Name: immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue
Uploaded: 2019-09-10T14:00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue at JoVE.com

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

تمت الموافقة على بروتوكولات الأنسجة من قبل Landesamt für Gesundheit und Soziales، برلين، ألمانيا (G0121/16). وأجريت التجارب وفقا للتوجيه الأوروبي 2010/63/EU بشأن رعاية الحيوانات ورفاهها ومعالجتها.
1. التثبيت، والجفاف، وتضمين البارافين، والقسم، وتركيب المقاطع
<ol><li>إعداد 2٪ محلول الفورمالديهايد عن طريق حل البارافورمالهايد في TBS (الحموضة 7.4). تجنب التدفئة فوق 60 درجة مئوية. بارد لRT. يمكن تخزين محلول الفورمالديهايد في -20 درجة مئوية.</li>
	<li>ضع الأنسجة الطازجة (هنا: رئة الماوس) في طبق بيتري زجاجي مع TBS. مع مشرط، تشريح إلى قطع لا تتجاوز 20 مم × 30 مم × 3 ملم في الحجم. تزج عينة في 2٪ محلول الفورمالديهايد في TBS. ملاحظة: يجب أن يكون حجم المثبت 20x على الأقل من الأنسجة.</li>
	<li>إصلاح في RT لمدة 8-20 ح. نقل العينات إلى TBS. مكان في أشرطة.</li>
	<li>الجفاف باستخدام سلسلة من الإيثانول (70٪، 80٪، 90٪، 96٪، 100٪، 100٪)، مع كل خطوة تدوم 1 ساعة.</li>
	<li>عينات واضحة 2X في 100٪ إكسيلين (ثنائي ميثيل البنزين)، كل خطوة 1 ح.</li>
	<li>نقع في البارافين 2X في 60 درجة مئوية (درجة حرارة ذوبان 54-56 درجة مئوية)، كل خطوة 1 ح.</li>
	<li>قم بتركيب العينات باستخدام قوالب التضمين، واستخدم أسفل الدرج كغطاء.</li>
	<li>اسمحوا البارافين ترسيخ وإزالة قوالب التضمين.</li>
	<li>إعداد 3 أقسام الأنسجة م، والسماح لهم تطفو على حمام المياه 37 درجة مئوية.</li>
	<li>تعويم أقسام على سطح الماء على الشرائح الزجاجية لاصقة(جدول المواد).</li>
	<li>أقسام الحضانة على الشرائح الزجاجية بين عشية وضحاها في 40 درجة مئوية لربط الأنسجة إلى الزجاج.</li>
</ol>2. الإماهة، والحرارة الناجمة عن الإزالة، وتلطيخ، وتصاعد، والتحليل المجهري
<ol><li>وضع أقسام على الشرائح الزجاجية في الرفوف وغمرها في وسائل الإعلام المستخدمة للجفاف والمقاصة، في ترتيب عكسي، مع كل خطوة لمدة 5 دقائق: 2X 100٪ إكسيلين، سلسلة الإيثانول (2X 100٪، 96٪، 90٪، 80٪، 70٪).</li>
	<li>يُسخّن حمام الماء مع طبق ساخن يتم التحكم في درجة حرارته إلى 70 درجة مئوية. وضع جرة مليئة باسترجاع الظهارة الناجمة عن الحرارة (HIER)-العازلة (درجة الحموضة 9؛ جدول المواد)،التي تحتوي على 10٪ الجلسرين كحاجز درجة الحرارة، في حمام مائي. عندما يصل المخزن المؤقت HIER إلى 70 درجة مئوية، ضع الحامل مع الشرائح في جرة المخزن المؤقت.</li>
	<li>حضانة الشرائح لمدة 120 دقيقة عند 70 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة جرة من حمام الماء والسماح لها باردإلى RT. شطف أقسام 3X مع الماء منزوع الأيونات ومرة واحدة مع TBS (درجة الحموضة 7.4).</li>
	<li>قم بإزالة السائل بعناية من الشرائح بين المقاطع مع ورق فلتر ملفوف أو مسحة قطنية، مما يترك المقاطع رطبة.</li>
	<li>إنشاء حاجز حول أقسام مع قلم حاجز الكاره للماء.</li>
	<li>أقسام الحضانة في حظر العازلة (1٪ الزلال المصل البقري [BSA]، 2٪ مصل الحمار العادي، 5٪ الجيلاتين الأسماك المياه الباردة والمنظفات [جدول المواد]في TBS) في RT لمدة 30 دقيقة لمنع الربط غير محددة.</li>
	<li>تخفيف الأجسام المضادة الأولية بتركيز 1 ميكروغرام/مل في المخزن المؤقت للحجب. ملاحظة: بالنسبة للأجسام NETs البشرية والماوس، يمكن استخدام مزيج من الأجسام المضادة للأرنب ضد الاستازه العدلات والأجسام المضادة للدجاج ضد الهيستون 2B(جدول المواد).</li>
	<li>ضع الشرائح في غرفة رطبة. إزالة حظر العازلة وإضافة الأجسام المضادة الأولية المخففة دون غسل إلى المقاطع باستخدام حجم كاف لمنع التجفيف. ختم غرفة رطبة مع فيلم البارافين وحضانة بين عشية وضحاها في RT.</li>
	<li>اغسل المقاطع 3x مع TBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.</li>
	<li>إعداد حل العمل من الأجسام المضادة الثانوية في حظر المخزن المؤقت. للكشف عن الأجسام المضادة الأولية ، استخدم الأجسام المضادة الثانوية التي أثيرت في الحمير وممتصة مسبقا ضد بروتينات المصل من أنواع متعددة (جدول المواد). تغطية أقسام الأنسجة مع حل العمل من الأجسام المضادة الثانوية. نقل الشرائح إلى غرفة رطبة، وختم مع فيلم البارافين. حضانة لمدة ساعة واحدة في RT. ملاحظة: حمار المضادة الأرنب المترافقة مع Cy2 وحمار المضادة للدجاج المترافقة مع Cy3 يمكن الجمع بين مع مضاد الحمض النووي.</li>
	<li>اغسل المقاطع 3x لمدة 5 دقائق لكل منها مع TBS، ثم مرة واحدة لمدة 5 دقائق مع الماء منزوع الأيونات.</li>
	<li>تغطية أقسام مع تصاعد المتوسطة(جدول المواد)وتطبيق غطاء الزجاج تجنب تشكيل فقاعة.</li>
	<li>اسمحوا تصاعد تعزيز المتوسطة، ثم تحليل الفلورة المناعية باستخدام المجهر واسعة المجال مع مرشحات تمرير الفرقة المناسبة أو المجهر البؤري.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Cattoretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+unmasking+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue+sections.">Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.</a> Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).</li><li>Yamashita, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+heat-induced+antigen+retrieval:+analyses+in+vitro+employing+SDS-PAGE+and+immunohistochemistry.">Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).</li><li>Weckbach, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+drives+cardiac+inflammation+by+promoting+neutrophil+trafficking+and+NETosis+in+myocarditis.">Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).</li></ol>

ومصدر تمويل هذا العمل هو جمعية ماكس بلانك. نشكر أرتورو زيكلينسكي على قراءة المخطوطة بشكل نقدي وفيليب سايكالي على أنسجة الفأر.

مع تزايد الوعي بدور NETs خلال مسببات الأمراض9، الكشف عنها في الأنسجة من المرضى أو الحيوانات التجريبية تكتسب أهمية متزايدة. عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين لديها عدد من المزايا بالمقارنة مع غيرها من المستحضرات الأنسجة (على سبيل المثال، أقسام من العينات المحفوظة بالتبريد). ومن الواضح أن الحفاظ على الأنسجة في العينات المضمنة بالبارافين متفوق، وبمجرد أن يتم دمجها، يتم الحفاظ على العينات لعقود، مما يتيح إجراء دراسات رجعية. للكشف عن الـ NETs، التي هي هياكل التخريم، حفظ عينة جيدة هو شرط مسبق يستبعد استخدام المواد المحمية بالتبريد، والتي هي عرضة لتلف الأنسجة بسبب تشكيل الكريستال الجليد التي يمكن أن تؤدي إلى القطع الأثرية تشبه شكليا شبكات.
للحفظ الأمثل، يجب إصلاح الأنسجة من الحيوانات التجريبية بعد وقت قصير من الموت، من الناحية المثالية عن طريق التسريب، لتجنب الانلل التلقائي. كما المثبتة، أعدت حديثا أو الحلول الطازجة من البارافورمالهايد في عازلة مناسبة مثل TBS أو خام PBS الأمثل. يتم تعريف هذا كيميائيا على النقيض من الاستعدادات formalin المستخدمة في الأنسجة القياسية، ويحفز أقل الأنسجة autofluorescence. على النقيض من ذلك، لا يتم إصلاح الأنسجة البشرية في كثير من الأحيان مباشرة بعد الختان، وكما المثبتة، وعادة ما يتم استخدام تخفيف 10٪ من formalin الذي يحتوي على 10٪ إلى 15٪ من الميثانول كمثبت لمنع البلمرة، فضلا عن حمض الفورميك، والألدهيدات الأخرى، والكيتونات . في كثير من الأحيان، يتم تخزين الأنسجة في هذا المثبت لفترات طويلة من الوقت قبل التضمين. يمكن أن تكون النتيجة الانلل التلقائي (اعتمادا على الوقت بين الختان والتثبيت)، وتشكيل مفرط من جسور الميثيلين بسبب الإفراط. تثبيت الفورمالديهايد يحفز تغييرات في الهيكل الثالثي للبروتينات عن طريق تشكيل جسور الميثيلين داخل وبين الجزيئية10. مكونات الخلايا غير البروتينية مثل الأحماض النووية والكربوهيدرات والدهون ليست ثابتة مباشرة، ولكن هائجة في شبكة البروتين ثلاثي ة الأبعاد. وللحصول على وضع العلامات الناجحة، يتعين كسر روابط الميثيلين لفضح الأوطاب في عملية استرجاع المستضد. ويتم ذلك عن طريق تسخين أقسام الأنسجة المثبتة على الشرائح المجهر في مناسبة الحرارة الناجمة عن مستضد المستضد العازلة (HIER العازلة)11. قامت دراستنا السابقة بتحليل تأثير درجة الحموضة ودرجة حرارة المخازن المؤقتة HIER على الكشف عن مكونات NET في الأنسجة المفبرة، ووجد أن المعالجة المسبقة الناجحة للأنسجة لمكون واحد غالبا ً ما تكون دون المستوى الأمثل للمكون الثاني8.
في هذه الأثناء، تم العثور على أن تسخين الأنسجة إلى 70 درجة مئوية في المخزن المؤقت HIER في درجة الحموضة من 9 هو حل وسط جيد لكثير من مكونات NET وسوف تحتفظ الحفاظ على الأنسجة جيدة، والتي غالبا ما تتعرض للخطر في درجات حرارة أعلى. ويُقترح استخدام وقت الاسترجاع المشار إليه كنقطة انطلاق، ولكن لا سيما مع عينات المحفوظات من بارامترات التثبيت غير المعروفة، يمكن أن تكون شدة التلطيخ غير مرضية. في هذه الحالة، يمكن إطالة أو ارتفاع درجة الحرارة أثناء إجراء الاسترجاع تحسين كفاءة تلطيخ. وهذا يمكن أن تؤثر أيضا على تلطيخ الهيستون 2B من الأجسام المضادة IgY المستخدمة في بروتوكولنا. كما هو مبين في الشكل 1، يمكن العثور على الكروماتين منزوع المكثف في العدلات التي تمر NETosis وكذلك في البقع NETs أقوى بكثير مع هذا الجسم المضاد مقارنة مع الكروماتين في العدلات يستريح. هذا ربما يرجع إلى تقييد الوصول إلى جزيء IgY 180 كيلودا إلى نوى مدمجة، وقد تختلف بعد زيادة الانتعاش الظهاري. وهذا قد يكثف كفاءة ملزمة حتى في مجالات الكروماتين المكثف، والتي سوف تؤدي إلى الفلورة أقوى في النوى العادية من العدلات وغيرها من الخلايا. الفرق في تلطيخ الكفاءة بين العدلات التي تمر NETosis والعدلات غير محفزيمكن أن تكون أقل وضوحا مما هو موضح في الشكل 1. ولا يزال من المقرر تحديد مناطق تكوين الشبكة من خلال التوطين المشترك لـ NE وH2B وDNA.
يمكن إجراء التثبيت أيضا أن يؤدي إلى الفلورة الذاتية كبيرة من الأنسجة، أساسا في الجزء المزرق / الأخضر من الطيف. من المهم تجنب معظم هذه الفلورة باستخدام مجموعات كافية من فلتر الفلورة الضيقة (المجال الواسع) أو إعدادات الكشف (البؤرة) التي تتطابق مع الحد الأقصى للانبعاثات من الفلوروكروم المستخدم مع الإثارة الزرقاء، على سبيل المثال، Cy2، Alexafluor 488- وفي الحالات القصوى من الفلورة الذاتية، ينبغي تجنب الجزء المزرق/الأخضر من الطيف. بدلاً من ذلك، يمكن الكشف عن إشارات الفلورة أسهل في الجزء الأحمر البعيد من الطيف (على سبيل المثال، الأجسام المضادة الثانوية المقترنة Cy 5 أو Alexafluor 635)، ولكن هذا يتطلب كاميرات سوداء/بيضاء غير مرشحة أو مجاهر بؤرية. وبما أن العين البشرية غير حساسة إلى حد ما تتجاوز 600 نانومتر، لا يمكن اكتشاف إشارات الفلورة الحمراء البعيدة باستخدام العين. وعلى أية حال، من المهم استخدام عناصر التحكم السلبية (مثل ضوابط سيرا/إيسوتيبي غير المناعية بدلاً من الأجسام المضادة الأولية أو حذف الأجسام المضادة الأولية) لتحديد أوقات التعرض المناسبة أو إعدادات الكاشف.
يمكن تحليل مقاطع الأنسجة من 1-2 ميكرومتر باستخدام مجاهر واسعة باستخدام أهداف 10x أو 20x. توفر هذه العدسات عمق بؤري كبير، لذلك (تقريبا) قسم الأنسجة بأكمله سيكون في التركيز. ويمكن استخدام هذا لمسح أقسام الأنسجة بسرعة لمناطق تكوين NET إذا كانت كبيرة بما فيه الكفاية (كما هو الحال في الشكل 1). التعريب المشترك للقنوات الخضراء (NE) والأحمر (H2B) والأزرق (DNA) يؤدي إلى تلطيخ أبيض يشير إلى مناطق تشكيل NET(الشكل 1G). بالنسبة للتكبيرات الأعلى، من الضروري وجود مجاهر مجهر ذات بؤرية أو واسعة مع deconvolution. ويبين الشكل 2 تفاصيل عينة التهاب الزائدة الدودية البشرية المستخدمة أيضاً في الشكل 1. في الشكل 2A، NE توطين إلى نقاط صغيرة (حبيبات) ، ولكن نسبة كبيرة خارج الخلية ، وغالبا ما تشكل المشارب التي تتداخل مع H2B(الشكل 2B) والحمض النووي(الشكل 2C). ينتج عن هذا التعريب المشترك تراكب أبيض يشير إلى NETs(الشكل 2D). ويمكن العثور على نمط مماثل جدا في قسم الرئة من فأر مصاب بالسل M. (الشكل 3).
وتتميز العينات المعروضة هنا بمناطق ذات درجة عالية من تكوين NET التي يمكن تحديدها حتى عند التكبير المنخفض. اعتمادا على كثافة الأنسجة والتحفيز ذات الصلة، تشكيل NET يمكن أن يكون أقل وضوحا بكثير، وصولا إلى تشكيل صافي من مجموعات صغيرة من العدلات (على سبيل المثال في التهاب عضلة القلب، انظر منشور سابق12). ويُعتقد أن هذا البروتوكول سيساعد على تعزيز المزيد من البحوث بشأن الـ NETs في الأنسجة، ونأمل أن يساعد في كشف الأدوار غير المعترف بها للأمراض غير المعترف بها في تكوين الأمراض أو الوقاية منها.

الفخاخ خارج الخلية العدلات (NETs) لديها بنية معقدة ثلاثية الأبعاد. كشف التحليل المجهري للمسح الإلكتروني عالي الدقة أنها تتألف من ألياف ناعمة يبلغ قطرها 15-20 نانومتر (كروماتين) مرصعة بمجالات كروية من > 25 نانومتر والتي يفترض أنها تتكون من مجموعة متنوعة من حوالي 30 الحبيبية والسيتوبلازمية البروتينات والببتيدات1،2. عندما يتم إنشاؤها في المختبر من العدلات المعزولة، يمكن تحديد NETs عن طريق تلطيخ اثنين أو أكثر من مكوناتها عن طريق الفلورة المناعية (على سبيل المثال، الهيستونات والعدلات elastase [NE]). في الكريات البيض متعددة الأشكال غير المحفزة (PMN)، تقع النغمات حصرا في النواة، في حين يتم احتواء NE في حبيبات. خلال NETosis، NE يدخل النواة، حيث يعالج النغمات3،4. تتميز الـ NETs بالتوطين المشترك للمكونات، والتي يتم فصلها بوضوح في العدلات غير المحفزة. وبما أنه لا توجد حالياً أجسام مضادة تكشف حصراً عن الepitopes اتّهيّة محددة من NET (أي لا تتفاعل مع العدلات السذاجة)، فإن الكشف عن التوطين المشترك لبروتينات العدلات في الـ NETs هو السبيل الوحيد لتحديد الـ NETs.
في الأنسجة، لا يمكن الكشف عن الـ NETs بواسطة البقع النسيجية التقليدية (على سبيل المثال، عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين/يوسين [H&E]، الذي يصور الـ NETs على أنه مسحة مزرق شاحبة منتشرة). فقط عندما وفيرة للغاية، NETs يمكن تمييزها بوضوح مع H & E تلطيخ، كما هو الحال في thrombi5. وبما أن الـ NETs منتشرة في حد ذاتها، يجب الحفاظ على بنية الأنسجة على النحو الأمثل، لذلك فإن المستحضرات بالتبريد التي هي عرضة للحث على تجميد القطع الأثرية هي دون المستوى الأمثل لتحليل الـ NETs في الأنسجة. بدلا من ذلك، وقد ثبت تثبيت الفورمالديهايد وتضمين البارافين للحفاظ على بنية NET في الأنسجة جيدا2. (المناعية)الفحص النسيجي لأقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين هو الأسلوب القياسي للتحليل المرضي. كما يتم الحفاظ على الأنسجة في كتل البارافين حتى في درجة حرارة الغرفة (RT)، يمكن مقارنة عينات الأنسجة من العمل التشخيصي اليومي مع العينات التي تم إعدادها منذ سنوات، مع الأسئلة والتقنيات التي نشأت مؤخرا. لم يتم الكشف عن الـ NETs في الأنسجة حتى وقت قريب، وقد يؤدي التحليل المفصل لتكوين NET وإزالتها أثناء سير الأمراض إلى رؤى جديدة في مسببات الأمراض. استخدام الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين له ميزة لا تقدر بثمن للسماح بتحليل المواد الأرشيفية وإجراء دراسات بأثر رجعي6. ومما لا شك فيه أن هذه الفوائد تأتي بتكلفة. قبل التضمين في البارافين، يجب أن تكون الأنسجة الفورمالديهايد ثابتة، وجافة وساخنة فوق 50 درجة مئوية. هذه الإجراءات تحفز الفلورة الذاتية الأنسجة، فضلا عن إخفاء الظهارة.
للحد من القطع الأثرية التثبيت، يجب أن تبقى فترة التثبيت إلى الحد الأدنى، لذلك يجب أن لا يتجاوز حجم عينات الأنسجة مساحة 20 مم × 30 ملم مع سمك ~ 3 ملم. يتم إصلاح عينات من هذا الحجم تماما بعد حضانة بين عشية وضحاها في RT في الفورمالديهايد، تليها بشكل مثالي الجفاف المباشر وتضمين البارافين. بدلاً من ذلك، يمكن تخزين عينات ثابتة لمدة 1 أو 2 أيام في المخزن المؤقت. بالنسبة لدراسات الفلورة المناعية، ينبغي إعداد المثبت طازجًا من البارافورمالهايد المذاب في مخزن مؤقت مناسب (على سبيل المثال، المالحة المخزنة بالفوسفات [PBS] أو المالحة المترسبة [TBS]). أثناء التحضير المثبت، يجب أن تبقى درجة الحرارة أقل من 60 درجة مئوية لمنع تشكيل حمض الفورميك. الفورماين، وهو المثبت القياسية لعلم الأمراض، لا ينبغي أن تستخدم لأنه يحتوي على الميثانول، والألدهيدات الأخرى، الكيتونات، وحمض الفورميك. هذه الشوائب تؤدي إلى زيادة النعت اخفاء والأنسجة الذاتية كبيرة.
لعلامات المناعة الناجحة، يجب أن يعود إخفاء الظهارة في عملية تسمى استرداد مستضد. يتم تسخين أقسام الأنسجة في عازلة مناسبة، والتي يعتقد أن كسر جسور الميثيلين، حتى تصبح epitopes في متناول الأجسام المضادة7. للكشف عن الـ NETs، يفضل استرجاع الظهارة الناجم عن الحرارة (HIER) على طرق أخرى مثل استخدام الإنزيمات البروتيوليتيكية. بشكل روتيني، يتم وضع العلامات المناعية لأقسام البارافين مع جسم مضاد واحد متبوعاً بجسم مضاد ثانوي يحمل علامة بيروكسيداز، والذي يتم اكتشافه بالركيزة المعجّلة. بالمقارنة مع الفلورة المناعية، وأساليب الكشف المستندة إلى الإنزيم لديها أقل الدقة المكانية بسبب انتشار الركيزة يعجل، وعموما، الكشف في وقت واحد من أكثر من مستضد واحد محدود6.
كما لا توجد حاليا الأجسام المضادة التي ترتبط حصرا إلى NETs، ويستخدم هذا البروتوكول لتسمية اثنين من البروتينات، الهيستون 2B، وهو نووي، وelastase العدلات، والتي يتم توطينها في حبيبات. في العدلات غير المحفزة، يتم فصل هذه البروتينات، ولكن يتم توطينها في العدلات التي تمر بـ NETosis وفي NETs. ويمكن الكشف المتزامن عن مستضدين بهيئتين مضادتين رئيسيتين رُفعا في مضيفين مختلفين وأجسامان مضادتان ثانويتان خاصتان بالأنواع يحملان علامات مختلفة من الفلوروكروم. هذا التقرير هو توحيد للبروتوكول8 الذي نُشر سابقاً ويستخدم مزيجاً من أجساممضادة متاحة تجارياً تلطيخ مكونات NET بشكل موثوق به في الأنسجة المضمنة بالبارافين، الطازجة منها والأرشيفية على حد سواء، من أصل بشري ومورين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chicken anti Histone 2B antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab 134211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cold water fish gelatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>703-165-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-225-152</td>
			<td>alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding cassettes</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K116.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding molds</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding station</td>
			<td>Microm</td>
			<td>AP280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper, rolled</td>
			<td>OCB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>7a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cylinder with 20 cm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIER buffer pH 9</td>
			<td>Scytek</td>
			<td>TES999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (dry, up to 40 &#176;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>MMIPP30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>moist chamber (plastic box with tight lid)</td>
			<td>Emsa</td>
			<td>508542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>32.459-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal donkey serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP-pen ImmEdge</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>355S</td>
			<td>water bath included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Schubert /Weiss</td>
			<td>7020051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti ELANE antibody</td>
			<td>Atlas</td>
			<td>HPA068836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>racks, jars for microscope slides</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H554.1 H552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Fig.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus glass slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature-controlled hot plate</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>D6010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue processor for paraffin embedding</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline TBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath 37 &#176;C</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>widefield or confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMR, SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene (dimethylbenzene)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9713.3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue

المحببات العدلات، وتسمى أيضا الكريات البيض متعددة الأشكال النووية (PMN) بسبب نواة الفصية، هي النوع الأكثر وفرة من الكريات البيض. وهي تنضج في نخاع العظم وتُطلق في الدم المحيطي، حيث تدور لمدة تنحو 6-8 ح. ومع ذلك، في الأنسجة، فإنها يمكن أن البقاء على قيد الحياة لعدة أيام. عن طريق الانحلال من خلال البطانة ، فإنها تترك مجرى الدم ، وتدخل الأنسجة ، وتهاجر نحو موقع العدوى بعد التدرجات الكيميائية. يمكن للالعدلات مكافحة الكائنات الحية الدقيقة الغازية عن طريق الفيروسيتو، وإزالة التحبيب، وتوليد الفخاخ خارج الخلايا العدلات (NETs). سيساعد هذا البروتوكول على الكشف عن الـ NETs في الأنسجة المضمنة بالبارافين. الـ NETs هي نتيجة لعملية تسمى NETosis، مما يؤدي إلى إطلاق المكونات النووية، الحبيبية، والسيتوبلازمية إما من العيش (NETosis الحيوية) أو الموت (NETosis الانتحارية) العدلات. في المختبر، تشكل الـ NETs هياكل تشبه السحابة، والتي تشغل مساحة أكبر عدة مرات من مساحة الخلايا التي نزلوا منها. العمود الفقري للNETs هو الكروماتين، والتي ترتبط بها مجموعة مختارة من البروتينات والببتيدات الناشئة من حبيبات والسيتوبلازم. وبالتالي، يتم الحفاظ على تركيز محلي عال من المركبات السامة بحيث يمكن للتكنولوجيات الجديدة التقاط وتعطيل مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات والطفيليات، في حين أن انتشار مكونات NET عالية النشاط مما يؤدي إلى الضرر في الأنسجة المجاورة محدودة. ومع ذلك، فقد أصبح من الواضح في السنوات الأخيرة أن الـ NETs، إذا تم توليدها بوفرة أو تطهيرها بشكل غير كاف، لديها إمكانات مرضية تتراوح بين أمراض المناعة الذاتية والسرطان. وهكذا، فإن الكشف عن الـ NETs في عينات الأنسجة قد يكون له أهمية تشخيصية، ويمكن أن يؤثر الكشف عن الـ NETs في الأنسجة المريضة على علاج المرضى. وبما أن عينات الأنسجة المضمنة بالبارافين هي العينة القياسية المستخدمة في التحليل المرضي، فقد طُلب إنشاء بروتوكول لتلطيخ الفلورسنت لمكونات الشبكة في الأنسجة المضمنة بالبارافين باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجارياً.

باستخدام هذا البروتوكول، يمكن الكشف عن مكونات NET بنجاح في الأنسجة المضمنة البارافين على حد سواء من أصل الإنسان وmurine. في العدلات غير المحفزة، يقع H2B حصرا في النواة وelastase العدلات في حبيبات. وبالتالي، فإن إشارات الفلورة الخاصة بهم لا تتداخل. على النقيض من ذلك، خلال NETosis وبعد تشكيل NET، NE، H2B، والحمض النووي جزئيا colocalize. إذا تم تصويرها على أنها إشارات خضراء وحمراء وزرقاء، يتم تصوير مناطق التعريب على أنها تراكب أبيض(الشكل 1G، الشكل 2D، والشكل 3D). يمكن أيضًا تحديد هذا التراكب كمياً باستخدام برنامج تحليل الصور. تم استخدام وحدات البكسل من الإشارات المتداخلة الإيجابية للأخضر والأحمر والأزرق لإنشاء تراكب أرجواني يصور مناطق NET في الشكل 1Gوالشكل 2Dوالشكل 3D. بعض الخلايا في الشكل 1 والشكل 2 قد تم الناوية lobulated ولكن سلبية لNE. ويعتقد أن هذه الخلايا هي المحببات الحمضات.
إذا كانت أقسام الأنسجة لديها سمك 2-3 ميكرومتر، يمكن تحليلها عن طريق الفحص المجهري على نطاق واسع باستخدام أهداف 10x أو 20x. ومن الأمثلة على ذلك الشكل 1، الذي يصور قسما من أنسجة التهاب الزائدة الدودية البشرية ملطخة NE (الأخضر)، H2B (الأحمر) وهويشت 33342 (الأزرق). الأفرقة A و C وE و G هي من منطقة من القسم تحتوي على الـ NETs، في حين أن اللوحات B و D وF وH هي من منطقة مختلفة من نفس القسم، الذي يحتوي على العديد من العدلات(الشكل 1B،NE) ولكن لا NETs. يمكن العثور على المناطق ذات التشكيل الضخمة NET بسهولة حتى في التكبير منخفضة، منذ جميع مكونات NET الثلاثة colocalize، في كثير من الأحيان في هياكل خارج الخلية الوترية، والتي تظهر في تراكب القنوات الثلاث كألياف خارج الخلية بيضاء(الشكل 1G )، تراكب الأرجواني في الشكل 1G'.
أنماط تلطيخ كل من مناطق الأنسجة مختلفة بوضوح، مع NE الواردة في حبيبات(الشكل 1B)والحمض النووي في النوى(الشكل 1F). ومن المثير للاهتمام، وتلطيخ لH2B ضعيفة إلى حد ما في المناطق الغنية العدلات(الشكل 1D)مقارنة مع الأنسجة التي تحتوي على صافي(الشكل 1C). وهذا يمكن أن يكون بسبب حجم الأجسام المضادة (IgY لديه 180 كيلوD مقارنة مع 150 كيلوD لIgG)، والتي قد تمنع ربط الكروماتين المدمجة في النوى سليمة، في حين يتم تسهيل الوصول إلى H2B إذا تم إزالة المكثفات الكروماتين كما هو الحال في NETs (الشكل 1C).
للحصول على دقة أعلى، يجب استخدام المجاهر البؤرية أو المجاهر العريضة مع الإنقوبة لتقليل الضبابية خارج التركيز. يصور الشكل 2 منطقة غنية بالشبكة من نفس عينة التهاب الزائدة الدودية البشرية. وهو إسقاط الحد الأقصى لمكدس البؤري. NE (الأخضر، الشكل 2A)موجود في حبيبات ولكن أيضا وفيرة خارج الخلية، حيث أنه يكمب مع H2B (الأحمر، الشكل 2B)والحمض النووي (الأزرق، الشكل 2C). يؤدي التعريب خارج الخلية إلى مزيج من الألوان البيضاء(الشكل 2D). وقد استخدمت هذه البيكسلات الإيجابية للأخضر والأحمر والأزرق لإنشاء تراكب الأرجواني تقديم NETs في الشكل 2D'.
الشكل 3 هو تفصيل لقسم مركزي من رئة فأر مصابة بالسل المتفطر (M. tb). حالة استرجاع المستضد وتلطيخها هي نفسها بالنسبة للشكل 1 والشكل 2. مرة أخرى، التعريب المشترك لجميع مكونات NET الثلاثة واضحة للعيان كمناطق بيضاء بين العدلات، والتي تم استخدامها لإنشاء طبقة أرجوانية تشير إلى NETs في الشكل 3D'.
وتتجلى خصوصية تلطيخ في الشكل التكميلي 1، الذي يصور تلطيخ لا يكاد يذكر مع الأجسام المضادة للتحكم ، والشكل التكميلي 1A ، B يصور مصل الأرنب غير المناعي (الأخضر) والدجاج المضادة لGFP IgY (الأحمر). الشكل 1 C، D يظهر تلطيخ مع الأجسام المضادة الثانوية وحدها، وكان الجمع نفسه كما كان يستخدم في الشكل1، الشكل 2، والشكل 3. ويبين الشكل التكميلي 1ألف،(ج) قسماً من التهاب الزائدة الدودية البشري مشابهاً للشكل 1 والشكل 2. الشكل التكميلي 1B، D هو أنسجة الرئة الماوس مماثلة للشكل 3. الحمض النووي ملطخ بـ Hoechst 33342. شريط مقياس يمثل 25 ميكرومتر.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig01.jpg"> الشكل 1: الفحص المجهري الفلوري الواسع النطاق لقسم البارافين من عينة التهاب الزائدة الدودية البشرية. تصور اللوحات A وC وE وG منطقة الأنسجة مع الـ NETs، في حين تظهر اللوحات B وD وF وH منطقة مختلفة من نفس القسم الغني في العدلات ولكن بدون تكوين NET. تلطيخ ضد NE(A, B; الأخضر), H2B(C, D; الأحمر), والحمض النووي(E, F; الأزرق). الشكل 1G،H يمثل تراكب جميع القنوات الثلاث. تمثل البيكسلات التي تتراوح شدتها بين 80 و256 في جميع الألوان مناطق تلطيخ متداخلة لـ NE وH2B وDNA وتعتبر مشتقة من الـ NETs أو العدلات التي تخضع لـ NETosis. وقد تم هذه بكسل الزائفة اللون الأرجواني في لوحة G '، حيث أنها تشكل مساحة كبيرة. وفي اللوحة H'، حيث يتم العثور على بقع صغيرة فقط. وقد التقطت الصور بمجهر واسع النطاق باستخدام هدف 20 x، ويمثل شريط المقياس 25 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig01large.jpg" target="_blank">ميكرومتر.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig02.jpg"> الشكل 2: الفحص المجهري للفلورة البؤرية لمكونات الشبكة في عينة من التهاب الزائدة الدودية البشرية. تم استخدام نفس قسم الأنسجة المستخدم في الشكل 1. (أ)تلطيخ ضد NE،(ب) تصوير H2B، و(ج)Hoechst 33342 تلطيخ الحمض النووي. (D)تراكب القنوات الثلاث جميعها. التعريب من جميع الإشارات الثلاث هو الزائفة اللون الأرجواني في لوحة D'. لهذا، تم الكشف عن بكسل مع كثافة >80 في جميع الألوان الثلاثة باستخدام Volocity 6.3. تُصوّر المنطقة الأرجوانية الـ NETs أو العدلات التي تخضع لـ NETosis. وقد التقطت الصور مع مجهرية البؤرية كما Z-مداخن وقدمت كإسقاط الحد الأقصى. شريط مقياس يمثل 25 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig02large.jpg" target="_blank"></a> درجة.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig03.jpg"> الشكل 3: الفحص المجهري للفلورة البؤرية لمكونات الشبكة في رئة فأر مصابة بالسل M. هو تفصيل من الجزء مركزية من قسم من رئة كاملة مع ضخمة [العدلروفل] تسلل. (أ)NE تلطيخ،(ب)H2B تلطيخ، و(C)تلطيخ الحمض النووي. (D)تراكب القنوات الثلاث جميعها. يشير التراكب الأرجواني في اللوحة D' إلى وحدات البكسل ذات قيم الكثافة >80 في جميع الألوان الثلاثة التي تشير إلى العدلات التي تخضع لـ NETosis وكذلك NETs. وقد التقطت الصور كأكوام Z مع المجهر البؤري وقدمت كإسقاط الحد الأقصى. شريط مقياس يمثل 25 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig03large.jpg" target="_blank"></a> درجة.
الشكل التكميلي 1: التحكم في تلطيخ الأجسام المضادة الأولية غير ذات الصلة. الإنسان(A, C)والأنسجة المورين(B, D)كما كان يستخدم للشكل 1 و الشكل 2، والشكل 3،على التوالي، كانت ملطخة بالأجسام المضادة الأولية لا علاقة لها(A, B)أو بدون الأجسام المضادة الأولية(C, D). كما السيطرة على الأجسام المضادة الأولية في الألواح A و B، تم تطبيق المصل من أرنب غير محصنة والدجاج IgY ضد GFP. وكانت الأجسام المضادة الثانوية هي نفسها كما هو مبين في جميع تلطيخ الأخرى وتستخدم أيضا في لوحات C و D. وكما هو متوقع، في جميع الظروف، تم الكشف عن تلطيخ خلفي لا يُذكر، مما يوضح خصوصية الأجسام المضادة المستخدمة في الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3. وقد التقطت الصور مع المجهر البؤري، الحمض النووي ملطخة Hoechst 33342، وشريط مقياس يمثل 25 م. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115supfig01large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue at JoVE.com

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

الفخاخ خارج الخلية العدلات (NETs) هي هياكل ثلاثية الأبعاد ولدت من قبل المحببات العدلات حفز. وقد أصبح من الواضح في السنوات الأخيرة أن الـ NETs تشارك في مجموعة واسعة من الأمراض. وقد يكون للكشف عن الـ NETs في الأنسجة أهمية تشخيصية، ولذلك يلزم وضع بروتوكولات موحدة لوضع العلامات على مكونات الشبكة.

وضع العلامات المناعية للفخاخ خارج الخلية البشرية ومورين العدلات في الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

اليوم نود أن تظهر لك المتغيرات من بروتوكول استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة المشتركة. فهو يجمع بين فوائد انخفاض درجة الحرارة لمستضد العدلات و القيمة العليا للدرجة العليا المطلوبة للهستونات. هذه التقنية تسمح لدراسة NETs، الفخاخ العدلات خارج الخلية، في أنسجة البارافين سواء من الماوس أو الرجال.كما أنه يعتبر لدراسة المواد المحفوظة أو الدراسة الاستعادية. أولاً، ضع الشرائح المعدة في رفوف وغمرها في الوسائط المستخدمة للجفاف والمقاصة بترتيب عكسي لمدة خمس دقائق لكل منها. بعد ذلك، سخني حمام مائي مع صفيحة ساخنة يتم التحكم فيها بدرجة حرارة إلى 70 درجة مئوية.وضع جرة مليئة الحرارة الناجمة عن عازلة استرجاع epitope و 10٪ الجلسرين في حمام الماء. عندما يصل المخزن المؤقت إلى 70 درجة مئوية، ضع الحامل مع الشرائح في جرة العازلة. احتضان الشرائح في 70 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة.بعد ذلك، إزالة جرة من حمام الماء، والسماح لها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. شطف المقاطع المبردة ثلاث مرات مع الماء المتأين ومرة واحدة مع TBS. باستخدام ورق تصفية تدحرجت أو مسحة القطن، وإزالة بعناية أي سائل بين الأقسام على الشرائح، مع التأكد من ترك المقاطع رطبة.ثم، استخدم قلم حاجز مُزَمّم لإنشاء حاجز حول كل قسم. احتضان القسم في منع العازلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لمنع الربط غير محدد. تمييع الأجسام المضادة الأساسية في سد العازلة بتركيز واحد ميكروغرام لكل ملليلتر.قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب من الشرائح، وأضف الأجسام المضادة الأولية المخففة، مع التأكد من استخدام وحدة تخزين كافية لمنع التجفيف. أغلق الحاوية الرطبة، وحضنها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، اغسل الأقسام ثلاث مرات بـ TBS مع كل غسل يدوم خمس دقائق.إعداد حل عمل من الأجسام المضادة الثانوية في العازلة حظر. تغطية أقسام الأنسجة مع حل الأجسام المضادة الثانوية، ونقل الشرائح إلى وعاء رطبة. ختم الحاوية الرطبة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.بعد ذلك، قم بغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام TBS وممر واحد في الماء مع كل غسل يدوم خمس دقائق. تغطية المقاطع غسلها مع المتوسطة المتصاعدة، وتطبيق الزجاج غطاء مع تجنب تشكيل فقاعة. بعد أن تتوطد الوسيلة المتصاعدة ، استخدم مجهرًا confocal أو مجهرًا واسع النطاق مع مرشحات تمرير النطاق المناسبة لتحليل الفلوروسة المناعية.لرقمنة المقاطع كاملة باستخدام ماسح الشرائح، تعيين كثافة الفلوريسينس باستخدام عناصر التحكم السلبية والإيجابية. باستخدام تلطيخ العدلات elastase، والعثور على المناطق الغنية العدلات والتكبير في تلك المناطق للتحقق مما إذا كانت إشارة العدلات elastase هي الحبيبية أو خارج الخلية. إذا كانت الإشارة خارج الخلية وتداخلت مع كل من تلطيخ الحجر والحمض النووي، تم الحصول على الفخاخ العدلية خارج الخلية.في هذه الدراسة، يتم الكشف عن مكونات NET بنجاح في الأنسجة المضمنة البارافين، سواء من أصل الإنسان والمورين. إذا كان سمك أقسام الأنسجة يتراوح بين اثنين إلى ثلاثة ميكرومتر، يمكن تحليلها عن طريق المجهر واسع المجال باستخدام أهداف 10x أو 20x. لتقييم تلطيخ بشكل صحيح، تمت معالجة كل من العينات السلبية والإيجابية.يظهر قسم تمثيلي من أنسجة التهاب الزائدة الدودية البشري الأنسجة الملطخة لNE، H2B، وهويشت 33342. الصور على اليسار هي من منطقة من القسم تحتوي على NETs، في حين أن الصور على اليمين هي من منطقة مختلفة من نفس القسم الذي يحتوي على العديد من العدلات ولكن لا NETs. المناطق مع تشكيل صافي ضخمة يمكن بسهولة يمكن العثور عليها حتى في التكبير منخفضة منذ جميع مكونات NET الثلاثة في كثير من الأحيان في هياكل خارج الخلية.يظهر هذا في تراكب القنوات الثلاث كألياف بيضاء خارج الخلية يمكن قياسها كمياً باستخدام برنامج تحليل الصور لإنشاء تراكب أرجواني باستخدام وحدات بكسل من إشارات متداخلة تكون إيجابية للخضرة والأحمر والأزرق. للحصول على دقة أعلى ، يجب استخدام المجاهر confocal أو المجاهر واسعة المجال مع deconvolution لتقليل الضبابية خارج التركيز. إسقاط الحد الأقصى من كومة confocal من منطقة غنية صافي من نفس العينة التهاب الزائدة الدودية الإنسان يظهر أن NE وجدت في حبيبات ولكن أيضا وفيرة خارج الخلية حيث أنه يتقن مع H2B ومع الحمض النووي.ينتج عن التكلس خارج الخلية مزيج من الألوان الأبيض. يمكن مرة أخرى أن تستخدم بكسل إيجابية للخضراء والأحمر والأزرق لإنشاء تراكب أرجواني تقديم NETs. وهناك تفاصيل تمثيلية لقسم مركزي من رئة فأرة مصابة بالسل الميكوبتريا يقدم مثالا آخر على التكلس الكولوكافي لجميع مكونات الشبكة الثلاثة التي تكون مرئية بوضوح كمساحات بيضاء بين العدلات التي يمكن استخدامها لإنشاء طبقة أرجوانية تشير إلى NETs.أثناء إجراء التلطيخ، يجب أن لا تقع المقاطع الجافة لأن هذا سوف يسبب تلطيخ كاذبة إيجابية أو خلفية عالية. وقد يساعد تحليل المواد المحفوظة في فهم أثر تكنولوجيات المعلومات والاتصالات في الأمراض. لأن أنسجة البارافين يمكن أن يكون لها خلفية ضخمة، من المهم أن يكون لها سيطرة إيجابية وسلبية التي يمكنك التمييز بين تلطيخ الخاص بك والخلفية.وينبغي إجراء الديواكسينغ والجفاف تحت غطاء أبخرة. تأكد من ارتداء القفازات ومعطف المختبر الخاص بك.

Research

JoVE Journal

Medicine

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

تلوين المناعى من H1-B7 (PD-L1) على البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج الشرائح غدية البنكرياس

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

متعدد القطب تسجيلات صفيف من داء الصرع بعد الجراحة القشرية الأنسجة البشرية

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

إنشاء الإنسان الظهارية Enteroids وColonoids من الأنسجة كامل وخزعة

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

استخدام الفئران محرض التيلوميراز الأليلات في الدراسات التي أجريت على الأنسجة تنكس / التجديد والسرطان

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

التصوير بالموجات فوق الصوتية ثلاثية الأبعاد: مورفوميتري سريعة وفعالة من حيث التكلفة لانسجة العضلات والعظام

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

تحديد خصائص الخلايا المناعية في الأنسجة الدهنية البشرية باستخدام التدفق الخلوي

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Assessing Blood Hypercoagulation of EV-Rich Plasma

Determination of the Procoagulant Activity of Extracellular Vesicle (EV) Using EV-Activated Clotting Time (EV-ACT)

Deciphering Coagulation Disorders in Traumatic Brain Injury Patients (Video) | JoVE

تحديد نشاط تجلط الدم للحويصلة خارج الخلية (EV) باستخدام وقت التخثر المنشط ب EV (EV-ACT)

The role of extracellular vesicles (EV) in various diseases is gaining increased attention, particularly due to their potent procoagulant activity. ...

Revealing Murine Pulmonary Veins Myocardial Architecture

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

Developing a Translational Model for Atrial Fibrillation Research Across Species (Video) | JoVE

التشريح المجهري وتلطيخ التألق المناعي لأكمام عضلة القلب في الأوردة الرئوية للفئران

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial ...

Improved Sensitivity for Tissue Factor Activity Assay in Extracellular Vesicles

Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity Assay

High-Sensitivity Tissue Factor Activity Assay for Plasma Diagnosis (Video) | JoVE

فحص نشاط عامل نسيج الحويصلة خارج الخلية

Tissue factor (TF) is a transmembrane receptor for factor (F) VII and FVIIa. The TF/FVIIa complex initiates the coagulation cascade by activating both FIX ...

Evaluating Murine BBB Disruption Induced by Hypoxic Human Placenta-Derived sEVs

Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas

Author Spotlight: Modeling an Aspect of Preeclampsia in Female Mice Using Hypoxic Human Placenta-Derived Small Extracellular Vesicles

اضطراب الحاجز الدموي الدماغي للفأر بواسطة حويصلات صغيرة خارج الخلية من المشيمة البشرية التي تعاني من نقص الأكسجين

Cerebrovascular complications, including cerebral edema and ischemic and hemorrhagic stroke, constitute the leading cause of maternal mortality associated ...