Name: single synapse indicators of glutamate release and uptake in acute brain slices from normal and huntington mice
Uploaded: 2020-03-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice at JoVE.com

Эта работа была поддержана CHDI (A-12467), Немецким исследовательским фондом (Exc 257/1 и DFG Project-ID 327654276 - SFB 1315) и интрамуральными исследовательскими фондами Шарите. Мы благодарим К. Торека, Сент-Джордж, Лондонский университет, и Н. Хелассу, Ливерпульский университет, за плазмид iGluu и множество полезных дискуссий. Д. Бетанс и А. Шёнхерр оказали отличную техническую помощь.

Все работы были выполнены в соответствии с Директивой ЕС 2010/63/EU для экспериментов на животных и были зарегистрированы в Берлинском управлении по охране здоровья и технической безопасности (G0233/14 и G0218/17).
ПРИМЕЧАНИЕ: Записи из no 175 дикого типа (WT) и гетерозиготы (HETs) могу...

Эксперименты касаются вопроса общего интереса - синапсовой независимости и ее возможной потери в ходе нейродегенерации, и мы описываем новый подход к выявлению пораженных синапсов в острых ломтиках мозга от пожилых (зgt;1 год) мышей. Воспользовавшись улучшенными кинетической характери?...

Относительное влияние каждого синаптического терминала, принадлежащего к "унитарному соединению" (т.е. связь между 2 нервными клетками), как правило, оценивается по его влиянию на начальный сегмент постсинаптического нейрона1,2. Соматические и/или дендритные записи из постсинаптических нейронов представляют собой наиболее распространенные и, до сих пор, также наиболее продуктивные средства для уточнения обработки информации в сверху вниз или вертикальной точки зрения3,4,5. Однако наличие астроцитов с их дискретными и (у грызунов) неперекрывающихся территорий может способствовать горизонтальной перспективе, основанной на локальных механизмах обмена сигналами, интеграции и синхронизации на синапических участках66,77,88,10.10
Потому что известно, что астроглия играть, в общем, важную роль в патогенезе нейродегенеративного заболевания11,12 и, в частности, роль в поддержании и пластичности глутамерных синапсов13,14,15 ,16,16Можно себе представить, что изменения в синаптической производительности развиваться в соответствии с состоянием астроцитов в общей области. Для дальнейшего изучения целевых /астроглии, полученных местными механизмами регулирования в области здравоохранения и болезней, необходимо оценить отдельные синапсы. Нынешний подход был разработан для оценки диапазона функциональных показателей высвобождения и очистки глутамата и определения критериев, которые могут быть использованы для выявления дисфункциональных (или восстановленных) синапсов в областях мозга, наиболее тесно связанных с инициацией движения (т.е. в первую очередь в моторной коре и стриатуме).
Стриатум не хватает внутренних глутаматергических нейронов. Таким образом, относительно легко определить глутамерные афференты экстрастриатального происхождения. Последние в основном происходят в медиальной таламус и в коре головного мозга (см.17,,18,,19,,20 для более). Кортикостриатальные синапсы образуются аксонами пирамидальных нейронов, локализованных в корковых слоях 2/3 и 5. Соответствующие аксоны образуют двусторонние внутрителецефалические (ИТ) соединения или ipsilateral соединения через волоконную систему, которая более caudally представляет собой пирамидальный тракт (PT). Кроме того, было высказано предположение, что IT- и PT-типа терминалов отличаются по характеристикам выпуска и размер21,22. С учетом этих данных можно также ожидать некоторых различий в обращении с глутаматом.
Стриатум является наиболее пострадавших области мозга в болезни Гентингтона (HD)5. HD человека является тяжелым генетически наследственных нейродегенеративных расстройств. Модель мыши No175 дает возможность исследовать клеточную основу гипокинетико-жесткой формы БГ, состояния, которое имеет много общего с паркинсонизмом. Начиная с возраста около 1 года, гомозигота No 175 мышей (HOM) проявляют признаки гипокинезии, как показали путем измерения времени, проведенного без движения в открытом поле23. Нынешние эксперименты с гетерозиготными мышами No175 (HET) подтвердили предыдущий дефицит мотора, наблюдаемый в HOM, и, кроме того, показали, что наблюдаемый дефицит мотора сопровождался снижением уровня астроцитарной аминокислоты транспортера 2 белка (EAAT2) в непосредственной близости от кортикостриатических синапических терминалов24. Поэтому было предслоужно, что дефицит в астроцитарный глутамат поглощения может привести к дисфункции или даже потери соответствующих синапсов25,26.
Здесь мы описываем новый подход, который позволяет оценить один синапсный глутамат зазор по отношению к количеству выпущенного нейромедиатора. Новый датчик глутамата iGluu был выражен в кортикостриатических пирамидальных нейронов. Он был разработан Каталин Торек27 и представляет собой модификацию ранее введенного высокой сродства, но медленного датчика глутамата iGluSnFR28. Оба датчика являются производными улучшенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Для спектральных и кинетические характеристики, см Helassa и др.27. Кратко, iGluu является низким сродством датчик с быстрой деактивации кинетики и, следовательно, особенно хорошо подходит для изучения глутамата зазор на глутамат-релизы синаптических терминалов. Время диссоциации iGluu было определено в устройстве с останавливаетися потока, что оказало Тауот значения 2.1 ms при 20 градусах По Цельсия, но 0.68 ms при экстраполировании до температуры 34 c27. Одноместные терминалы обеспечения Schaffer исследовали на 34 градуса с спиральным лазерным сканированием в регионе CA1 органотипических гиппокампа культур под 2-фотонным микроскопом выставлены среднее время константы распада 2,7 мс.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereo microsope</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PZMIII</td>
			<td>Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51500D</td>
			<td>Digital Lab New Standard stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed drill equipment</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>514439V</td>
			<td>Foredom K1070 cromoter Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection system</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53311</td>
			<td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 5 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>75RN Syr (26s/51/2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser positioning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA-40</td>
			<td>UGA-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue laser for iGluu excitation</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-473-020-S</td>
			<td>473 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for 473 nm</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>ROE TB-355-405-473</td>
			<td>Dichroic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1P upright microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1066-600</td>
			<td>Axioskop 2 FS Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 63x/1.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>421480-9900</td>
			<td>W Plan-Apochromat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>44-00-20</td>
			<td>Achroplan 4x/0,10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror for iGluu</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>XF2030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for iGluu</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>XF3086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>QMAX_DI580LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for autofluorescence subtr.</td>
			<td>Omega optical</td>
			<td>QMAX EM600-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>ZYLA4.2PCL10</td>
			<td>ZYLA 4.2MP Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqusition software</td>
			<td>Andor</td>
			<td>4.30.30034.0</td>
			<td>Solis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD/DA converter</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895035</td>
			<td>InstruTECH LIH8+8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquisition software</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>895153</td>
			<td>TIDA5.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode positioning system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical stimulator</td>
			<td>Charite workshops</td>
			<td>STIM-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td>Vibrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown/Flaming-type puller</td>
			<td>Sutter Instr</td>
			<td>SU-P1000</td>
			<td>P-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes for injection pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes forstimulation pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>R100-F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120054</td>
			<td>TTX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iGluu plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>106122</td>
			<td>pCI-syn-iGluu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q175 mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>27410</td>
			<td>Z-Q175-KI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single synapse indicators of glutamate release and uptake in acute brain slices from normal and huntington mice

Синапсы являются высокоразрозненные функциональные единицы, которые работают независимо друг от друга. В болезни Гентингтона (HD) и других нейродегенеративных расстройств, эта независимость может быть поставлена под угрозу из-за недостаточного просвета глутамата и в результате разлива и разлива эффектов. Измененное астроцитарное покрытие пресинаптических терминалов и/или дендритных шипов, а также уменьшенный размер кластеров глутамата на участках высвобождения глутамата были вовлечены в патогенез заболеваний, приводящий к симптомам дис-/гиперкинезии. Тем не менее, механизмы, ведущие к дисфункции глутамерных синапсов в БГ не очень хорошо изучены. Улучшение и применение синапсов изображений мы получили данные, проливающие новый свет на механизмы, препятствующие инициированию движений. Здесь мы описываем основные элементы относительно недорогого подхода для достижения одного синапса резолюции с помощью нового генетически закодированного ультрабыстрого датчика глутамата iGluu, широкоугольной оптики, научной камеры CMOS (sCMOS), лазера 473 нм и лазерной системы позиционирования для оценки состояния кортикостриатальных синапсов в острых отрезков здорового возраста. Глютамат переходных были построены из одного или нескольких пикселей для получения оценок i) глутамата релиз на основе максимальной высоты концентрации глутамата (Глю) рядом с активной зоной и ii) поглощение глутамата, как отражено во времени постоянного распада (TauD) перисинаптического «Glu». Различия в размере покоя и контрастные модели краткосрочной пластичности служили критериями для идентификации кортикостриатальных терминалов как принадлежащих к интрателенцефалическому (ИТ) или пирамидальному тракту (PT). Используя эти методы, мы обнаружили, что в симптоматическом HD мышей 40% PT-типа кортикостриатических синапсов выставлены недостаточно глутамата зазор, предполагая, что эти синапсы могут быть подвержены риску excitotoxic повреждения. Результаты подчеркивают полезность TauD как биомаркера дисфункциональных синапсов у мышей Хантингтона с гипотинетическим фенотипом.

Выявление двух типов кортикостриатального глутаматергического варикозного расширения ИТ и PT афференты происходят в слое 2/3 и 5, соответственно, и демонстрируют дифференциальные последствия и модели прекращения в ипсилатеральной и контрлатеральной (только ИТ-терминалы) striat...

Watch this Scientific Journal Video about Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice at JoVE.com

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Мы представляем протокол для оценки баланса между высвобождение глутамата и очистки при одном кортикостриатических глутаматергических синапсах в острых ломтиках от взрослых мышей. Этот протокол использует флуоресцентный датчик iGluu для обнаружения глутамата, камеру sCMOS для получения сигнала и устройство для фокусного лазерного освещения.

Одноместный Synapse Показатели глюкамата релиз и поглощение в острый мозг фрагменты из нормальных и Хантингтон мышей

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Высокое разрешение изображения одиночных синапсов, выражаюющих быстрый датчик глутамата, позволяет обнаруживать локальное несоответствие между высвобождением передатчика и поглощением. В случае заболевания, этот метод может быть использован для выявления дисфункциональных синапсов. Для коррекции аутофторесценции, во-первых, поместите кусочек мозга из мыши, представляющих интерес, в камеру записи однофотографного микроскопа.Погрузите кусочек в кислородом, искусственной спинномозговой жидкости и использовать 20x воды погружения цели, чтобы найти спинной стриатум. Исправить ломтики с нейлоновой сетки на платиновой арфы, чтобы свести к минимуму движение ткани, и переключиться на 63x воды погружения цели. Используя фильтр высокого прохода на 510 нанометров, приобретайте изображение положительных структур датчика аутофторесцентного и глутамата.Используя фильтр высокого прохода на 600 нанометров, приобрести второе изображение автофлюоресцентных структур в одиночку. Чтобы определить диапазон, используйте средние интенсивности 10 самых ярких и 10 самых темных пикселей для масштабирования красных и желтых изображений. Затем выполните вычитание желтого минус красного изображения и перемасштабировуйте вычитаемое изображение для создания стандартного 8-битного файла TIFF для удобной визуализации ботона интереса.Для выполнения поиска отзывчивых бутонов, вам нужен подходящий стеклянный микропипют для электрической стимуляции. Используйте шкив micropipette для того чтобы произвести пипетки стимуляции от borosilicate стеклянных капилляров с внутренними диаметрами кончика около одного микрометра. Для зондирования для действий потенциально зависимого выпуска глутамата из набора кандидатов бутонов, выберите 63x увеличение и 510 нанометрового фильтра выбросов.Загрузите вычитаемое изображение, чтобы обеспечить размещение электрода стимуляции стекла рядом с флуоресцентной изменчивостью, избегая близости дополнительных аксонов. В какой изменчивости, связанные с максимальной бифуркации или распределения в более глубокой части среза. Поместите электрод стимуляции рядом с бойоном интереса и выключите свет, так как записи должны быть выполнены в полной темноте.Затем включите многоканальную систему применения ванны, при этом один канал поставляет стандартный раствор ванны, а другие каналы доставляют необходимые блокаторы ионных каналов, транспортеров или мембранных рецепторов, включая тетрототоксин для блокирования потенциальной генерации действия. Контролировать поток в месте записи и включить стимулятор для доставки деполяризации тока импульсов от двух до 10 микроампер для стимуляции пипетки. Выпуск теперь активируется прямым притоком кальция через закрытые каналы напряжения.Чтобы визуализировать высвобождение глутамата в клиренс, используя микроскоп X, Y диски, место испытания датчика глутамата положительный бутон близко к центру поля зрения. После остановки приобретения нажмите на изображение левой кнопкой мыши, чтобы определить положение X, Y в центре отдыха. Будут отображаться координаты X, Y курсора набора.Используя данные калибровки, вычислите координаты места, куда лазерный луч должен быть отправлен для возбуждения флуоресценции датчика глутамата, используя указанные формулы. Чтобы создать последовательность одной точки в программном обеспечении лазерного управления, выберите точку в поле добавления к последовательности на странице последовательности программного обеспечения лазерного управления и установите запуски и запуск задержки до нуля, и последовательность для запуска на TLL. Затем щелкните последовательность запуска.В программном обеспечении управления камерой выберите соответствующие параметры изображения и выберите внешний старт для триггерного режима. Нажмите принять сигнал в программном обеспечении управления камерой. Затем инициировать экспериментальный протокол, изложенный для триггерного устройства, и реализовать экспериментальное испытание протокола с соответствующей временной шкалой, так что камера будет приобретать 400 кадров с частотой 2,48 килогерца во время одного испытания, с 0,1 герц или ниже частоты повторения.Для выявления патологических синапсов включите режим высоты и рассчитайте интенсивность флуоресценции, среднее и стандартное отклонение для выбранной области интереса в состоянии покоя. Определите и коробите область, занятую пикселями с интенсивностью флуоресценции в покое, больше, чем среднее плюс три стандартных отклонения, и определите виртуальный диаметр микронов, предполагая круговую форму области надпого порога. Участок флуоресценции интенсивности со временем, как разница между фактическим значением интенсивности флуоресценции и значение интенсивности флуоресценции в покое делится на значение интенсивности флуоресценции в покое.Определите пиковую амплитуду реакции на флуоресценцию. Выполните моноэкспонентную установку для распада с пика реакции флуоресценции и определите время постоянного распада, TauD. Для оценки максимальной амплитуды при данной синапсе выберите пиксель с наибольшим изменением интенсивности флуоресценции, что является лучшим показателем нагрузки глутамата, представленной механизму очистки синапса.Одноразовая синапсовая визуализация может быть использована для определения двух классов кортикостриатальных синапсов с использованием критериев соотношения размера и парного импульса. С интервалом в 20-50 миллисекунд меньшие межэнтерохефалические терминалы подвержены парной депрессии пульса, в то время как более крупные терминалы пирамидального тракта показали парное упрощение пульса. Тесты на моторное поведение, выполняемые на мышах дикого типа и мышах, выражающихся фенотип Хантингтона, показывают значительное положительное coorelation между результатами, полученными для общего пути запустить в открытом поле, и шаг за задержкой.Кроме того, один синапс глутамат изображений показывает, что симптоматические мыши Хантингтон выставлены дефицит скорости juxtasynpatic глутамат распада, как это отражено в Значениях TauD глутамата ответы на одну стимуляцию синапса. У диких животных такое пролонгация наблюдалось только после применения селективного, не транспортируемого ингибитора поглощения глутамата. Оценка вероятности возникновения данного значения TauD в ломтиках от диких мышей, и мышей, выражающихся симптомы болезни Хантингтона, показали, что у диких животных, TauD никогда не превышает 15 миллисекунд.В симптоматической болезни Хантингтона однако, 40% синапсов экспонат TauD значения между 16 и 58 миллисекунд, несмотря на тенденцию к сокращению количества выпущенного глутамата. Таким образом, TauD может рассматриваться как биомаркер для дисфункциональных синапсов при болезни Хантингтона, и может быть дополнительно использован для проверки функционального восстановления в экспериментах, направленных на астроцитатический глутамат транспорта. Этот протокол для мониторинга глутамата в отдельных кортикостриатальных синапсов может помочь прояснить роль дефицита поглощения глутамата в патогенеза нейродегенеративных заболеваний.Однократная синапсовая визуализация особенно полезна для изучения досинаптических участков возбуждающих синапсов.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Подготовка острого срезах гиппокампа крыс и трансгенных мышей для изучения Synaptic Изменения в процессе старения и амилоида патологии

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

ГАМК-активированный Одноканальный с тоником токи в ломтики мозга крысы

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

В естественных послеродовой электропорации и Покадровый Визуализация из нейробласта миграции в Mouse острой мозга Ломтики

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Электрофизиологических и морфологических характеристик нейронов микросхем при остром мозга срезов при использовании парных патч-зажим Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Подготовка фрагментов острого мозга, с помощью оптимизированного N-метил-D-glucamine защитные восстановления метод

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Запись синаптической пластичности в острой гиппокампа ломтики в малообъемной рециркуляции-, перфузии и погружения типа камерная система

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Оценка плотности синапсов в срезах гиппокампа грызунов мозга

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Поклеточного течения индуцированных слоеного применение ГАМК в мозге ломтиками

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

Evaluation of Hemisphere Lateralization with Bilateral Local Field Potential Recording in Secondary Motor Cortex of Mice

Оценка латерализации полушария с двусторонней локальной полевой потенциальной записью во вторичном моторном кортексе мышей

This article demonstrates complete, detailed procedures for both in vivo bilateral recording and analysis of local field potential (LFP) in the cortical ...