Name: single synapse indicators of glutamate release and uptake in acute brain slices from normal and huntington mice
Uploaded: 2020-03-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da CHDI (A-12467), dalla Fondazione tedesca per la ricerca (Exc 257/1 e dal progetto-ID DFG 327654276 – SFB 1315) e dai fondi di ricerca intramurali della Charité. Ringraziamo K. T'r'k, St. George's, Università di Londra, e N. Helassa, Università di Liverpool, per l'iGluu plasmid e molte discussioni utili. D. Betances e A. Schànherr hanno fornito un'eccellente assistenza tecnica.

Tutti i lavori sono stati effettuati in conformità con la direttiva UE 2010/63/EU per esperimenti sugli animali ed è stato registrato presso l'Ufficio di Berlino per la protezione della salute e la sicurezza tecnica (G0233/14 e G0218/17).
NOTA: le registrazioni da Q175 wild-type (WT) ed heterozygotes (HET) possono essere eseguite a qualsiasi età e sesso. Qui abbiamo studiato maschi e femmine all'età di 51-76 settimane.
1. Iniezione del Sensore Glutamate i...

Gli esperimenti riguardano una questione di interesse generale : l'indipendenza da sinapsi e la sua possibile perdita nel corso della neurodegenerazione, e descriviamo un nuovo approccio per identificare le sinapsi colpite nelle fette cerebrali acute da topi invecchiati (>1 anno). Approfittando delle caratteristiche cinetiche migliorate del sensore di glutammato recentemente introdotto iGluu, gli esperimenti illuminano la relazione tra il rilascio e l'assorbimento del glutammato sinaptico in un modo che prima ...

L'impatto relativo di ogni terminale sinaptico appartenente a una "connessione unitaria" (cioè la connessione tra due cellule nervose) è tipicamente valutato dalla sua influenza sul segmento iniziale del neurone post-sinaptico1,2. Le registrazioni somatiche e/o dendritiche dei neuroni post-sinaptici rappresentano le più comuni e, fino ad ora, anche i mezzi più produttivi per chiarire l'elaborazione delle informazioni sotto una prospettiva top-down o verticale3,4,5. Tuttavia, la presenza di astrociti con i loro territori discreti e (in roditori) non sovrapposti può contribuire a una prospettiva orizzontale che si basa su meccanismi locali di scambio di segnale, integrazione e sincronizzazione nei siti sinaptici6,7,8,9,10.
Perché è noto che l'astroglia gioca, in generale, un ruolo importante nella patogenesi della malattia neurodegenerativa11,12 e, in particolare, un ruolo nel mantenimento e plasticità delle sinapsi glutamategiche13,14,15,,16, è concepibile che alterazioni delle prestazioni sinaptiche si evolvono in conformità con lo stato di astrociti nell'area di destinazione condivisa di fibre afferenti di varia origine. Per esplorare ulteriormente i meccanismi normativi locali di origine target/astroglia in materia di salute e malattia, è necessario valutare le singole sinapsi. L'approccio attuale è stato elaborato per stimare la gamma di indicatori funzionali di rilascio e gioco del glutammato e per definire i criteri che possono essere utilizzati per identificare le sinapsi disfunzionali (o recuperate) nelle aree cerebrali più strettamente correlate all'inizio del movimento (cioè, prima di tutto nella corteccia motoria e nello striato dorsale).
Lo striato manca di neuroni glutamatergici intrinseci. Pertanto, è relativamente facile identificare gli afferenti glutamatergici di origine extrastriata. Questi ultimi hanno per lo più origine nel talamo mediale e nella corteccia cerebrale (vedi17,18,19,20 per di più). Le sinapsi corticostriatali sono formate dagli assoni dei neuroni piramidali localizzati negli strati corticali 2/3 e 5. I rispettivi assoni formano connessioni bilaterali intratelefila (IT) o connessioni ipsilaterali attraverso un sistema in fibra che costituisce più caudalmente il tratto piramidale (PT). È stato inoltre suggerito che i terminali di tipo IT e PT differiscono per le loro caratteristiche di rilascio e dimensione21,22. Alla luce di questi dati, ci si potrebbe aspettare anche alcune differenze nella gestione del glutammato.
Lo striato è l'area cerebrale più colpita nella malattia di Huntington (HD)5. La MH umana è un grave disturbo neurodegenerativo geneticamente ereditato. Il modello murino Q175 offre l'opportunità di studiare la base cellulare della forma ipocinetica-rigida della MH, uno stato che ha molto in comune con il parkinsonismo. A partire da un'età di circa 1 anno, i topi omozigote Q175 (HOM) presentano segni di ipocinesia, come rivelato misurando il tempo trascorso senza movimento in un campo aperto23. I presenti esperimenti con topi eterozigote Q175 (HET) hanno confermato i precedenti deficit motori osservati nell'HOM e, inoltre, hanno dimostrato che i deficit motori osservati sono stati accompagnati da un livello ridotto dell'amminoacido eccitativo astrocitatorio trasportatore 2 proteine (EAAT2) nelle immediate vicinanze dei terminali sinaptici corticostriali24. È stato quindi ipotizzato che un deficit nell'assorbimento del glutammato astrocitico potrebbe portare a disfunzione o addirittura alla perdita delle rispettive sinapsi25,26.
Qui, descriviamo un nuovo approccio che permette di valutare l'autorizzazione del glutammato a sinapsi singola rispetto alla quantità del neurotrasmettitore rilasciato. Il nuovo sensore di glutammato iGluu è stato espresso nei neuroni piramidali corticostriatali. È stato sviluppato da Katalin T'r'k27 e rappresenta una modifica del sensore ad alta affinità ma lento del glutammato iGluSnFR28introdotto in precedenza. Entrambi i sensori sono derivati della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP). Per le caratteristiche spettrali e cinetiche, vedere Helassa et al.27. In breve, iGluu è un sensore a bassa affinità con cinetica di deattivazione rapida e quindi particolarmente adatto per studiare l'autorizzazione del glutammato nei terminali sinaptici che rilasciano glutammato. La costante del tempo di dissociazione di iGluu è stata determinata in un dispositivo di arresto del flusso, che ha reso un valore di spegnimento di Tau di 2,1 ms a 20 , ma 0,68 ms quando estrapolato ad una temperatura di 34 .off 27 I singoli terminali collaterali di Schaffer sondati a 34 gradi centigradi con la scansione a spirale nella regione CA1 delle colture organotipiche dell'ippocampo sotto un microscopio a 2 fotoni hanno mostrato una costante temporale media di decadimento di 2,7 ms.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereo microsope</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PZMIII</td>
			<td>Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51500D</td>
			<td>Digital Lab New Standard stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed drill equipment</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>514439V</td>
			<td>Foredom K1070 cromoter Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53311</td>
			<td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 5 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>75RN Syr (26s/51/2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser positioning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA-40</td>
			<td>UGA-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue laser for iGluu excitation</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-473-020-S</td>
			<td>473 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for 473 nm</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>ROE TB-355-405-473</td>
			<td>Dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1P upright microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1066-600</td>
			<td>Axioskop 2 FS Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 63x/1.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>421480-9900</td>
			<td>W Plan-Apochromat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>44-00-20</td>
			<td>Achroplan 4x/0,10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for iGluu</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>XF2030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for iGluu</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>XF3086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>QMAX_DI580LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for autofluorescence subtr.</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>QMAX EM600-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>ZYLA4.2PCL10</td>
			<td>ZYLA 4.2MP Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqusition software</td>
			<td>Andor</td>
			<td>4.30.30034.0</td>
			<td>Solis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895035</td>
			<td>InstruTECH LIH8+8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquisition software</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895153</td>
			<td>TIDA5.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode positioning system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical stimulator</td>
			<td>Charite workshops</td>
			<td>STIM-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td>Vibrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown/Flaming-type puller</td>
			<td>Sutter Instr</td>
			<td>SU-P1000</td>
			<td>P-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes for injection pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes forstimulation pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>R100-F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120054</td>
			<td>TTX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iGluu plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>106122</td>
			<td>pCI-syn-iGluu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q175 mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>27410</td>
			<td>Z-Q175-KI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single synapse indicators of glutamate release and uptake in acute brain slices from normal and huntington mice

Le sinapsi sono unità funzionali altamente compartimentate che operano in modo indipendente l'una sull'altra. Nella malattia di Huntington (HD) e in altri disturbi neurodegenerativi, questa indipendenza potrebbe essere compromessa a causa dell'insufficiente eliminazione del glutammato e dei conseguenti effetti di fuoriuscita e fuoriuscita. Una copertura astrocitica alterata dei terminali pressinaptici e/o delle spine dendritiche, nonché una dimensione ridotta degli ammassi trasportatori di glutammato nei siti di rilascio del glutammato sono state implicate nella patogenesi delle malattie che si sono manifestate sintomi di dis-ipercinesi. Tuttavia, i meccanismi che portano alla disfunzione delle sinapsi glutamategiche nella MH non sono ben compresi. Migliorando e applicando l'imaging a sinapsi abbiamo ottenuto dati che gettano nuova luce sui meccanismi che impediscono l'avvio dei movimenti. Qui, descriviamo gli elementi principali di un approccio relativamente poco costoso per ottenere una risoluzione a sinapsi singola utilizzando il nuovo sensore di glutammato ultraveloce codificato geneticamente iGluu, ottica a campo largo, una telecamera scientifica CMOS (sCMOS), un laser da 473 nm e un sistema di posizionamento laser per valutare lo stato delle sinapsi corticostriatali in fette acute da topi sani o malati appropriati. I transienti glutammati sono stati costruiti da uno o più pixel per ottenere stime del rilascio di i) glutammato in base all'elevazione massima della concentrazione di glutammato [Glu] accanto alla zona attiva e ii) assorbimento del glutammato come riflesso nella costante temporale di decadimento (TauD) del perissitico [Glu]. Le differenze nella dimensione dell'bouton a riposo e nei modelli contrastanti di plasticità a breve termine servivano come criteri per l'identificazione dei terminali corticostalati come appartenenti al percorso intratelencephalico (IT) o al tratto piramidale (PT). Utilizzando questi metodi, abbiamo scoperto che nei topi MH sintomatici il 40% delle sinapsi corticostriatali di tipo PT mostrava una scarsa distanza del glutammato, suggerendo che queste sinapsi potrebbero essere a rischio di danni da eccitotossici. I risultati sottolineano l'utilità del TauD come biomarcatore delle sinapsi disfunzionali nei topi di Huntington con un fenotipo iponetetico.

Identificazione di due tipi di glutamatesità corticostriatali Gli afferenti IT e PT hanno origine rispettivamente nei livelli 2/3 e 5 e presentano modelli di ramificazione e terminazione differenziali nello striato ipsilaterale e contralaterale (solo terminali IT). Si sa ancora poco sulle proprietà del rilascio e della clearance del glutammato in condizioni ripetitive di attivazione osservate durante l'avvio dei movimenti, ma è ben documentato che le rispettive varietà di rilascio del glutammato d...

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Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Presentiamo un protocollo per valutare l'equilibrio tra il rilascio del glutammato e l'autorizzazione alle singole sinapsi glutamatergiche corticosterogiche in fette acute di topi adulti. Questo protocollo utilizza il sensore fluorescente iGluu per il rilevamento del glutammato, una telecamera sCMOS per l'acquisizione del segnale e un dispositivo per l'illuminazione laser focale.

Indicatori di sinapsi singola di Soldamento Release e Uptake in Acute Brain Slices da Topi Normali e Huntington

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

L'imaging ad alta risoluzione di singole sinapsi che esprimono un sensore di glutammato veloce consente di rilevare la mancata corrispondenza locale tra il rilascio del trasmettitore e l'assorbimento. Nel caso della malattia, questo metodo può essere utilizzato per identificare sinapsi disfunzionali. Per la correzione dell'autofluorescenza, in primo luogo, posizionare una fetta cerebrale dal mouse di interesse nella camera di registrazione di un microscopio con un fotone.Immergere la fetta in liquido cerebrospinale ossigenato e artificiale e utilizzare l'obiettivo 20x di immersione in acqua per localizzare lo striato dorsale. Fissare le fette con una griglia di nylon su un'arpa di platino per ridurre al minimo il movimento del tessuto e passare all'obiettivo 63x di immersione in acqua. Utilizzando un filtro passa alto a 510 nanometri, acquisire un'immagine delle strutture positive del sensore autofluorescente e glutammato insieme.Utilizzando un filtro passa alto a 600 nanometri, acquisire una seconda immagine delle sole strutture autofluorescenti. Per definire l'intervallo, usate le intensità medie dei 10 pixel più luminosi e 10 più scuri per ridimensionare le immagini rosse e gialle. Quindi, eseguire una sottrazione dell'immagine gialla meno rossa e ridimensionare l'immagine sottratta per generare un file TIFF standard a 8 bit per una comoda visualizzazione del bouton di interesse.Per eseguire una ricerca di bouton reattivi, è necessaria una micropipetta di vetro adatta per la stimolazione elettrica. Utilizzare un estrattore di micropipette per produrre pipette di stimolazione da capillari in vetro borosilicato con diametri di punta interni di circa un micrometro. Per sondare il potenziale rilascio dipendente di glutammato da una serie di bouton candidati, selezionare un ingrandimento 63x e un filtro di emissione da 510 nanometri.Caricare l'immagine sottratta per consentire il posizionamento di un elettrodo di stimolazione del vetro accanto a una varicosità fluorescente, evitando la vicinanza di assoni aggiuntivi. In quali variacosità associate a una massima biforcazione o allocazione all'interno di una parte più profonda della fetta. Posizionare l'elettrodo di stimolazione vicino al bouton di interesse e spegnere la luce, poiché le registrazioni devono essere eseguite in completa oscurità.Quindi, accendi il sistema di applicazione del bagno multicanale, con un canale che fornisce la soluzione da bagno standard e gli altri canali che forniscono i blocchi necessari dei canali ionici, dei trasportatori o dei recettori a membrana, inclusa la tetrototossina per bloccare la potenziale generazione di azione. Controllare il flusso nel sito di registrazione e accendere lo stimolatore per fornire impulsi di corrente depolarizzante da due a 10 microambi alla pipetta di stimolazione. Il rilascio è ora attivato dall'afflusso diretto di calcio attraverso canali gated di tensione.Per visualizzare il rilascio di glutammato nel gioco, utilizzando le unità X, Y del microscopio, posizionare il bouton positivo del sensore di glutammato testato vicino al centro del campo visivo. Dopo aver interrotto l'acquisizione, fare clic sull'immagine con il pulsante sinistro del mouse per determinare la posizione X, Y del centro bouton a riposo. Verranno visualizzate le coordinate X, Y del cursore impostato.Utilizzando i dati di calibrazione, calcolare le coordinate del sito in cui deve essere inviato il raggio laser per l'eccitazione della fluorescenza del sensore di glutammato utilizzando le formule indicate. Per creare una sequenza di un punto nel software di controllo laser, selezionare il punto nella casella aggiungi alla sequenza nella pagina di sequenza del software di controllo laser e impostare le esecuzioni e il ritardo di esecuzione su zero e la sequenza da eseguire a TLL. Quindi, fare clic su sequenza iniziale.Nel software di controllo della fotocamera, selezionare i parametri di imaging appropriati e selezionare l'avvio esterno per la modalità trigger. Fare clic su prendi segnale nel software di controllo della fotocamera. Quindi, avviare il protocollo sperimentale previsto per il dispositivo trigger e implementare lo studio sperimentale del protocollo con la timeline appropriata, in modo che la fotocamera acquisisca 400 fotogrammi con una frequenza di 2,48 kilohertz durante una prova, con una frequenza di ripetizione di 0,1 hertz o inferiore.Per identificare le sinapsi patologiche, attivare le routine di elevazione e calcolare l'intensità della fluorescenza, la media e la deviazione standard per la regione di interesse selezionata a riposo. Determinare e boxare l'area occupata da pixel con un'intensità di fluorescenza a riposo maggiore della media più tre deviazioni standard, e determinare un diametro virtuale in micron assumendo una forma circolare dell'area di soglia sopra. Tracciare l'intensità della fluorescenza rispetto al tempo, come differenza tra il valore effettivo dell'intensità di fluorescenza e il valore di intensità della fluorescenza a riposo diviso per il valore di intensità della fluorescenza a riposo.Determinare l'ampiezza di picco della risposta di fluorescenza. Eseguire un raccordo monoesoderenziale per il decadimento dal picco della risposta di fluorescenza e determinare la costante di tempo di decadimento, TauD. Per stimare l'ampiezza massima ad una data sinapsi, selezionare il pixel con la più alta variazione di intensità di fluorescenza, che è il miglior indicatore del carico di glutammato presentato alla macchina di gioco della sinapsi.L'imaging a sinapsi singola può essere utilizzato per identificare due classi di sinapsi corticostriali utilizzando i criteri di dimensione e rapporto impulso accoppiato. A intervalli di stimolo da 20 a 50 millisecondi, i terminali interenterochefalici più piccoli sono soggetti a depressione dell'impulso accoppiata, mentre i terminali del tratto piramidale più grandi hanno mostrato una facilitazione dell'impulso accoppiata. I test sul comportamento motorio eseguiti su topi e topi di tipo selvatico che esprimono un fenotipo Huntington, rivelano una significativa coorelazione positiva tra i risultati ottenuti per il percorso totale eseguito nel campo aperto e il passaggio oltre la latenza.Inoltre, l'imaging del glutammato a sinapsi singola mostra che i topi Huntington sintomatici mostravano un deficit nella velocità di decadimento del glutammato giustanosi come riflesso nei valori taud delle risposte del glutammato alla stimolazione della singola sinapsi. Negli animali di tipo selvatico, tale prolungamento è stato osservato solo dopo l'applicazione di un inibitore selettivo e non trasportabile dell'assorbimento del glutammato. La valutazione della probabilità di insorgenza di un dato valore di TauD in fette di topi di tipo selvatico, e topi che esprimono i sintomi della malattia di Huntington, ha rivelato che negli animali di tipo selvatico, TauD non supera mai i 15 millisecondi.Nella malattia sintomatica di Huntington, tuttavia, il 40% delle sinapsi mostra valori di TauD tra 16 e 58 millisecondi, nonostante la tendenza alla riduzione della quantità di glutammato rilasciato. Pertanto, il TauD potrebbe essere considerato un biomarcatore per le sinapsi disfunzionali nella malattia di Huntington, e può essere ulteriormente utilizzato per verificare il recupero funzionale in esperimenti mirati al trasporto di glutammato astrocitico. Questo protocollo per il monitoraggio del glutammato nelle singole sinapsi corticostriali può aiutare a chiarire il ruolo della carenza di assorbimento del glutammato nella patogenesi della malattia neurodegenerativa.L'imaging a sinapsi singola è particolarmente utile per esplorare siti pre-sinaptici di sinapsi eccitatorie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l&#39;invecchiamento e Amiloide Patologia

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

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