Name: immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue
Uploaded: 2019-09-10T14:00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue at JoVE.com

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I protocolli in tessuto sono stati approvati da Landesamt f'r Gesundheit und Soziales, Berlino, Germania (G0121/16). Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la direttiva europea 2010/63/EU in materia di assistenza, benessere e trattamento degli animali.
1. Fissaggio, disidratazione, incorporamento paraffina, sezionamento, montaggio delle sezioni
<ol><li>Preparare la soluzione del 2% di formaldeide sciogliendo la paraformaldeide in TBS (pH 7.4). Evitare il riscaldamento al di sopra dei 60 gradi centigradi. Raffreddare a RT. La soluzione di formaldeide può essere conservata a -20 gradi centigradi.</li>
	<li>Posizionare il tessuto fresco (qui: polmone di topo) in un piatto petri di vetro con TBS. Con un bisturi, sezionare in pezzi non superiori a 20 mm x 30 mm x 3 mm di dimensione. Immergere il campione in una soluzione di formaldeide del 2% in TBS. NOTA: Il volume di fissativo deve essere almeno 20 volte quello del tessuto.</li>
	<li>Fissare a RT per 8-20 h. Trasferire i campioni in TBS. Mettere in cassette.</li>
	<li>Disidratautilizzando una serie di etanolo (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), con ogni passo della durata di 1 h.</li>
	<li>Campioni chiari 2x in 100% xilene (dimethylbenzene), ogni passo 1 h.</li>
	<li>Immergere in paraffina 2x a 60 gradi centigradi (temperatura di fusione 54-56 gradi centigradi), ogni passo 1 h.</li>
	<li>Montare gli esemplari utilizzando stampi di incorporamento, utilizzare il fondo della cassetta come coperchio.</li>
	<li>Lasciare che la paraffina solidifichi e rimuova gli stampi di incorporamento.</li>
	<li>Preparate 3 sezioni di tessuto m e lasciatele galleggiare con un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Galleggiare sezioni sulla superficie dell'acqua su vetrini di vetro adesivo (Tabella dei materiali).</li>
	<li>Incubare sezioni su vetrini di vetro per una notte a 40 gradi centigradi per legare il tessuto al vetro.</li>
</ol>2. Reidratazione, recupero dell'epitopo indotto dal calore, colorazione, montaggio, analisi microscopica
<ol><li>Posizionare le sezioni sui vetrini in rack e immergerle nel supporto utilizzato per la disidratazione e la compensazione, in ordine inverso, con ogni passo per 5 min: 2x 100% xilene, serie di etanolo (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).</li>
	<li>Riscaldare un bagno d'acqua con una piastra calda a temperatura controllata a 70 gradi centigradi. Mettere un barattolo riempito con recupero dell'epitopo indotto dal calore (HIER)-buffer (pH 9; Tabella dei materiali), contenente il 10% di glicerolo come cuscinetto di temperatura, in un bagno d'acqua. Quando il buffer HIER ha raggiunto i 70 gradi centigradi, posizionare il rack con i vetrini nel barattolo del buffer.</li>
	<li>Incubare scivoli per 120 min a 70 gradi centigradi.</li>
	<li>Togliere il barattolo dal bagno d'acqua e lasciarlo raffreddare alle sezioni RT. Rinse 3x con acqua deionizzata e una volta con TBS (pH 7.4).</li>
	<li>Rimuovere con attenzione il liquido dai vetrini tra le sezioni con carta da filtro arrotolata o tampone di cotone, lasciando le sezioni idratate.</li>
	<li>Crea barriera intorno alle sezioni con una penna a barriera idrofobica.</li>
	<li>Incubare sezioni in buffer di blocco (1% di albumin del siero bovino [BSA], 2% siero d'asino normale, 5% di gelatina di pesce d'acqua fredda e detergenti [Tabella dei materiali] in TBS) a RT per 30 min per evitare rilegature non specifiche.</li>
	<li>Diluire gli anticorpi primari ad una concentrazione di 1 g/mL nel buffer di blocco. NOTA: Per i NET umani e topi, può essere utilizzata una combinazione di anticorpi di coniglio contro l'elascia dei neutrofili e l'anticorpo del pollo contro l'istone 2B (Tabella dei materiali).</li>
	<li>Inserire i vetrini in una camera umida. Rimuovere il buffer di blocco e aggiungere gli anticorpi primari diluiti senza lavaggio alle sezioni utilizzando un volume sufficiente per evitare l'essiccazione. Seal camera umida con pellicola di paraffina e incubare durante la notte a RT.</li>
	<li>Lavare le sezioni 3x con TBS per 5 min ciascuna.</li>
	<li>Preparare la soluzione di lavoro di anticorpi secondari nel buffer di blocco. Per la rilevazione di anticorpi primari, utilizzare anticorpi secondari sollevati in asino e pre-assorbiti contro le proteine del siero provenienti da più specie (Tabella dei materiali). Coprire le sezioni tissutali con soluzione funzionante di anticorpi secondari. Trasferire le diapositive nella camera umida, sigillare con pellicola di paraffina. Incubare per 1 h a RT. NOTA: L'asina anti coniglio coniugato a Cy2 e l'asino anti pollo coniugato a Cy3 può essere combinato con una controtendenza del DNA.</li>
	<li>Lavare le sezioni 3x per 5 min ciascuna con TBS, quindi una volta per 5 min con acqua deionizzata.</li>
	<li>Coprire le sezioni con supporto di montaggio (Table of Materials) e applicare il vetro di copertura evitando la formazione di bolle.</li>
	<li>Lasciare solidificare il mezzo di montaggio, quindi analizzare l'immunofluorescenza utilizzando un microscopio a campo largo con filtri di passata a banda appropriati o un microscopio confocale.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Cattoretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+unmasking+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue+sections.">Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.</a> Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).</li><li>Yamashita, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+heat-induced+antigen+retrieval:+analyses+in+vitro+employing+SDS-PAGE+and+immunohistochemistry.">Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).</li><li>Weckbach, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+drives+cardiac+inflammation+by+promoting+neutrophil+trafficking+and+NETosis+in+myocarditis.">Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).</li></ol>

La fonte di finanziamento di questo lavoro è la Max Planck Society. Ringraziamo Arturo Eychlinsky per aver letto criticamente il manoscritto e Philippe Saikali per il tessuto del topo.

Con la crescente consapevolezza del ruolo dei NET durante la patogenesi9, la loro rilevazione nel tessuto da pazienti o animali sperimentali sta acquistando sempre maggiore importanza. I campioni di tessuto incorporati nella paraffina presentano una serie di vantaggi rispetto ad altri preparati tissutali (ad esempio, sezioni di campioni crioconservati). La conservazione dei tessuti nei campioni incorporati in paraffina è chiaramente superiore, e una volta incorporati, i campioni vengono conservati per decenni, consentendo studi retrogradi. Per la rilevazione di NET, che sono strutture in filigrana, una buona conservazione del campione è una precondizione che esclude l'uso di materiale crioconservato, che è soggetto a danni ai tessuti dovuti alla formazione di cristalli di ghiaccio che possono dare origine a manufatti morfologicamente simili Reti.
Per una conservazione ottimale, il tessuto proveniente da animali sperimentali dovrebbe essere fissato poco dopo la morte, idealmente per perfusione, per evitare l'autolisi. Come soluzioni fissative, appena preparate o appena scongradite di paraformaldeide in un buffer adatto come TBS o PBS minerale ottimale. Questo è chimicamente definito in contrasto con i preparati formalina utilizzati per l'istologia standard, e induce meno autofluorescenza dei tessuti. Al contrario, il tessuto umano spesso non è fissato direttamente dopo l'escissione, e come fissativo, normalmente viene utilizzata una diluizione del 10% della formalina che contiene dal 10% al 15% del metanolo come stabilizzatore per prevenire la polimerizzazione, così come l'acido formica, altre aldeidi e chetoni . Spesso, il tessuto viene immagazzinato in questo fissativo per lunghi intervalli di tempo prima dell'incorporamento. Il risultato può essere l'autolisi (a seconda del tempo che intercorre tra l'escissione e la fissazione) e l'eccessiva formazione di ponti di metilene a causa della sovrafissazione. La fissazione della formaldeide induce cambiamenti nella struttura terziaria delle proteine mediante la formazione di ponti di metilene intra e intermolecolari10. I componenti cellulari non proteici come gli acidi nucleici, i carboidrati e i lipidi non sono fissati direttamente, ma immobilizzati nella rete proteica tridimensionale. Per un'etichettatura di successo, i legami di metilene devono essere rotti per esporre gli epitopi nel processo di recupero dell'antigene. Ciò si ottiene riscaldando le sezioni di tessuto montate su vetrini al microscopio in un buffer di recupero antigene indotto dal calore adatto (tampone HIER)11. Il nostro studio precedente ha analizzato l'influenza del pH e della temperatura dei buffer HIER sulla rilevazione di componenti NET nel tessuto paraffinato, ed è stato scoperto che il pretrattamento dei tessuti di successo per un componente spesso è non ottimale per un secondo componente8.
Nel frattempo, è stato scoperto che il riscaldamento del tessuto a 70 s nel buffer HIER a un pH di 9 è un buon compromesso per molti componenti NET e manterrà una buona conservazione dei tessuti, che è spesso compromessa a temperature più elevate. Si propone di utilizzare il tempo di recupero indicato come punto di partenza, ma soprattutto con campioni di archiviazione di parametri di fissazione sconosciuti, l'intensità di colorazione può essere insoddisfacente. In questo caso, il prolungamento di temperatura o superiore durante la procedura di recupero può migliorare l'efficienza di colorazione. Questo può anche influenzare la colorazione istone 2B dell'anticorpo IgY utilizzato nel nostro protocollo. Come mostrato nella Figura 1, la cromatina decondensata può essere trovata nei neutrofili sottoposti a NETosis e nelle macchie NET molto più forti con questo anticorpo rispetto alla cromatina nei neutrofili a riposo. Ciò è probabilmente dovuto all'accesso limitato della molecola 180 kDa IgY per compattare i nuclei e può differire dopo un aumento del recupero dell'epitopo. Questo può intensificare l'efficienza di legame anche in aree di cromatina condensata, che si tradurrà in una maggiore fluorescenza nei nuclei normali di neutrofili e altre cellule. La differenza di efficienza di colorazione tra neutrofili sottoposti a NETosi e neutrofili non stimolati potrebbe essere meno pronunciata di quanto illustrato nella Figura 1. Le aree di formazione della rete sarebbero ancora identificate dalla co-localizzazione di NE, H2B e DNA.
La procedura di fissazione può anche indurre una significativa autofluorescenza del tessuto, principalmente nella parte bluastra/verdastra dello spettro. È importante evitare la maggior parte di questa autofluorescenza utilizzando adeguati set di filtri a fluorescenza a passata stretta (wide-field) o impostazioni del rivelatore (confocale) che corrispondono al massimo di emissione del fluorocro mutuatismo utilizzato con eccitazione blu, ad esempio Cy2, Alexafluor 488. In casi estremi di autofluorescenza, la parte bluastra/verdastra dello spettro deve essere evitata. Invece, i segnali di fluorescenza possono essere rilevati più facilmente nella parte molto rossa dello spettro (ad esempio, anticorpi secondari accoppiati a Cy 5 o Alexafluor 635), ma questo richiede telecamere bianche/bianche senza filtro o microscopi confocali. Poiché l'occhio umano è piuttosto insensibile oltre i 600 nm, i segnali di fluorescenza molto rossi difficilmente possono essere rilevati usando oculari. In ogni caso, è importante utilizzare controlli negativi (ad esempio, controlli serali/isotipi non immuni al posto di anticorpi primari o che omettono anticorpi primari) per determinare i tempi di esposizione o le impostazioni dei rivelatori adatti.
Le sezioni di tessuto di 1x2m possono essere analizzate con microscopi ad ampio campo utilizzando obiettivi 10x o 20x. Queste lenti forniscono una grande profondità focale, quindi (quasi) l'intera sezione tissutale sarà a fuoco. Questo può essere utilizzato per eseguire rapidamente la scansione di sezioni di tessuto per le aree di formazione della rete se sono sufficientemente grandi (come nella Figura 1). La colocalizzazione dei canali verde (NE), rosso (H2B) e blu (DNA) produce una colorazione bianca che indica le aree di formazione della rete (Figura 1G). Per ingrandimenti superiori, sono necessari microscopi confocali o ad ampio raggio con deconvoluzione. Figura 2 Mostra i dettagli del campione di appendicite umana utilizzato anche per la figura 1. Nella figura 2A, NE si localizza in piccoli punti (granuli), ma una grande proporzione è extracellulare, spesso formando strisce che si sovrappongono con H2B (Figura 2B) e DNA (Figura 2C). Questa colocalizzazione produce una sovrapposizione biancastra che indica i NET (Figura 2D). Un modello molto simile può essere trovato nella sezione polmonare di un topo infettato da M. tuberculosis (Figura 3).
Gli esemplari qui presentati sono caratterizzati da aree con un alto grado di formazione della rete che possono essere identificate anche a bassa ingrandimento. A seconda della densità tissutale e del rispettivo stimolo, la formazione della rete può essere molto meno pronunciata, fino alla formazione netta di piccoli gruppi di neutrofili (per esempio nella miocardite, vedi una precedente pubblicazione12). Si ritiene che questo protocollo contribuirà a promuovere ulteriori ricerche sui NET nei tessuti e, si spera, aiutano a svelare ruoli non riconosciuti di NET nella formazione o nella prevenzione delle malattie.

Le trappole extracellulari neutrofilo (NET) hanno una complessa struttura tridimensionale. L'analisi microscopica ad alta risoluzione della scansione elettroquina ha rivelato che sono costituiti da fibre lisce con un diametro di 15-20 nm (cromatina) costellate di domini globulari di >25 nm che presumibilmente consistono in un assortimento di circa 30 granulari e citoplasmamici proteine e peptidi1,2. Quando generati in vitro da neutrofili isolati, i NET possono essere identificati dalla colorazione di due o più dei loro componenti mediante immunofluorescenza (ad esempio, istoni e elastasi neutrofili [NE]). Nei leucociti polimorfonucleari non stimolati (PMN), gli istoni si trovano esclusivamente nel nucleo, mentre NE è contenuto in granuli. Durante NETosis, NE entra nel nucleo, dove elabora gli istoni3,4. I NET sono caratterizzati dalla colocalizzazione dei componenti, che sono chiaramente separati in neutrofili non stimolati. Poiché attualmente non esistono anticorpi che rilevano esclusivamente epitopi specifici NET (cioè non reagiscono con neutrofili ingenui), rilevare la colocalizzazione delle proteine dei neutrofili nei NET è l'unico modo per identificare i NET.
Nel tessuto, i NET difficilmente possono essere rilevati dalle macchie istologiche convenzionali (ad esempio, colorando con l'ematossilina/eosin [H&E], che raffigura i NET come una tinta bluastra pallida diffusa). Solo quando altamente abbondanti, i NET possono chiaramente essere distinti con la colorazione H&E, come in trombi5. Poiché i NET sono diffusi di per sé, la struttura dei tessuti deve essere preservata in modo ottimale, quindi i crio-preparati che sono inclini a indurre artefatti di congelamento sono non ottimali per l'analisi dei NET nel tessuto. Invece, la fissazione della formaldeide e l'incorporamento della paraffina hanno dimostrato di preservare la struttura NET nel pozzo dei tessuti2. L'ispezione immuno-)logica di sezioni di tessuto incorporato in paraffina è il metodo standard per l'analisi patologica. Poiché il tessuto nei blocchi di paraffina viene conservato anche a temperatura ambiente (RT), i campioni di tessuto provenienti dal lavoro diagnostico quotidiano possono essere confrontati con campioni che sono stati preparati anni fa, con domande e tecniche che sono recentemente sorte. I NET nel tessuto non sono stati rilevati fino a poco tempo fa, e l'analisi dettagliata della formazione e della rimozione della rete durante il corso delle malattie può portare a nuove conoscenze sulla patogenesi. L'uso di tessuto incorporato in paraffina ha il vantaggio inestimabile per consentire l'analisi del materiale d'archivio e condurre studi retrospettivi6. Innegabilmente, questi benefici hanno un costo. Prima di incorporare in paraffina, il tessuto deve essere fissato con formaldeide, disidratato e riscaldato sopra i 50 gradi centigradi. Queste procedure inducono l'autofluorescenza dei tessuti e il mascheramento dell'epitopo.
Per limitare gli artefatti di fissazione, il tempo di fissaggio deve essere ridotto al minimo, in modo che la dimensione dei campioni di tessuto non superi un'area di 20 mm x 30 mm con spessore di 3 mm. I campioni di queste dimensioni sono completamente fissati dopo l'incubazione notturna a RT in formaldeide, idealmente seguita da disidratazione diretta e incorporamento paraffina. In alternativa, i campioni fissi possono essere conservati per 1 o 2 giorni nel buffer. Per gli studi di immunofluorescenza, il fissativo deve essere preparato fresco dalla paraformaldeide disciolta in un buffer adatto (ad esempio, la salina con buffer fosfato [PBS] o la saliera con buffer di Tris [TBS]). Durante la preparazione fissativa, la temperatura deve essere mantenuta al di sotto dei 60 gradi centigradi per evitare la formazione di acido formico. La formalina, che è un fissativo standard per la patologia, non deve essere utilizzata in quanto contiene metanolo, altre aldeidi, chetoni e acido formico. Queste impurità portano ad una maggiore mascheramento epitopiano e all'autofluorescenza significativa dei tessuti.
Per un immunolabelling di successo, il mascheramento dell'epitopo deve essere ripristinato in un processo chiamato recupero dell'antigene. Le sezioni di tessuto sono riscaldate in un buffer adatto, che si crede per rompere i ponti di metilene, quindi gli epitopi diventano accessibili agli anticorpi7. Per la rilevazione di NET, il recupero dell'epitopo indotto dal calore (HIER) è preferito ad altri metodi come l'uso di enzimi proteolitici. Regolarmente, l'immunoetichettatura delle sezioni di paraffina viene effettuata con un singolo anticorpo seguito da un anticorpo secondario etichettato perossidasi, che viene rilevato con un substrato precipitante. Rispetto all'immunofluorescenza, i metodi di rilevamento basati su enzimi hanno una risoluzione spaziale inferiore a causa della diffusione del precipitato del substrato e, in generale, il rilevamento simultaneo di più di un antigene è limitatoa 6.
Poiché attualmente non esistono anticorpi che si legano esclusivamente ai NET, questo protocollo viene utilizzato per etichettare due proteine, glistone 2B, che è nucleare, e l'elabosi dei neutrofili, che è localizzata in granuli. Nei neutrofili non stimolati, queste proteine sono separate, ma sono colocalizzate in neutrofili sottoposti a NETosis e in NET. Il rilevamento simultaneo di due antigeni può essere ottenuto con due anticorpi primari sollevati in diversi ospiti e due anticorpi secondari specifici per specie etichettati con fluorocrodiversi diversi. Questa relazione è una standardizzazione del nostro protocollo8 pubblicato in precedenza e utilizza una combinazione di due anticorpi disponibili in commercio che macchiano in modo affidabile i componenti NET nel tessuto incorporato in paraffina, sia fresco che d'archivio, di origine umana e murina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chicken anti Histone 2B antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab 134211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cold water fish gelatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>703-165-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-225-152</td>
			<td>alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding cassettes</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K116.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding molds</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding station</td>
			<td>Microm</td>
			<td>AP280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper, rolled</td>
			<td>OCB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>7a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cylinder with 20 cm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIER buffer pH 9</td>
			<td>Scytek</td>
			<td>TES999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (dry, up to 40 &#176;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>MMIPP30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>moist chamber (plastic box with tight lid)</td>
			<td>Emsa</td>
			<td>508542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 40-88</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>32.459-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal donkey serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP-pen ImmEdge</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>355S</td>
			<td>water bath included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Schubert /Weiss</td>
			<td>7020051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti ELANE antibody</td>
			<td>Atlas</td>
			<td>HPA068836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>racks, jars for microscope slides</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H554.1 H552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Fig.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus glass slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature-controlled hot plate</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>D6010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue processor for paraffin embedding</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline TBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath 37 &#176;C</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>widefield or confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMR, SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene (dimethylbenzene)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9713.3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue

I granulociti di neutrofilo, chiamati anche leucociti polimorfonucleari (PMN) a causa del loro nucleo lobulato, sono il tipo più abbondante di leucociti. Maturano nel midollo osseo e vengono rilasciati nel sangue periferico, dove circolano per circa 6-8 h; tuttavia, nei tessuti, possono sopravvivere per giorni. Con la diapedesi attraverso l'endotelio, lasciano il flusso sanguigno, entrano nei tessuti e migrano verso il sito di un'infezione a seguito di gradienti chemiotattici. I neutrofili possono combattere i microrganismi invasori mediante fagocitosi, degranlazione e generazione di trappole extracellulari neutrofiche (NET). Questo protocollo aiuterà a rilevare i NET nel tessuto incorporato in paraffina. I NET sono il risultato di un processo chiamato NETosis, che porta al rilascio di componenti nucleari, granulari e citoplasmici sia da vivere (NETosi vitale) che dalla morte (suicida NETosis) neutrofili. In vitro, i NET formano strutture simili a nuvole, che occupano uno spazio diverse volte più grande di quello delle cellule da cui discendono. La spina dorsale dei NET è la cromatina, a cui sono legati una selezione di proteine e peptidi provenienti da granuli e citoplasma. Di conseguenza, viene mantenuta un'elevata concentrazione locale di composti tossici in modo che i NET possano catturare e inattivare una varietà di patogeni, tra cui batteri, funghi, virus e parassiti, mentre la diffusione dei componenti NET altamente attivi che portano a danni tessuto adiacente è limitato. Tuttavia, negli ultimi anni è diventato evidente che le NET, se generate in abbondanza o cancellate in modo insufficiente, hanno un potenziale patologico che va dalle malattie autoimmuni al cancro. Pertanto, il rilevamento di NET nei campioni di tessuto può avere un significato diagnostico e il rilevamento di NET nel tessuto malato può influenzare il trattamento dei pazienti. Poiché i campioni di tessuto incorporato nella paraffina sono l'esemplare standard utilizzato per l'analisi patologica, è stato cercato di stabilire un protocollo per la colorazione fluorescente dei componenti NET nel tessuto incorporato nella paraffina utilizzando anticorpi disponibili in commercio.

Utilizzando questo protocollo, i componenti NET possono essere rilevati correttamente nel tessuto incorporato in paraffina sia di origine umana che murina. Nei neutrofili non stimolati, H2B si trova esclusivamente nel nucleo e nell'elastasi dei neutrofili nei granuli; di conseguenza, i loro segnali di fluorescenza non si sovrappongono. Al contrario, durante la formazione di NETosis e dopo la NET, NE, H2B e DNA colocalizzano in parte. Se vengono visualizzati come segnali verdi, rossi e blu, le aree di co-localizzazione vengono rappresentate come sovrapposizione biancastra (Figura 1G, Figura 2De Figura 3D). Questa sovrapposizione può anche essere quantificata utilizzando un software di analisi delle immagini. I pixel provenienti da segnali sovrapposti positivi per il verde, il rosso e il blu sono stati utilizzati per creare una sovrapposizione viola raffigurante aree NET in Figura 1G', Figura 2D'e Figura 3D'. Alcune delle cellule in Figura 1 e Figura 2 hanno nuclei lobulati ma sono negativi per NE. Si ritiene che queste cellule sono granulociti eosinofili.
Se le sezioni del tessuto hanno uno spessore di 2-3 m, possono essere analizzate mediante microscopia ad ampio campo utilizzando obiettivi 10x o 20x. Un esempio è presentato nella Figura 1, che illustra una sezione di tessuto umano appendicite macchiato per NE (verde), H2B (rosso) e Hoechst 33342 (blu). I pannelli A, C, E e G provengono da un'area della sezione contenente NET, mentre i pannelli B, D, F e H provengono da un'area diversa della stessa sezione, che contiene numerosi neutrofili (Figura 1B, NE) ma nessun NET. Aree con massiccia formazione DI rete possono essere facilmente trovati anche a bassi ingrandimenti, dal momento che tutti e tre i componenti NET colocalizzano, spesso in strutture extracellulari filanti, che nella sovrapposizione dei tre canali appaiono come fibre extracellulari biancastre(Figura 1G ), sovrapposizione viola in Figura 1G'.
I modelli di colorazione di entrambe le aree tissutali sono chiaramente diversi, con NE contenuto in granuli (Figura 1B) e DNA nei nuclei (Figura 1F). È interessante notare che la colorazione per H2B è piuttosto debole nelle aree ricche di neutrofili (Figura 1D) rispetto al tessuto contenente NET (Figura 1C). Ciò potrebbe essere dovuto alle dimensioni dell'anticorpo (IgY ha 180 kD rispetto a 150 kD per IgG), che può impedire il legame alla cromatina compatta nei nuclei intatti, mentre l'accesso all'H2B è facilitato se la cromatina viene decondensata come nel caso di NET (Figura 1C).
Per una risoluzione più elevata, i microscopi confocali o i microscopi widefield con deconvoluzione devono essere utilizzati per ridurre al minimo la sfocatura fuori fuoco. Figura 2 raffigura un'area ricca di rete dallo stesso esemplare di appendicite umana. È una proiezione massima di una pila confocale. NE (verde, figura 2A) si trova nei granuli, ma è anche abbondante extracellulare, dove colocalizza con H2B (rosso, Figura 2B) e DNA (blu, Figura 2C). La co-localizzazione extracellulare determina una combinazione di colori biancastra (Figura 2D). Questi pixel positivi per verde, rosso e blu sono stati utilizzati per creare una sovrapposizione viola che presenta NET in Figura 2D'.
Figura 3 è un dettaglio di una sezione centrale da un polmone di topo infettato con Mycobacterium tuberculosis (M. tb). Le condizioni di recupero e colorazione dell'antigene sono le stesse di Figura 1 e Figura 2. Ancora una volta, la colocalizzazione di tutti e tre i componenti NET è chiaramente visibile come aree biancastre tra neutrofili, che è stato utilizzato per creare uno strato viola che indica NET nella Figura 3D'.
La specificità della colorazione è dimostrata nella figura supplementare 1, che raffigura una colorazione trascurabile con anticorpi di controllo, e la figura supplementare 1A,B raffigura il siero non immunitario del coniglio (verde) e il pollo anti-GFPgY (rosso). Figura 1 C,D mostra la colorazione con anticorpi secondari da solo, la combinazione era la stessa utilizzata nella Figura 1, Figura 2e Figura 3. Figura supplementare 1A,C mostra una sezione di appendicite umana simile a Figura 1 e Figura 2. Figura supplementare 1B,D è tessuto polmonare del topo simile alla figura 3. Il DNA è macchiato con Hoechst 33342. La barra della scala rappresenta i 25 m.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig01.jpg"> Figura 1: Microscopia a fluorescenza a campo largo di una sezione di paraffina di un campione di appendicite umana. I pannelli A, C, E e G raffigurano un'area tissutale con NET, mentre i pannelli B, D, F e H mostrano un'area diversa della stessa sezione ricca di neutrofili ma senza formazione di rete. La colorazione è contro NE (A, B; verde), H2B (C, D; rosso) e DNA (E, F; blu). Figura 1G,H rappresenta la sovrapposizione di tutti e tre i canali. I pixel con un'intensità compresa tra 80 e 256 in tutti i colori rappresentano aree di colorazione sovrapposta per NE, H2B e DNA e sono considerati derivati da NET o neutrofili sottoposti a NETosis. Questi pixel sono stati pseudo-colorati come viola nel pannello G',dove formano una vasta area; e nel pannello H,dove si trovano solo piccole macchie. Le immagini sono state scattate con un microscopio a campo largo utilizzando un obiettivo 20x, e la barra della scala rappresenta 25 m. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig01large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig02.jpg"> Figura 2: Microscopia a fluorescenza confocale dei componenti NET in un campione di appendicite umana. È stata utilizzata la stessa sezione di tessuto utilizzata nella Figura 1. (A) Colorazione contro NE, (B) Rappresentazione di H2B, e (C) Hoechst 33342 colorazione del DNA. (D) La sovrapposizione di tutti e tre i canali. La co-localizzazione di tutti e tre i segnali è viola pseudo-colorato nel pannello D'. A tale scopo, i pixel con intensità >80 in tutti e tre i colori sono stati rilevati utilizzando Volocity 6.3. L'area viola raffigura NET o neutrofili sottoposti a NETosis. Le immagini sono state scattate con una microscopia confocale come stack z e presentate come proiezione massima. La barra della scala rappresenta 25 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60115/60115fig03.jpg"> Figura 3: Microscopia a fluorescenza confocale dei componenti NET in un polmone di topo infettato da M. tb. È un dettaglio dalla parte centrale di una sezione di un polmone completo con infiltrazione massiccia di neutrofili. (A) NE colorazione, (B) colorazione H2B, e (C) colorazione del DNA. (D) La sovrapposizione di tutti e tre i canali. La sovrapposizione viola nel pannello D' indica i pixel con valori di intensità di >80 in tutti e tre i colori che indicano neutrofili sottoposti a NETosis e NET. Le immagini sono state scattate come una z-stacks con un microscopio confocale e presentati come massima proiezione. La barra della scala rappresenta 25 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Supplementare Figura 1: Controllo della colorazione con anticorpi primari non correlati. L'uomo (A,C) e il tessuto murino (B,D) utilizzati rispettivamente per la figura 1 e la figura 2e la figura 3sono stati macchiati da anticorpi primari non correlati (A,B) o senza anticorpi primari (C,D). Come anticorpi primari di controllo nei pannelli A e B, sono stati applicati il siero di un coniglio non-immunizzato e un igY di pollo contro la GFP. Gli anticorpi secondari erano gli stessi come mostrato in tutte le altre colorazioni e utilizzati anche nei pannelli C e D. Come previsto, in tutte le condizioni è stata rilevata una colorazione di fondo trascurabile, che illustra la specificità degli anticorpi utilizzati per la figura 1, la figura 2e la figura 3. Le immagini sono state scattate con un microscopio confocale, il DNA macchiato con Hoechst 33342, e la barra della scala rappresenta 25 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60115/60115supfig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa figura.</a>

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Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Le trappole extracellulari neutrofilo (NET) sono strutture tridimensionali generate da granulociti neutrofili stimolati. È diventato chiaro negli ultimi anni che i NET sono coinvolti in una vasta gamma di malattie. Il rilevamento di RETI nei tessuti può avere rilevanza diagnostica, quindi sono necessari protocolli standardizzati per l'etichettatura dei componenti NET.

Immunofluorescenza Etichettatura delle trappole extracellulari di neutrofilo umano e murino nel tessuto incorporato di paraffina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Oggi vorremmo mostrarvi varianti del comune protocollo di recupero dell'antigene indotto dal calore. Combina i benefici di una temperatura più bassa per l'antigene neutrofilo dell'elastasi e un alto valore di pH richiesto per gli istoni. Questa tecnica consente di studiare NET, trappole extracellulari neutrofile, nei tessuti di paraffina sia da topo che da uomini.Ed è anche considerato per studiare materiale archiviato o studio retrospettivo. In primo luogo, posizionare le diapositive preparate nei rack e sommergerle nel supporto utilizzato per la disidratazione e la compensazione in ordine inverso per cinque minuti ciascuna. Quindi, riscaldare un bagno d'acqua con una piastra calda a temperatura controllata a 70 gradi Celsius.Posizionare un barattolo riempito con tampone di recupero dell'epitopo indotto dal calore e 10% di glicerolo nel bagno d'acqua. Quando il buffer ha raggiunto i 70 gradi Celsius, posizionare il rack con le diapositive nel barattolo del buffer. Incubare le diapositive a 70 gradi Celsius per 120 minuti.Dopo questo, rimuovere il barattolo dal bagno d'acqua e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Risciacquare le sezioni raffreddate tre volte con l'acqua ionizzata e una volta con TBS. Utilizzando carta filtrante arrotolata o un batuffolo di cotone, rimuovere con cura qualsiasi liquido tra le sezioni sui vetrini, assicurandosi di lasciare le sezioni idratate.Quindi, utilizzare una penna barriera idrofobica per creare una barriera intorno a ogni sezione. Incubare la sezione nel tampone di blocco a temperatura ambiente per 30 minuti per evitare attacchi non specifici. Diluire gli anticorpi primari nel tampone di blocco ad una concentrazione di un microgrammo per millilitro.Rimuovere il tampone di blocco dalle diapositive e aggiungere gli anticorpi primari diluiti, assicurandosi di utilizzare un volume sufficiente per evitare l'essiccazione. Chiudere il contenitore umido e incubare durante la notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte con TBS ad ogni lavaggio della durata di cinque minuti.Preparare una soluzione funzionante di anticorpi secondari nel tampone di blocco. Coprire le sezioni dei tessuti con la soluzione anticorpale secondaria e trasferire le diapositive in un contenitore umido. Sigillare il contenitore umido e incubare a temperatura ambiente per un'ora.Successivamente, lavare le sezioni tre volte con TBS e una volta in acqua con ogni lavaggio della durata di cinque minuti. Coprire le sezioni lavate con mezzo di montaggio e applicare il vetro di copertura evitando la formazione di bolle. Dopo che il mezzo di montaggio si è solidificato, utilizzare un microscopio confocale o un microscopio a campo largo con filtri passa banda appropriati per analizzare l'immunofluorescenza.Per digitalizzare le sezioni complete utilizzando uno scanner di diapositive, impostare l'intensità della fluorescenza utilizzando i controlli negativi e positivi. Utilizzando la colorazione neutrofila dell'elastasi, trovare le aree ricche di neutrofili e ingrandire quelle aree per verificare se il segnale neutrofilo elastasi è granulare o extracellulare. Se il segnale è extracellulare e si sovrappone sia alla colorazione istono che al DNA, sono state ottenute le trappole extracellulari neutrofile.In questo studio, i componenti NET vengono rilevati con successo nel tessuto incorporato nella paraffina, sia di origine umana che murina. Se le sezioni tissutali hanno uno spessore compreso tra due e tre micrometri, possono essere analizzate mediante microscopia a campo largo utilizzando obiettivi 10x o 20x. Per valutare correttamente la colorazione, sono stati elaborati campioni sia negativi che positivi.Una sezione rappresentativa del tessuto dell'appendicite umana mostra tessuti macchiati per NE, H2B e Hoechst 33342. Le immagini a sinistra provengono da un'area della sezione contenente NET, mentre le immagini a destra provengono da un'area diversa della stessa sezione che contiene numerosi neutrofili ma nessun NET. Le aree con formazione massiccia di NET possono essere facilmente trovate anche a bassi ingrandimenti poiché tutti e tre i componenti NET colocalizzano spesso in strutture extracellulari filanti.Questo appare nella sovrapposizione dei tre canali come fibre extracellulari biancastre che possono essere quantificate utilizzando il software di analisi delle immagini per creare una sovrapposizione viola utilizzando pixel da segnali sovrapposti che sono positivi per verde, rosso e blu. Per una risoluzione più elevata, i microscopi confocali o i microscopi a campo largo con deconvoluzione devono essere utilizzati per ridurre al minimo la sfocatura fuori fuoco. Una proiezione massima di una pila confocale di un'area ricca di NET dallo stesso campione di appendicite umana mostra che la NE si trova nei granuli ma è anche abbondante extracellularmente dove colocalizza con H2B e con DNA.La colocalizzazione extracellulare si traduce in una combinazione di colori biancastri. I pixel positivi per il verde, il rosso e il blu possono essere utilizzati ancora una volta per creare una sovrapposizione viola che presenta i NET. Un dettaglio rappresentativo di una sezione centrale di un polmone di topo infettato da Mycobacterium tuberculosis fornisce un altro esempio della colocalizzazione di tutti e tre i componenti NET chiaramente visibili come aree biancastre tra neutrofili che possono essere utilizzate per creare uno strato viola che indica i NET.Durante la procedura di colorazione, le sezioni non devono asciugarsi perché ciò causerà una colorazione falso-positiva o uno sfondo alto. L'analisi del materiale archiviato può aiutare a comprendere l'impatto dei NET nelle malattie. Poiché il tessuto di paraffina può avere uno sfondo enorme, è importante avere un controllo positivo e negativo che è possibile distinguere tra la colorazione e lo sfondo.La decerazione e la disidratazione devono essere eseguite sotto una cappa aspirante. Assicurati di indossare guanti e il cappotto da laboratorio.

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