चूहे के माध्यमिक मोटर कोर्टेक्स में द्विपक्षीय स्थानीय फील्ड संभावित रिकॉर्डिंग के साथ गोलार्ध पार्श्वीकरण का मूल्यांकन

This article demonstrates complete, detailed procedures for both in vivo bilateral recording and analysis of local field potential (LFP) in the cortical ...