Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

ويود المؤلفون ان يشكروا كلير كراير وفيونا روسي في جامعه ادنبره علي مساعدتهم الخبيرة في قياس التدفق الخلوي. ونود أيضا ان نشكر موظفي مستشفي موراريفيلد الذين ساهموا في تقديم عينات من الانسجه.
وكان هذا العمل مدعوما بمنح من مؤسسه القلب البريطانية والأحجار الكريمة ، التي زودت مجموعات تجهيز الانسجه الدهنية. وتم شراء عينات من انسجه الكبار البشرية باذن أخلاقي كامل من لجنه الأخلاقيات البحثية في جنوب شرق اسكتلندا (المرجع: 16/SS/0103).

تم الحصول علي الموافقة الاخلاقيه لاستخدام الانسجه البشرية في هذا البحث من لجنه أخلاقيات البحوث في جنوب شرق اسكتلندا (المرجع: 16/SS/0103).
1. جمع الانسجه الدهنية تحت الجلد البطن
ملاحظه: يتم توفير جميع الاداات المستخدمة في الاجراء اليدوي لشفط الدهون من قبل ا?...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

تصف هذه الورقة التجزئة الفيزيائية ، باستخدام جهاز مغلق ، من الانسجه الدهنية البشرية إلى مجموعات صغيره تعرض التشريح المجهري للانسجه الدهنية العادية.
يتم تحميل الانسجه الدهنية تحت الجلد الإنسان يدويا ومحلول ملحي في اسطوانه بلاستيكية شفافة تحتوي علي الكرات المعدنية الكبيرة...

الانسجه الدهنية ، وتستخدم لفتره طويلة كحشو في الجراحة الترميمية والتجميلية ، وقد أصبحت في الاونه الاخيره أكثر شعبيه في الطب التجديدي المعترف بها مره واحده كمصدر للخلايا الجذعية المسسبي (MSCs)1. الدهون الانزيميه المنفصلة في المعلقات أحاديه الخلية تسفر عن كسر الاوعيه الدموية اللحمية الخالية من الخلايا الشحمية (SVF) التي يتم استخدامها دون تغيير في المريض أو ، أكثر شيوعا ، يتم استزراعها لعده أسابيع في MSCs2.
ومع ذلك ، تفكك الانزيم تمزق بيئات الانسجه الصغرى ، عزله الخلايا التنظيمية المجاورة من الخلايا التجديدية المفترضة التي تصبح تعديلا كبيرا من قبل في المختبر الثقافة. لتجنب مثل هذه التحف التجريبية والتعديلات الوظيفية المترتبة علي ذلك ، بذلت محاولات لمعالجه الانسجه الدهنية للاستخدام العلاجي مع الحفاظ علي تكوينها الأصلي كما سليمه قدر الإمكان3،4. وعلي وجه الخصوص ، بدات اضطرابات الانسجه الميكانيكية لتحل محل التفكك الانزيمي. وتحقيقا لهذه الغاية ، الغمر الكامل مغلقه نظام الأجزاء الصغيرة الدهنية في الخلايا الفرعية ملليمتر ، والدم والنفط خاليه من مجموعات الانسجه (علي سبيل المثال ، ليبوجواهر) عن طريق سلسله من غربال الترشيح والرخام الصلب الناجم عن انقطاع3. الزرع الذاتي للانسجه الدهنية المجزاه جزئيا ، باستخدام هذه التكنولوجيا المغلقة للنظام ، كان ناجحا في مؤشرات متعددة ، والتي تغطي مستحضرات التجميل ، وجراحه العظام ، وطب المستقيم وامراض النسائية4،5، 6،7،8،9،10،11،12،13.
وكشفت المقارنة بين الانسجه الدهنية الدقيقة المجزاه البشرية (حصيره) التي تم الحصول عليها مع جهاز النظام المغلق و SVF العصبية انه فيما يتعلق بتوزيع الخلايا الوعائية/اللحمية والنشاط سيكريتوري في الثقافة ، حصيره يحتوي علي المزيد من بيريسيلات ، والتي هي المفترض MSCs14، ويفرز كميات اعلي من عوامل النمو و السايتوكينات15.
وتوضح هذه المادة التجزئة الصغرى الخالية من الانزيمات للانسجه الدهنية تحت الجلد البشرية باستخدام جهاز مغلق ، والمزيد من معالجه هذه الانسجه الدهنية المجهرية للثقافة الانبوبيه ، والمناعي ، وتحليل النظام ، من أجل تحديد أنواع الخلايا الموجودة والعوامل القابلة للذوبان التي يفرزها (الشكل 1). الطريقة الموصوفة بأمان يولد الدهنية المشتقة من الملليمتر العضوي الذي يحتوي علي خلايا الانسجه الدهنية قابله للحياة في مكانه سليمه ، ومناسبه لمزيد من التطبيقات والدراسات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

في العقد الماضي ، كانت عمليات زرع الانسجه الدهنية تستخدم علي نطاق واسع في الجراحة التجميلية وتقويم العظام لتعزيز أعاده الانسجه و/أو التجدد. وبناء علي ذلك ، تطورت تقنيات حصاد ومعالجه الانسجه الدهنية البشرية من أجل الحصول بسرعة وكفاءه علي كميات كبيره من الانسجه. ومن بين هذه التقنيات ، تمثل تكنولوجيا النظام المغلق نظاما مبتكرا وسهل الاستخدام لحصاد الانسجه الدهنية المكررة ومعالجتها وأعاده حقنها في وقت قصير وفي نفس التدخل (داخل العملية). يتم جمع الانسجه الدهنية عن طريق شفط الدهون ، وغسلها ، مستحلب ، شطف ومفروم ميكانيكيا في مجموعات الخلايا من 0.3 إلى 0.8 مم. وقد أظهرت الذاتي زرع الانسجه الدهنية مجزاه ميكانيكيا فعاليه ملحوظة في مختلف العلاجية مؤشرات مثل الطب التجميلي والجراحة ، والعظام والجراحة العامة. وكشف توصيف الانسجه الدهنية المجزاه جزئيا عن وجود السفن الصغيرة السليمة داخل مجموعات الخلايا الشحمية ؛ التالي ، ترك مشكاة الاوعيه الدموية غير مضطرب. وقد أثريت هذه التكتلات في خلايا الاوعيه الدموية (اي أسلاف الخلايا الجذعية (MSC)) واظهر التحليل في المختبر زيادة في الإفراج عن عوامل النمو والخلوية المشاركة في إصلاح الانسجه وتجديدها ، بالمقارنة مع MSCs انزيمي المشتقة. وهذا يوحي بان الإمكانات العلاجية المتفوقة للانسجه الدهنية المجزاه تفسر بتردد اعلي من MSCs المفترض والنشاط سيكريتوري المحسنة. وما إذا كانت هذه الإضافات المضافة تساهم مباشره في زيادة عامل النمو ولا يعرف إنتاج السايسيسين. يسمح هذا الاجراء الذي تمت الموافقة عليه سريريا بزرع MSCs المفترض دون الحاجة إلى التوسع و/أو العلاج الانزيمي ، التالي تجاوز متطلبات GMP المبادئ التوجيهية ، والحد من تكاليف العلاجات القائمة علي الخلايا.

ادي التفكك الميكانيكي للدهون اليدوية إلى إنتاج الانسجه الدهنية المجزاه جزئيا (MAT) ، والتي تتكون من مجموعه من الخلايا الشحمية التي تغلف شبكه الاوعيه المجهرية (الشكل 3). تحليل المناعية من الجيلاتين-جزءا لا يتجزا من كريوفيكسيد ويسلط الضوء علي هذا الهيكل ، وتب...

Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

هنا ، ونحن نقدم الإنسان الانسجه الدهنية خاليه من انزيم التجزئة الصغيرة باستخدام جهاز مغلق النظام. هذه الطريقة الجديدة تسمح لحصول علي من مجموعات المليمتر من الانسجه الدهنية المناسبة في زرع الجسم المجري, في المختبر الثقافة, والمزيد من العزلة الخلية وتوصيف.

الانسجه الدهنية البشرية التجزئة الصغرى لتوصيف الخلية وخصائص الإفراز

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

باستخدام هذا النظام، يمكننا جمع مجموعات دون ملليمتر من الأنسجة الدهنية البشرية، التي البيئة الدقيقة كلها من الخلايا المتجددة سليمة. النظام الأوعية الدموية الدقيقة بأكمله هو أيضا سليمة، وحتى نتمكن من استخدام هذا النوع من الأعضاء الدقيقة لزرع في vivo لثقافة في المختبر وعزل الخلايا لمزيد من التوصيف. الأساس المنطقي الرئيسي لاستخدام النظام في مختبر البحوث هو أن العملية خالية تماما من الإنزيمات ، وهكذا يسمح بمعالجة سريعة وفعالة للأنسجة الدهنية البشرية مع الحفاظ على بنية صغيرة وسيكون microvasculature من الأنسجة سليمة تماما.وهكذا يمكننا أن ندرس مباشرة منتج العلاج بالخلايا التي أثبتت بالفعل مفيدة جدا في العيادة. هذه التكنولوجيا نظام مغلق هو تقنية سهلة الاستخدام لحصاد ومعالجة وإعادة حقن الأنسجة الدهنية المكررة داخل العملية، ويمكن تطبيقها بنجاح في مستحضرات التجميل العظام، المستقيم، وأيضا أمراض النساء. هذه الطريقة تسمح بمزيد من الدراسة لتأثير الدهون في تجديد الأنسجة.سيتم إظهار الإجراء من قبل بيانكا فيزاني، زميل ما بعد الدكتوراه وماريو غوميز سالازار، وهو طالب دكتوراه. العمل في ظروف اتعفن في غضون 16 ساعة من الحصاد، وضع العينة البطن على رأس قطعة قماش جراحية مع الجلد التي تواجه صعودا. استخدام قنية تسلل الأنسجة القابل للتصرف لحقن 50 إلى 100 ملليلتر من 37 درجة مئوية 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم في الأنسجة الدهنية تحت الجلد.ربط 10 ملليلتر لور قفل حقنة إلى قنية شفط الدهون المتاح واستيعاب العينة في المنطقة الجلدية بالقرب من حافة العينة، وإدخال بعناية كانية في الأنسجة الدهنية. مرة واحدة في قنية داخل الأنسجة، واستخراج المكبس ونقل القنية شعاعي داخل عينة الأنسجة الدهنية. من المهم التعامل مع الأنسجة الدهنية بحزم خلال الشفط.إذا لم يتم جمع ما يكفي من الدهون، والنظر في إجراء حقن ملحية إضافية. عندما تكون الحقنة مليئة بالتبخر ، قم بإزالة القنب بعناية من الأنسجة واستبدل الحقنة الكاملة بحقنة فارغة جديدة حتى يتم حصاد ما مجموعه 60 ملليلترًا من الpirate. بالنسبة للتشظي الجزئي للنيبو- التعرق، قم بإزالة الجهاز من العبوة وتحقق من توصيل الوحدة الرئيسية بحقيبة النفايات.ضع كيس جمع النفايات على الأرض، وتأكد من أن الصمامات مؤمنة لأغطية وحدة المعالجة. يخترق منفذ اتصال الحقيبة لتوصيل ارتفاع المحطة الطرفية لخط الإدخال في كيس الملحية ووضع الحقيبة المالحة أعلى من وحدة المعالجة. تحقق من أن جميع المشابك الخمسة المتصلة بأنابيب الدوائر مفتوحة ، ووضع وحدة المعالجة في وضع عمودي ، والسماح للمحلول الملحي لملء وحدة المعالجة ، والتأكد من أن التدفق يصل إلى كيس النفايات.هز وحدة المعالجة لإزالة أي فقاعات الهواء ووضع الوحدة في وضع عمودي مع الغطاء الأزرق التي تواجه صعودا. أغلق المشبك بجوار خط الإدخال وتوصيل حقنة من الpirate lipo إلى الصمام الذاتي المُكدّس لغطاء الإدخال الأزرق للبدء في حقن الpirate lipo. الحفاظ على وحدة معالجة عمودي، ببطء دفع لأسفل على المكبس حقنة حتى تم نقل كل من التعرق ليبو إلى وحدة.عندما تم حقن كل من يبو-سبيرات، فتح المشبك المدخلات لاستعادة تدفق المالحة وهز بقوة وحدة المعالجة لمدة دقيقتين على الأقل، والتحقق بانتظام من تدفق محلول ملحي في كيس النفايات. عندما يتحول المحلول الملحي في وحدة المعالجة إلى شفاف، ضع الوحدة مع الغطاء الرمادي لأعلى واغلق المشابك الموجودة على التصريف بالقرب من كل من الأغطية الزرقاء والرمادية. سوف تطفو الأنسجة المجهزة في الجزء العلوي.المقبل، ملء 10 milliliter Luer قفل حقنة مع محلول ملحي، وربط حقنة لصمام التحميل من الغطاء الأزرق. توصيل فارغة 10 milliliter Luer قفل حقنة مع المكبس إدراجها تماما إلى صمام الغطاء الرمادي. حقن بحزم المالحة في وحدة المعالجة من الغطاء الأزرق، والتحقق من أن الحقنة المتصلة صمام رمادي يتم بالتالي شغلها مع الأنسجة المجهزة.عندما تم حقن كل من المالحة، وإزالة بعناية كل من المحاقن وتكرار ضخ المالحة حتى تم جمع جميع الأنسجة المصنعة. في نهاية المعالجة، وإزالة جميع المحاقن، وإغلاق جميع المشابك، وفصل كيس المالحة، والتخلص من الجهاز وفقا للبروتوكولات المحلية. عندما تم جمع جميع الأنسجة المعالجة، ونقل الأنسجة الدهنية مجزأة micro-مجزأة في وعاء معقمة، وإضافة حجم متساو من وسط الهضم للحاوية.وضع حاوية مختومة في 37 درجة مئوية يهز حمام الماء، تعيين إلى 120 دوران في الدقيقة لمدة 45 دقيقة، ووقف الهضم مع حجم مساو من حل منع في نهاية الحضانة. بالتسلسل تصفية العينة، أولا من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 100 تليها الترشيح من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70 والطرد المركزي تعليق المصفاة لمدة خمس دقائق في 200 مرة ز. نحن نعلق بيليه في حوالي 5 ملليلتر من تحلل كريثجليت العازلة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.وقف تحلل مع حجم متساو من حل حجب وتصفية الحل من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 40. ثم جمع خلايا الأنسجة الدهنية المجزأة الصغيرة عن طريق الطرد المركزي ونوقف بيليه في محلول منع جديد مع مزج الدقيق للعد. بعد التفكّك وتلطيخ الأجسام المضادة، يمكن أخذ الخلايا الدهنية المجزأة الصغرى إلى مقياس التدفق الخلوي لتحليل الخلايا و/أو الفرز.يؤدي الانفصام الميكانيكي للنيبوة التعرق اليدوي إلى إنتاج الأنسجة الدهنية المجزأة الصغيرة التي تتكون من مجموعة من الخلايا الشحمية التي تغلف شبكة الأوعية الدموية الدقيقة. تحليل immunofluorescence من الجيلاتين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة الدهنية micro-مجزأة المبردة يسلط الضوء على هيكل, تبين شبكة الأوعية الدموية التي تميزت علامة الخلية endothelial Ulex Europaeus Agglutinin 1 مستقبلات ويتكون أساسا من الأوعية الصغيرة مثل الشعيرات الدموية. وتجدر الإشارة إلى أن بيريكيتس التي تعبر عن مستضد الخلايا العصبية الدبقية 2 أو مستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية يتم توزيعها عادة، وهي الخلايا البطانية.باستبعاد CD31 إيجابية البطانية وD45 خلايا الدم الإيجابية, وجود CD146 إيجابية CD34 ال بيريكات سلبية وDD146 الخلايا السلبية وD34 يمكن تحديدها في MAT. دليل lipo-الطموح هو جزء حاسم من العملية ويجب أن يؤديها في ظروف معقمة لا يزيد عن 16 ساعة بعد عملية شد البطن. يمكن معالجة الأنسجة الدهنية المجزأة الصغيرة عن طريق التلطيخ المناعي، في الثقافة في المختبر أو التحليل السري للحصول على نظرة أعمق في بيولوجيا الأنسجة الدهنية.تسمح هذه التقنية بدراسة الأنسجة المتنوعة في ترتيبها الطبيعي ، الأصلي ، ثلاثي الأبعاد كنوع من الأعضاء الصغيرة ، والتي هي صغيرة بما يكفي لزرعها في الفئران أو للحفاظ عليها في ثقافة طويلة الأجل. ونحن نستخدم هذا النظام أساسا للاقتراب تجريبيا من مختلف البيئة الدقيقة الخاصة بالأعضاء. لا يعرف المتبرعون لدينا الأنسجة الدهنية كناقلة العدوى المنقولة.ولكن في غياب أي فحص آخر، ينبغي اعتبار جميع الأنسجة البشرية ملوثة محتملة ومناولته وفقاً لذلك.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

أديبو--واضحة: منديل مسح طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الدهنية

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

تصور لهيكل ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام تلطيخ كل جبل

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 يثري العائد من الخلايا الصباغية البشرية من أنسجة الجلد الكبار

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

استكشاف بنية الأنسجة الدهنية من ميثيل ساليسيلات المقاصة والتصوير ثلاثي الأبعاد

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

عزل وتوصيف وتطبيق علاجي للحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المستزرعة

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

عزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية لفئران Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

عزل شبه آلي للجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام مفكك الأنسجة

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...