Name: immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue
Uploaded: 2019-09-10T14:00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue at JoVE.com

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les protocoles tissulaires ont été approuvés par Landesamt f'r Gesundheit und Soziales, Berlin, Allemagne (G0121/16). Des expériences ont été menées conformément à la directive européenne 2010/63/EU sur les soins, le bien-être et le traitement des animaux.
1. Fixation, déshydratation, encastrie de paraffine, sectionnement, montage de sections
<ol><li>Préparer une solution de formaldéhyde de 2 % en dissolvant le paraformaldéhyde dans le SCT (pH 7,4). Évitez de chauffer au-dessus de 60 oC. Cool à RT. La solution de formaldéhyde peut être stockée à -20 oC.</li>
	<li>Placer les tissus frais (ici : poumon de souris) dans un plat Petri en verre avec tbS. À l'eau avec un scalpel, disséquer en morceaux ne dépassant pas 20 mm x 30 mm x 3 mm. Immerger le spécimen dans une solution de formaldéhyde de 2 % dans le SCT. REMARQUE: Le volume de fixatif doit être au moins 20x que du tissu.</li>
	<li>Fixer à RT pendant 8 à 20 h. Transférer les échantillons au SCT. Placez-les dans des cassettes.</li>
	<li>Déshydrater à l'aide d'une série d'éthanol (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), chaque étape d'une durée de 1 h.</li>
	<li>Effacer les spécimens 2x en xylène 100% (diméthylbenzène), chaque étape 1 h.</li>
	<li>Faire tremper dans la paraffine 2x à 60 oC (température de fusion de 54 à 56 oC), chaque étape 1 h.</li>
	<li>Montez les spécimens à l'aide de moules en castré, utilisez le fond de la cassette comme couvercle.</li>
	<li>Laisser la paraffine solidifier et enlever les moules en castrlage.</li>
	<li>Préparer des sections de 3 m de tissu et les laisser flotter sur un bain d'eau de 37 oC.</li>
	<li>Sections de flotteur sur la surface de l'eau sur des lames de verre adhésif (Tableau des matériaux).</li>
	<li>Incuber des sections sur des lames de verre pendant la nuit à 40 oC pour lier le tissu au verre.</li>
</ol>2. Réhydratation, récupération d'épitope induite par la chaleur, coloration, montage, analyse microscopique
<ol><li>Placez les sections sur des lames de verre dans des supports et les sous-traitez dans les supports utilisés pour la déshydratation et le défrichage, dans l'ordre inverse, à chaque étape de 5 min : 2x 100% xylène, série d'éthanol (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).</li>
	<li>Chauffer un bain d'eau avec une plaque chauffante à température contrôlée jusqu'à 70 oC. Placer un bocal rempli de récupération d'épitope induite par la chaleur (HIER) tampon (pH 9; Table des Matériaux), contenant 10% de glycérol comme tampon de température, dans un bain d'eau. Lorsque le tampon HIER a atteint 70 oC, placez la grille avec des glissières dans un bocal tampon.</li>
	<li>Incuber des toboggans de 120 min à 70 oC.</li>
	<li>Retirer le pot du bain d'eau et laisser refroidir à RT. Rincer les sections 3x avec de l'eau déionisée et une fois avec tbS (pH 7,4).</li>
	<li>Retirez soigneusement le liquide des glissières entre les sections avec du papier filtre roulé ou un coton-tige, en laissant les sections hydratées.</li>
	<li>Créez une barrière autour des sections avec un enclos à barrière hydrophobe.</li>
	<li>Incuber des sections dans un tampon de blocage (1 % d'albumine de sérum bovin [BSA], 2 % de sérum d'âne normal, 5 % de gélatine de poisson d'eau froide et de détergents [Tableau des matériaux] dans le SCT) à RT pendant 30 min pour empêcher une liaison non spécifique.</li>
	<li>Diluer les anticorps primaires à une concentration de 1 g/mL dans le tampon de blocage. REMARQUE: Pour les NET humains et souris, une combinaison d'anticorps de lapin contre l'élastase neutrophile et anticorps de poulet contre Histone 2B peut être utilisé (Tableau des matériaux).</li>
	<li>Placer les toboggans dans une chambre humide. Retirez le tampon de blocage et ajoutez les anticorps primaires dilués sans les laver aux sections en utilisant un volume suffisant pour empêcher le séchage. Scellez la chambre humide avec le film de paraffine et incuber pendant la nuit à RT.</li>
	<li>Laver les sections 3x avec le SCT pendant 5 min chacune.</li>
	<li>Préparer la solution de travail des anticorps secondaires dans le tampon de blocage. Pour la détection des anticorps primaires, utiliser des anticorps secondaires élevés dans l'âne et pré-absorbés contre les protéines sériques de plusieurs espèces (Tableau des matériaux). Couvrez les sections de tissu avec la solution de travail des anticorps secondaires. Transférer les diapositives dans une chambre humide, sceller avec du film de paraffine. Incuber pour 1 h à RT. REMARQUE: âne anti lapin conjugué à Cy2 et âne anti poulet conjugué à Cy3 peut être combiné avec un contre-tache d'ADN.</li>
	<li>Laver les sections 3x pendant 5 min chacune avec le SCT, puis une fois pour 5 min avec de l'eau déionisée.</li>
	<li>Couvrir les sections avec le support de montage (Tableau des matériaux) et appliquer le verre de couverture en évitant la formation de bulles.</li>
	<li>Laissez le montage moyen se solidifier, puis analysez l'immunofluorescence à l'aide d'un microscope à large champ avec des filtres de passe de bande appropriés ou un microscope confocal.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Cattoretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+unmasking+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue+sections.">Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.</a> Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).</li><li>Yamashita, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+heat-induced+antigen+retrieval:+analyses+in+vitro+employing+SDS-PAGE+and+immunohistochemistry.">Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).</li><li>Weckbach, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+drives+cardiac+inflammation+by+promoting+neutrophil+trafficking+and+NETosis+in+myocarditis.">Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).</li></ol>

La source de financement de ces travaux est la Société Max Planck. Nous remercions Arturo Zychlinsky d'avoir lu de façon critique le manuscrit et Philippe Saikali pour le tissu de souris.

Avec la prise de conscience croissante du rôle des NET pendant la pathogénie9,leur détection dans les tissus des patients ou des animaux expérimentaux gagne en importance. Les échantillons de tissus incorporés à la paraffine présentent un certain nombre d'avantages par rapport à d'autres préparations tissulaires (p. ex., sections de spécimens cryoconservés). La conservation des tissus dans les échantillons incorporés à la paraffine est clairement supérieure, et une fois incorporés, les échantillons sont conservés pendant des décennies, ce qui permet des études rétrogrades. Pour la détection des NET, qui sont des structures en filigrane, une bonne conservation de l'échantillon est une condition préalable excluant l'utilisation de matériaux cryoconservés, qui sont sujets à des dommages aux tissus dus à la formation de cristaux de glace qui peuvent donner lieu à des artefacts ressemblant morphologiquement à Filets.
Pour une conservation optimale, les tissus des animaux expérimentaux doivent être fixés peu de temps après la mort, idéalement par perfusion, pour éviter l'autolyse. Comme fixative, fraîchement préparé ou fraîchement décongelé solutions de paraformaldéhyde dans un tampon approprié comme tbs/SCT ou PBS minerai optimal. Ceci est chimiquement défini contrairement aux préparations formalines utilisées pour l'histologie standard, et induit moins d'autofluorescence tissulaire. En revanche, le tissu humain n'est souvent pas fixé directement après l'excision, et comme fixatif, normalement une dilution de 10% de formaline est utilisée qui contient 10% à 15% de méthanol comme stabilisateur pour empêcher la polymérisation, ainsi que l'acide formique, d'autres aldéhydes, et les cétones . Souvent, le tissu est stocké dans ce fixatif pendant de longues quantités de temps avant l'intégration. Le résultat peut être l'autolyse (selon le temps entre l'excision et la fixation), et la formation excessive de ponts de méthylène en raison de la surfixation. La fixation du formaldéhyde induit des changements dans la structure tertiaire des protéines par la formation de ponts méthylène séthylène intra- et intermoléculaires10. Les composants cellulaires non protéiniques comme les acides nucléiques, les glucides et les lipides ne sont pas fixés directement, mais immobilisés dans le réseau tridimensionnel de protéines. Pour réussir l'étiquetage, les liaisons de méthylène doivent être brisées pour exposer les épitopes dans le processus de récupération d'antigène. Ceci est accompli en chauffant des sections de tissu montées sur des glissières de microscope dans un tampon de récupération d'antigène induit par la chaleur approprié (tampon d'HIER)11. Notre étude précédente a analysé l'influence du pH et de la température des tampons HIER sur la détection des composants NET dans les tissus paraffinés, et il a été constaté que le prétraitement réussi des tissus pour un composant est souvent sous-optimal pour un deuxième composant8.
Dans l'intervalle, il a été constaté que le chauffage du tissu à 70 oC dans le tampon HIER à un pH de 9 est un bon compromis pour de nombreux composants NET et conservera une bonne conservation des tissus, qui est souvent compromise à des températures plus élevées. Il est proposé d'utiliser le temps de récupération indiqué comme point de départ, mais surtout avec des spécimens d'archives de paramètres de fixation inconnus, l'intensité de coloration peut être insatisfaisante. Dans ce cas, la prolongation ou une température plus élevée pendant la procédure de récupération peut améliorer l'efficacité de coloration. Cela peut également influencer la coloration histone 2B de l'anticorps IgY utilisé dans notre protocole. Comme le montre la figure 1, la chromatine décondensée se trouve dans les neutrophiles subissant la NETosis ainsi que dans les taches NETs beaucoup plus fortes avec cet anticorps par rapport à la chromatine dans les neutrophiles au repos. Ceci est probablement dû à l'accès restreint de la molécule IgY 180 kDa aux noyaux compacts et peut différer après une récupération accrue de l'épitope. Ceci peut intensifier l'efficacité de liaison même dans les secteurs de la chromatine condensée, qui aura comme conséquence la fluorescence plus forte dans les noyaux normaux des neutrophiles et d'autres cellules. La différence d'efficacité de coloration entre les neutrophiles subissant la NETosis et les neutrophiles non stimulés pourrait être moins prononcée que celle décrite dans la figure 1. Les zones de formation de l'EI seraient encore identifiées par la co-localisation de l'EN, du H2B et de l'ADN.
La procédure de fixation peut également induire l'autofluorescence significative du tissu, principalement dans la partie bleuâtre/verdâtre du spectre. Il est important d'éviter la majeure partie de cette autofluorescence en utilisant des ensembles de filtres à fluorescence à bande étroite adéquats (champ large) ou des paramètres de détecteur (confocal) qui correspondent au maximum d'émission du fluorochrome utilisé avec l'excitation bleue, par exemple, Cy2, Alexafluor 488. Dans les cas extrêmes d'autofluorescence, la partie bleutée/verdâtre du spectre doit être évitée. Au lieu de cela, les signaux de fluorescence peuvent être détectés plus facilement dans la partie rouge du spectre (par exemple, les anticorps secondaires couplés à Cy 5 ou Alexafluor 635), mais cela nécessite des caméras noires/blanches sans filtre ou des microscopes confocals. Puisque l'œil humain est plutôt insensible au-delà de 600 nm, les signaux de fluorescence rouge lointain peuvent difficilement être détectés à l'aide d'oculaires. Dans tous les cas, il est important d'utiliser des contrôles négatifs (p. ex., des contrôles non immunisés sur le sérum/isotype au lieu d'anticorps primaires ou de l'omission d'anticorps primaires) pour déterminer les temps d'exposition appropriés ou les paramètres du détecteur.
Les sections de tissus d'une vingtaine de m peuvent être analysées à l'aide de microscopes à large champ à l'aide d'objectifs 10x ou 20x. Ces lentilles fournissent une grande profondeur focale, de sorte (presque) toute la section des tissus seront au point. Cela peut être utilisé pour scanner rapidement les sections de tissus pour les zones de formation NET si elles sont suffisamment grandes (comme à la figure 1). La colocalisation des canaux vert (NE), rouge (H2B) et bleu (ADN) donne lieu à une coloration blanche indiquant les zones de formation de l'EI (Figure 1G). Pour des grossissements plus élevés, des microscopes confocals ou à large champ avec déconvolution sont nécessaires. La figure 2 montre les détails du spécimen d'appendicite humaine également utilisé pour la figure 1. Dans la figure 2A, ne se localise en petits points (granules), mais une grande proportion est extracellulaire, formant souvent des bandes qui chevauchent h2B (figure 2B) et l'ADN (Figure 2C). Cette colocalisation donne lieu à une pari blanchâtre indiquant les ENE (figure 2D). Un modèle très similaire peut être trouvé dans la section pulmonaire d'une souris infectée par M. tuberculosis (Figure 3).
Les spécimens présentés ici sont caractérisés par des zones avec un degré élevé de formation NET qui peuvent être identifiés même à faible grossissement. Selon la densité des tissus et le stimulus respectif, la formation net peut être beaucoup moins prononcée, jusqu'à la formation NET de petits groupes de neutrophiles (par exemple dans la myocardite, voir une publication précédente12). On croit que ce protocole aidera à favoriser plus de recherche sur les TNE dans les tissus et, espérons-le, à démêler les rôles non reconnus des EDR dans la formation ou la prévention des maladies.

Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) ont une structure tridimensionnelle complexe. L'analyse microscopique de balayage-électron à haute résolution a indiqué qu'elles se composent des fibres lisses avec un diamètre de 15-20 nm (chromatin) parsemés de domaines globulaires de 'gt;25 nm qui se composent vraisemblablement d'un assortiment d'environ 30 granulaires et cytoplasmiques protéines et peptides1,2. Lorsqu'ils sont générés in vitro à partir de neutrophiles isolés, les TNE peuvent être identifiés par la coloration de deux ou plusieurs de leurs composants par immunofluorescence (p. ex., histones et neutrophile elastase [NE]). Dans les leucocytes polymorphes non stimulés (PMN), les histones sont situées exclusivement dans le noyau, tandis que le NE est contenu dans les granules. Pendant neTosis, NE entre dans le noyau, où il traite histones3,4. Les NET sont caractérisés par la colocalisation des composants, qui sont clairement séparés dans les neutrophiles non stimulés. Étant donné qu'il n'existe actuellement aucun anticorps qui détectent exclusivement les épitopes spécifiques à l'ENI (c.-à-d. ne réagissent pas avec les neutrophiles naïfs), la détection de la colocalisation des protéines neutrophiles dans les TNE est le seul moyen d'identifier les TN.
Dans les tissus, les TNE peuvent difficilement être détectées par des taches histologiques conventionnelles (p. ex., en tachant avec de l'hématoxylin/éosine [H et E], qui dépeint les EEM comme une teinte bleutée pâle diffuse). Ce n'est que lorsqu'ils sont très abondants que les NET peuvent être clairement distingués par la coloration de H et E, comme dans thrombi5. Étant donné que les EAC sont diffuses en soi, la structure tissulaire doit être préservée de façon optimale, de sorte que les cryo-préparations qui sont sujettes à induire des artefacts de congélation sont sous-optimales pour l'analyse des TN dans les tissus. Au lieu de cela, la fixation de formaldéhyde et l'embedding de paraffine a été montrée pour préserver la structure de NET dans le tissu bien2. (Immuno-)l'inspection histologique des sections de tissu paraffine-incorporée est la méthode standard pour l'analyse pathologique. Comme le tissu dans les blocs de paraffine est conservé même à température ambiante (RT), les spécimens de tissus provenant du travail diagnostique quotidien peuvent être comparés à des spécimens qui ont été préparés il y a des années, avec des questions et des techniques qui ont récemment surgi. Les TNNe dans les tissus n'ont pas été détectés jusqu'à récemment, et l'analyse détaillée de la formation et de l'élimination de l'EI au cours des maladies peut mener à de nouvelles connaissances sur la pathogénie. L'utilisation de tissus incorporés à la paraffine présente un avantage inestimable pour permettre l'analyse de documents d'archives et pour mener des études rétrospectives6. Indéniablement, ces avantages ont un coût. Avant d'incorporer de la paraffine, le tissu doit être fixé au formaldéhyde, déshydraté et chauffé au-dessus de 50 oC. Ces procédures induisent l'autofluorescence de tissu aussi bien que le masquage d'épitope.
Pour limiter les artefacts de fixation, le temps de fixation doit être réduit au minimum, de sorte que la taille des échantillons de tissus ne doit pas dépasser une superficie de 20 mm x 30 mm avec une épaisseur de 3 mm. Les échantillons de cette taille sont complètement fixés après l'incubation de nuit à RT dans le formaldéhyde, idéalement suivis par la déshydratation directe et l'intégration de paraffine. Alternativement, les échantillons fixes peuvent être stockés pendant 1 ou 2 jours dans un tampon. Pour les études d'immunofluorescence, le fixatif doit être fraîchement préparé à partir de paraformaldéhyde dissous dans un tampon approprié (p. ex., saline tamponnée en phosphate [PBS] ou saline tristamponisée [TBS]). Pendant la préparation fixative, la température doit être maintenue en dessous de 60 oC afin d'éviter la formation d'acide formique. La formaline, qui est un fixatif standard pour la pathologie, ne devrait pas être employée puisqu'elle contient le méthanol, d'autres aldéhydes, les cétones, et l'acide formique. Ces impuretés mènent au masquage accru d'épitope et à l'autofluorescence significative de tissu.
Pour l'immunoétiquetage réussi, le masquage d'épitope doit être retourné dans un processus appelé récupération d'antigène. Les sections de tissu sont chauffées dans un tampon approprié, qui est censé casser des ponts de méthylène, ainsi les épitopes deviennent accessibles aux anticorps7. Pour la détection des ENe, la récupération d'épitope induite par la chaleur (HIER) est préférable à d'autres méthodes telles que l'utilisation d'enzymes protéolytiques. Régulièrement, l'immunoétiquetage des sections de paraffine est effectué avec un seul anticorps suivi d'un anticorps secondaire étiqueté peroxidase, qui est détecté avec un substrat précipitant. Comparé à l'immunofluorescence, les méthodes de détection enzymatiques ont une résolution spatiale plus faible due à la diffusion du précipité de substrat, et généralement, la détection simultanée de plus d'un antigène est limitée6.
Comme actuellement il n'existe aucun anticorps qui se lie exclusivement aux NET, ce protocole est utilisé pour étiqueter deux protéines, l'histone 2B, qui est nucléaire, et l'élastase de neutrophile, qui est localisée dans les granules. Dans les neutrophiles non stimulés, ces protéines sont séparées, mais elles sont colocalisées dans les neutrophiles subissant la NETosis et dans les NETs. La détection simultanée de deux antigènes peut être réalisée avec deux anticorps primaires élevés chez des hôtes différents et deux anticorps secondaires spécifiques à l'espèce étiquetés avec différents fluorochromes. Ce rapport est une normalisation de notre protocole précédemment publié8 et utilise une combinaison de deux anticorps disponibles dans le commerce qui tachent de façon fiable les composants NET dans les tissus incorporés à la paraffine, frais et archivistiques, d'origine humaine et murine.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chicken anti Histone 2B antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab 134211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cold water fish gelatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>703-165-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-225-152</td>
			<td>alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding cassettes</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K116.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding molds</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding station</td>
			<td>Microm</td>
			<td>AP280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper, rolled</td>
			<td>OCB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>7a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cylinder with 20 cm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIER buffer pH 9</td>
			<td>Scytek</td>
			<td>TES999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (dry, up to 40 &#176;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>MMIPP30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>moist chamber (plastic box with tight lid)</td>
			<td>Emsa</td>
			<td>508542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>32.459-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal donkey serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP-pen ImmEdge</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>355S</td>
			<td>water bath included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Schubert /Weiss</td>
			<td>7020051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti ELANE antibody</td>
			<td>Atlas</td>
			<td>HPA068836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>racks, jars for microscope slides</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H554.1 H552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Fig.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus glass slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature-controlled hot plate</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>D6010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue processor for paraffin embedding</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline TBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath 37 &#176;C</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>widefield or confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMR, SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene (dimethylbenzene)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9713.3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue

Les granulocytes de Neutrophiles, également appelés leucocytes polymorphes (PMN) dus à leur noyau lobulé, sont le type le plus abondant de leucocytes. Ils mûrissent dans la moelle osseuse et sont libérés dans le sang périphérique, où ils circulent pendant environ 6 à 8 h; cependant, dans les tissus, ils peuvent survivre pendant des jours. Par diapède par l'endothélium, ils quittent la circulation sanguine, pénètrent dans les tissus, et migrent vers le site d'une infection suivant des gradients chimiothérapeutiques. Les neutrophiles peuvent combattre les micro-organismes envahissants par la phagocytose, la dégranulation et la génération de pièges extracellulaires neutrophiles (NET). Ce protocole aidera à détecter les EI dans les tissus incorporés à la paraffine. Les NET sont le résultat d'un processus appelé NETosis, qui conduit à la libération de composants nucléaires, granulaires et cytoplasmiques, soit à partir de neutrophiles vivants (NETosis vitaux) ou mourants (neTosis suicidaire). In vitro, les NET forment des structures en forme de nuages, qui occupent un espace plusieurs fois plus grand que celui des cellules d'où ils descendent. L'épine dorsale des NET est la chromatine, à laquelle une sélection de protéines et de peptides provenant de granules et de cytoplasmes sont liés. Par conséquent, une forte concentration locale de composés toxiques est maintenue de sorte que les NET puissent capturer et inactiver une variété d'agents pathogènes, y compris les bactéries, les champignons, les virus et les parasites, tout en diffusant les composants NET très actifs qui causent des dommages tissu voisin est limité. Néanmoins, ces dernières années, il est devenu évident que les ENi, s'ils sont générés en abondance ou effacés insuffisamment, ont un potentiel pathologique allant des maladies auto-immunes au cancer. Ainsi, la détection des NET dans les échantillons de tissu peut avoir une signification diagnostique, et la détection des NETs dans les tissus malades peut influencer le traitement des patients. Étant donné que les échantillons de tissus incorporés à la paraffine sont le spécimen standard utilisé pour l'analyse pathologique, il a été cherché à établir un protocole pour la coloration fluorescente des composants NET dans les tissus incorporés à la paraffine à l'aide d'anticorps disponibles dans le commerce.

En utilisant ce protocole, les composants NET peuvent être détectés avec succès dans les tissus incorporés à la paraffine à la fois d'origine humaine et murine. Dans les neutrophiles non stimulés, H2B est situé exclusivement dans le noyau et l'élastase de neutrophile dans les granules ; par conséquent, leurs signaux de fluorescence ne se chevauchent pas. En revanche, pendant la NETosis et après la formation de NET, NE, H2B, et l'ADN colocalisent partiellement. Si elles sont représentées comme des signaux verts, rouges et bleus, les zones de colocalisation sont représentées comme des fauves blanchâtres(Figure 1G, Figure 2Det Figure 3D). Cette overlay peut également être quantifiée à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image. Les pixels des signaux qui se chevauchent et qui sont positifs pour le vert, le rouge et le bleu ont été utilisés pour créer une superpose violette représentant les zones NET dans la figure 1G', Figure 2D', et Figure 3D'. Certaines cellules de la figure 1 et de la figure 2 ont des noyaux lobulés, mais sont négatives pour l'EN. On croit que ces cellules sont des granulocytes éosinophiles.
Si les sections de tissu ont une épaisseur de 2 à 3 m, elles peuvent être analysées par microscopie à large champ à l'aide d'objectifs 10x ou 20x. Un exemple est présenté dans la figure 1, qui représente une section de tissu d'appendicite humain tachée pour NE (vert), H2B (rouge) et Hoechst 33342 (bleu). Les panneaux A, C, E et G proviennent d'une section contenant des TNE, tandis que les panneaux B, D, F et H proviennent d'une zone différente de la même section, qui contient de nombreux neutrophiles(figure 1B, NE) mais pas d'ONÉ. Les zones avec la formation massive de NET peuvent facilement être trouvées même aux grossissements bas, puisque chacun des trois composants de NET colocalisent, souvent dans les structures extracellulaires filandreuses, qui dans la superpose des trois canaux apparaissent comme fibres extracellulaires blanchâtres(figure 1G ), la reiton violette dans la figure 1G'.
Les motifs de coloration des deux zones tissulaires sont clairement différents, avec l'EN contenue dans les granules (figure 1B) et l'ADN dans les noyaux (Figure 1F). Fait intéressant, la coloration du H2B est plutôt faible dans les zones riches en neutrophiles (figure 1D) par rapport aux tissus contenant du NET (Figure 1C). Cela pourrait être dû à la taille de l'anticorps (IgY a 180 kD par rapport à 150 kD pour IgG), ce qui peut empêcher la liaison à la chromatine compacte dans les noyaux intacts, tandis que l'accès à H2B est facilité si la chromatine est décondensée comme c'est le cas dans les NETs (Figure 1C).
Pour une résolution plus élevée, les microscopes confocals ou les microscopes à champ large avec deconvolution doivent être utilisés pour minimiser le flou flou flou. La figure 2 représente une zone riche en NET à partir du même spécimen d'appendicite humaine. Il s'agit d'une projection maximale d'une pile confocale. NE (vert, Figure 2A) se trouve dans les granules, mais est également abondante extracellulaire, où il colocalise avec H2B (rouge, figure 2B) et l'ADN (bleu, figure 2C). La colocalisation extracellulaire se traduit par une combinaison de couleurs blanchâtres (Figure 2D). Ces pixels positifs pour le vert, le rouge et le bleu ont été utilisés pour créer une overlay violet présentant les NET dans Figure 2D'.
La figure 3 est un détail d'une section centrale d'un poumon de souris infecté par Mycobacterium tuberculosis (M. tb). Les conditions de récupération et de coloration de l'antigène sont les mêmes que pour la figure 1 et la figure 2. Encore une fois, la colocalisation des trois composants NET est clairement visible sous forme de zones blanchâtres entre les neutrophiles, qui a été utilisée pour créer une couche violette indiquant les NET dans la figure 3D'.
La spécificité de la coloration est démontrée dans la figure supplémentaire 1, qui représente des taches négligeables avec des anticorps témoins, et la figure supplémentaire 1A, B représente le sérum lapin non immunisé (vert) et le poulet anti-GFP IgY (rouge). Figure 1 C,D montre la coloration avec des anticorps secondaires seuls, la combinaison était la même que ce qui a été utilisé dans la figure 1, Figure 2, et la figure 3. La figure supplémentaire 1A,C montre une section d'appendicite humaine semblable à la figure 1 et à la figure 2. Figure supplémentaire 1B, D est tissu pulmonaire de souris semblable à la figure 3. L'ADN est taché de Hoechst 33342. La barre d'échelle représente 25 m.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig01.jpg"> Figure 1 : Microscopie à fluorescence à grand champ d'une section de paraffine d'un échantillon d'appendicite humaine. Les panneaux A, C, E et G représentent une zone tissulaire avec des NET, tandis que les panneaux B, D, F et H montrent une zone différente de la même section qui est riche en neutrophiles mais sans formation NET. La coloration est contre NE(A,B; vert), H2B(C,D; rouge), et ADN(E,F; bleu). Figure 1G,H représente la reition des trois canaux. Les pixels d'une intensité comprise entre 80 et 256 dans toutes les couleurs représentent des zones de coloration qui se chevauchent pour le NE, le H2B et l'ADN et sont considérés comme dérivés de NET ou de neutrophiles subissant la NETosis. Ces pixels ont été pseudo-colorés comme violet dans le panneau G', où ils forment une grande surface; et dans le panneau H', où seules de petites taches sont trouvées. Les images ont été prises à l'aide d'un microscope à champ large à l'aide d'un objectif de 20x, et la barre d'échelle représente 25 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig02.jpg"> Figure 2 : microscopie par fluorescence confocale des composants NET d'un échantillon d'appendicite humaine. La même section de tissu utilisée dans la figure 1 a été utilisée. (A) Staining against NE, (B) Depiction of H2B, and (C) Hoechst 33342 staining of DNA. (D) La reition des trois canaux. La colocalisation des trois signaux est pseudo-couleur pourpre dans le panneau D'. Pour cela, les pixels d'une intensité de 80 euros dans les trois couleurs ont été détectés à l'aide de Volocity 6.3. La zone violette représente des NET ou des neutrophiles subissant neTosis. Les images ont été prises avec une microscopie confocale sous forme de piles Z et présentées comme projection maximale. La barre d'échelle représente 25 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig03.jpg"> Figure 3 : Microscopie par fluorescence confocale des composants NET d'un poumon de souris infecté par M. tb. Il s'agit d'un détail de la partie centrale d'une section d'un poumon complet avec une infiltration massive de neutrophiles. (A) NE coloration, (B) coloration H2B, et (C) taches d'ADN. (D) La reition des trois canaux. La superposition violette dans le panneau D' indique les pixels avec des valeurs d'intensité de 'gt;80 dans les trois couleurs indiquant les neutrophiles subissant NETosis ainsi que NETs. Les images ont été prises comme un Z-stacks avec un microscope confocal et présenté sa projection maximale. La barre d'échelle représente 25 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Figure supplémentaire 1 : Contrôle de la coloration avec des anticorps primaires non apparentés. Les tissus humains (A,C) et murine (B,D) utilisés pour la figure 1 et la figure 2, et la figure 3, respectivement, étaient tachés d'anticorps primaires non apparentés (A,B) ou sans anticorps primaires (C,D). Comme anticorps primaires de contrôle dans les panneaux A et B, le sérum d'un lapin non-immunisé et un IgY de poulet contre GFP ont été appliqués. Les anticorps secondaires étaient les mêmes que ceux indiqués dans toutes les autres taches et également utilisés dans les panneaux C et D. Comme prévu, dans toutes les conditions, des taches de fond négligeables ont été détectées, illustrant la spécificité des anticorps utilisés pour la figure 1, la figure 2et la figure 3. Les images ont été prises avec un microscope confocal, l'ADN taché de Hoechst 33342, et la barre d'échelle représente 25 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115supfig01large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.</a>

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Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) sont des structures tridimensionnelles produites par les granulocytes neutrophiles stimulés. Il est devenu clair ces dernières années que les ENe sont impliqués dans une grande variété de maladies. La détection des EAE dans les tissus peut avoir une pertinence diagnostique, de sorte que des protocoles normalisés pour l'étiquetage des composants NET sont nécessaires.

Immunofluorescence Étiquetage des pièges extracellulaires de l'homme et de la murine Neutrophil dans les tissus paraffins

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Aujourd’hui, nous aimerions vous montrer des variantes du protocole commun de récupération des antigènes induits par la chaleur. Il combine les avantages d’une température plus basse pour l’antigène d’élasstase de neutrophile et de la valeur élevée de pH qui est exigée pour des histones. Cette technique permet d’étudier les NETs, les pièges extracellulaires neutrophiles, dans les tissus de paraffine à la fois de souris ou d’hommes.Et il est également considéré comme étudiant des documents archivés ou des études rétrospectives. Tout d’abord, placez les glissières préparées dans des grilles et submersez-les dans les supports utilisés pour la déshydratation et le dégagement dans l’ordre inverse pendant cinq minutes chacun. Ensuite, chauffer un bain d’eau avec une plaque chaude à température contrôlée à 70 degrés Celsius.Placer un bocal rempli de tampon épitopique induit par la chaleur et 10% de glycérol dans le bain d’eau. Lorsque le tampon a atteint 70 degrés Celsius, placez le support avec les glissières dans le bocal tampon. Incuber les toboggans à 70 degrés Celsius pendant 120 minutes.Après cela, retirez le bocal du bain d’eau et laissez-le refroidir à température ambiante. Rincer les sections refroidies trois fois à l’eau ionisée et une fois avec le SCT. À l’aide de papier filtre roulé ou d’un coton-tige, retirer soigneusement tout liquide entre les sections des glissières, en s’assurant de laisser les sections hydratées.Ensuite, utilisez un stylo barrière hydrophobe pour créer une barrière autour de chaque section. Incuber la section en bloquant le tampon à température ambiante pendant 30 minutes pour éviter une liaison non spécifique. Diluer les anticorps primaires en bloquant le tampon à une concentration d’un microgramme par millilitre.Retirez le tampon de blocage des glissières et ajoutez les anticorps primaires dilués, en vous assurant d’utiliser un volume suffisant pour éviter le séchage. Fermer le contenant humide et incuber toute la nuit à température ambiante. Le lendemain, lavez les sections trois fois avec le SCT à chaque lavage d’une durée de cinq minutes.Préparez une solution de travail d’anticorps secondaires dans le blocage tampon. Couvrez les sections de tissus avec la solution secondaire d’anticorps, et transférez les glissières dans un récipient humide. Sceller le contenant humide et incuber à température ambiante pendant une heure.Après cela, laver les sections trois fois avec le SCT et une fois dans l’eau à chaque lavage d’une durée de cinq minutes. Couvrir les sections lavées d’un milieu de montage et appliquer le verre de couverture tout en évitant la formation de bulles. Une fois que le milieu de montage s’est solidifié, utilisez un microscope confocal ou un microscope à champ large avec des filtres de passage de bande appropriés pour analyser l’immunofluorescence.Pour numériser les sections complètes à l’aide d’un scanner de diapositives, réglez l’intensité de fluorescence à l’aide des contrôles négatifs et positifs. À l’aide de la coloration de l’élasstase neutrophile, trouvez les zones riches en neutrophiles et zoomez sur ces zones pour vérifier si le signal d’élastase neutrophile est granulaire ou extracellulaire. Si le signal est extracellulaire et chevauche à la fois l’histone et la coloration de l’ADN, les pièges extracellulaires neutrophiles ont été obtenus.Dans cette étude, les composants net sont détectés avec succès dans le tissu paraffin-incorporé, à la fois d’origine humaine et murine. Si les sections tissulaires ont une épaisseur comprise entre deux et trois micromètres, elles peuvent être analysées par microscopie à champ large à l’aide d’objectifs 10x ou 20x. Pour évaluer correctement la coloration, des échantillons négatifs et positifs ont été traités.Une section représentative du tissu humain d’appendicite montre des tissus souillés pour NE, H2B, et Hoechst 33342. Les images sur la gauche proviennent d’une zone de la section contenant des NETs, tandis que les images sur la droite proviennent d’une zone différente de la même section qui contient de nombreux neutrophiles, mais pas de NETs. Les zones avec la formation massive de NET peuvent facilement être trouvées même aux grossissements bas puisque les trois composants nets colocalisent souvent dans les structures extracellulaires filandreuses.Cela apparaît dans la superposition des trois canaux sous forme de fibres extracellulaires blanchâtres qui peuvent être quantifiées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image pour créer une superposition violette à l’aide de pixels provenant de signaux qui se chevauchent et qui sont positifs pour le vert, le rouge et le bleu. Pour une résolution plus élevée, les microscopes confocaux ou les microscopes à champ large avec déconvolution doivent être utilisés pour minimiser le flou. Une projection maximale d’une pile confoccale d’une zone riche en NET à partir du même spécimen d’appendicite humaine montre que l’ON se trouve dans les granules, mais est également abondante extracellulairement où il colocalise avec H2B et avec l’ADN.La colocalisation extracellulaire se traduit par une combinaison de couleurs blanchâtres. Les pixels positifs pour le vert, le rouge et le bleu peuvent à nouveau être utilisés pour créer une superposition violette présentant des NET. Un détail représentatif d’une section centrale d’un poumon de souris infecté par Mycobacterium tuberculosis fournit un autre exemple de la colocalisation des trois composants net étant clairement visible comme zones blanchâtres entre les neutrophiles qui peuvent être utilisés pour créer une couche violette indiquant nets.Pendant la procédure de coloration, les sections ne doivent pas tomber à sec parce que cela causera une tache faussement positive ou un fond élevé. L’analyse des documents archivés peut aider à comprendre l’impact des TNE dans les maladies. Parce que le tissu de paraffine peut avoir un fond énorme, il est important d’avoir un contrôle positif et négatif que vous pouvez distinguer entre votre coloration et l’arrière-plan.Le déwaxing et la déshydratation doivent être effectués sous un capot de fumée. Assurez-vous de porter des gants et votre manteau de laboratoire.

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