Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Claire Cryer og Fiona Rossi på universitetet i Edinburgh for deres eksperthjælp med flow cytometry. Vi vil også gerne takke personalet på Murrayfield Hospital, der bidrog ved at levere vævsprøver.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra British Heart Foundation og Lipogems, som leverede fedtvæv behandlings kits. Humane voksne vævsprøver blev udtaget med fuld etik tilladelse fra South East Scotland Research etik Committee (reference: 16/SS/0103).

Etisk godkendelse af brugen af humane væv i denne forskning blev indhentet fra det sydøstlige Skotland Forskningsetiske udvalg (reference: 16/SS/0103).
1. subkutan abdominal fedtvæv samling
Bemærk: Alle instrumenter, der anvendes i den manuelle Lipo-Aspirations procedure, leveres af producenten af mikro-fragmenteringsanordningen.
<ol><li>Opretholde sterilitet for alle væsker, beholdere, instrumenter og det operative område under hele forsøg...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

Dette papir beskriver den fysiske fraktionering, ved hjælp af en lukket systemenhed, af humant fedtvæv i små klynger, der viser normal fedtvæv mikroanatomi.
Manuelt aspireret humant subkutant fedtvæv og saltopløsning er indlæst i en gennemsigtig plastik cylinder, der indeholder store Pinball-stil metalliske kugler, der efter kraftig manuel rystning af enheden, ruptur fedt i sub-millimeter Fragmenter. Vedlagte filtre og udløb tillader eliminering af snavs, blod og frie lipider og MÅTTE...

Fedtvæv, længe brugt som fyldstof i rekonstruktiv og kosmetisk kirurgi, er for nylig blevet mere populær i regenerativ medicin engang anerkendt som en kilde til mesenchymal stamceller (MSCs)1. Lipoaspirater dissocieres enzymatisk til enkelt celle suspensioner giver en adipocyt-fri stromale vaskulær fraktion (SVF), der anvendes uændret i patienten eller, mere almindeligt, dyrkes i flere uger i MSCs2.
Men, enzym dissociation rupturer vævs mikromiljøer, herunder tilstødende regulerende celler fra formodede regenerativ celler, der bliver betydeligt modificeret ved in vitro-kultur. For at undgå sådanne eksperimentelle artefakter og deraf følgende funktionelle ændringer, forsøg er blevet gjort for at behandle fedtvæv til terapeutisk brug samtidig bevare sin Native konfiguration så intakt som muligt3,4. Især er mekanisk vævs forstyrrelse begyndt at erstatte enzymatisk dissociation. Til dette formål, den fulde fordybelse lukket system mikro-fragmenter lipoaspirater i sub-millimeter, blod-og oliefri vævs klynger (f. eks, lipogems) via en sekvens af sigte filtrering og stål marmor induceret afbrydelse3. Autologt transplantation af mikro-fragmenteret fedtvæv, ved hjælp af denne lukkede system teknologi, har været en succes i flere indikationer, spænder kosmetik, ortopædi, proctology og Gynækologi4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Sammenligning mellem humant mikro-fragmenteret fedtvæv (MAT) opnået med det lukkede system anordning og isogene SVF viste, at med hensyn til vaskulær/stromale celle fordeling og sekretoriske aktivitet i kultur, MAT indeholder mere pericytes, som er formodede MSCs14, og udskiller større mængder af vækstfaktorer og cytokiner15.
Denne artikel illustrerer enzym-fri mikro-fragmentering af humant subkutant fedtvæv ved hjælp af en lukket system anordning, og den videre behandling af sådanne mikroniserede fedtvæv for in vitro-kultur, immunhistokemi og FACS analyse, for at identificere de tilstedeværende celletyper og de opløselige faktorer, som udskilles (figur 1). Den beskrevne metode genererer sikkert fedtvæv afledte sub-millimeter organoider indeholdende levedygtige fedtvæv cellepopulationer i en intakt niche, egnet til yderligere applikationer og undersøgelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

I de seneste ti år, fedtvæv transplantationer har været meget anvendt i plastikkirurgi og ortopædi til at forbedre vævs genskabelse og/eller regenerering. Derfor har teknikker til høst og forarbejdning af humant fedtvæv udviklet sig for hurtigt og effektivt at opnå store mængder væv. Blandt disse, den lukkede system teknologi repræsenterer en innovativ og nem at bruge systemet til høst, proces, og re-injicere raffineret fedtvæv på kort tid og i samme intervention (intra-operativt). Fedtvæv opsamles ved fedtsugning, vasket, emulgeret, skyllet og hakket mekanisk i celle klynger på 0,3 til 0,8 mm. autolog transplantation af mekanisk fragmenteret fedtvæv har vist bemærkelsesværdig effekt i forskellige terapeutiske indikationer såsom æstetisk medicin og kirurgi, ortopædisk og generel kirurgi. Karakterisering af mikro-fragmenteret fedtvæv afslørede tilstedeværelsen af intakte små fartøjer i fedtcellerne klynger; Derfor, den perivaskulære niche er overladt unperturbed. Disse klynger er beriget i perivaskulære celler (dvs., mesenchymal stamcelle (MSC) forfædre) og in vitro-analyse viste en øget frigivelse af vækstfaktorer og cytokiner involveret i vævsreparation og regenerering, sammenlignet med enzymatisk afledte MSCs. Dette tyder på, at det overlegne terapeutiske potentiale af mikrofragmenteret fedtvæv forklares ved en højere hyppighed af formodede MSCs og øget sekretorisk aktivitet. Hvorvidt disse tilsat pericytes direkte bidrager til højere vækstfaktor og cytokin produktion er ikke kendt. Denne klinisk godkendte procedure muliggør transplantation af formodede MSCs uden behov for udvidelse og/eller enzymatisk behandling, hvorved kravene i GMP-retningslinjerne tilsidesættes, og omkostningerne til cellebaserede terapier reduceres.

Mekanisk dissociation af manuelle lipoaspirater resulterede i produktion af mikro-fragmenteret fedtvæv (MAT), bestående af et aggregat af adipocytter omslutter et mikrovaskulære netværk (figur 3). Immunofluorescens analyse af gelatine-indlejret og cryofixed mat fremhæver denne struktur, der viser det vaskulære netværk markeret med endotel cellemarkør ulex Benved kold 1 (UEA-1) receptor hovedsagelig bestående af små, kapillar lignende beholdere ( <st...

Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

Her præsenterer vi humant fedtvæv enzym-fri mikro-fragmentering ved hjælp af en lukket systemenhed. Denne nye metode tillader erhvervelse af sub-millimeter klynger af fedtvæv egnet til in vivo transplantation, in vitro-kultur, og yderligere celle isolation og karakterisering.

Humant fedtvæv mikro-fragmentering for celle Phenotyping og Sekretome karakterisering

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Ved hjælp af dette system kan vi indsamle de submillidklynger af humant fedtvæv, hvor hele mikromiljøet af regenerative celler er intakt. Hele mikrovaskulære system er også intakt, og så vi kan bruge den slags mikroorganer til in vivo transplantation til in vitro kultur og celle isolation for yderligere karakterisering. Den vigtigste begrundelse for brugen af systemet i forskningslaboratoriet er, at processen er helt enzymfri, og derfor giver den mulighed for hurtig og effektiv behandling af humant fedtvæv, samtidig med at der opretholdes en mikroarkitektur, og det vil være mikrovasculaturen af vævet helt intakt.Og så kan vi direkte studere en celle terapi produkt, som har vist sig allerede meget nyttigt i klinikken. Denne lukkede system teknologi er en nem at bruge teknik til høst, forarbejdning og re-injektion raffineret fedtvæv intra-operative, og kan med held anvendes i kosmetik ortopædi, proctologi og også gynækologi. Denne metode giver mulighed for yderligere undersøgelse af virkningen af fedt i væv regenerering.Proceduren vil blive demonstreret af Bianca Vezzani, en postdoc stipendiat og af Mario Gomez-Salazar, der er en ph.d.-studerende. Arbejde under aseptiske forhold inden for 16 timer efter høst, placere maveplastik prøven oven på en kirurgisk klud med huden vender opad. Brug en engangsvæv infiltration kanyle til at injicere 50 til 100 milliliter af 37 grader Celsius 0,9% natriumchlorid opløsning i subkutan fedtvæv.Tilslut en 10 milliliter Luer-låsesprøjte til en engangssæbekanyle, og tag fat i prøven i det kutane område nær en kant af prøven, og indfør forsigtigt kanylen i fedtvævet. Når kanylen er inde i vævet, udtrække stemplet og flytte kanylen radialt i fedtvæv prøven. Det er vigtigt at håndtere fedtvævet fast under lipo-aspiration.Hvis der ikke indsamles nok fedt, overveje at udføre en ekstra saltvand injektion. Når sprøjten er fuld af lipo-aspirat, fjernes kanylen forsigtigt fra vævet og den fulde sprøjte udskiftes med en ny tom sprøjte, indtil der er høstet i alt 60 milliliter aspirat. Ved mikrofragmentering af lipo-aspiratet skal du fjerne enheden fra pakken og kontrollere, at hovedenheden er tilsluttet affaldsposen.Anstænker affaldsbeholderen på jorden, og sørg for, at ventilerne er fastgjort til procesenhedshætterne. Gennembor posen tilslutningsporten for at forbinde terminalspidsen på indgangsledningen i saltvandsposen og placer saltvandsposen højere end forarbejdningsenheden. Kontroller, at alle fem klemmer, der er forbundet til kredsløbenes rør, er åbne, anstænker behandlingsenheden i lodret position, lad saltvandsopløsningen fylde behandlingsenheden, og det bekræftes, at strømmen når affaldsposen.Ryst behandlingsenheden for at fjerne eventuelle luftbobler, og placer enheden i lodret position med den blå hætte opad. Luk klemmen ved siden af inputlinjen, og tilslut en sprøjte lipo-aspirat til den selvporluderende ventil på den blå indgangshætte for at begynde at injicere lipo-aspiratet. Hold behandlingsenheden lodret, tryk langsomt ned på sprøjtestemplingen, indtil hele lipo-aspiratet er overført til enheden.Når alle lipo-aspiratet er blevet injiceret, åbnes inputklemmen for at genoprette saltvandsstrømmen og kraftigt ryste behandlingsenheden i mindst to minutter, og saltvandsopløsningen regelmæssigt kontrolleres i affaldsposen. Når saltvandsopløsningen i behandlingsenheden bliver gennemsigtig, skal enheden placeres med den grå hætte opad og lukke klemmerne på afløbet nær både den blå og den grå hætter. Det forarbejdede væv vil flyde i toppen.Dernæst fyldes en 10 milliliter Luer låsesprøjte med saltvandsopløsning, og tilslut sprøjten til belastningsventilen på den blå hætte. Tilslut en tom 10 milliliter Luer-låsesprøjte med stemplet helt indsat i ventilen på den grå hætte. Injicer saltvandet i behandlingsenheden fra den blå hætte og kontrollerer, at sprøjten, der er tilsluttet den grå ventil, derfor fyldes med det forarbejdede væv.Når alt saltvandet er injiceret, fjernes begge sprøjter omhyggeligt, og saltvandsinfusionen gentages, indtil alt det forarbejdede væv er indsamlet. Ved afslutningen af behandlingen fjernes alle sprøjterne, alle klemmerne lukkes, saltvandsposen løsnes, og apparatet bortskaffes i henhold til lokale protokoller. Når alt det forarbejdede væv er indsamlet, overføres det mikrofra fragmenterede fedtvæv til en steril beholder, og der tilsættes et tilsvarende volumen fordøjelsesmedium til beholderen.Placer den forseglede beholder i en 37 grader Celsius rystende vandbad, indstillet til 120 rotationer i minuttet i 45 minutter, stoppe fordøjelsen med en tilsvarende volumen af blokerende opløsning i slutningen af inkubationen. Prøven filtreres sekventielt gennem en 100 mikrometercellestiel efterfulgt af filtrering gennem en 70 mikrometercellesal og centrifugeres den filtrerede suspension i fem minutter ved 200 gange g. Vi suspenderer pellet i ca 5 milliliter erythrocyt lysis buffer i 15 minutter ved stuetemperatur.Stop lysis med en tilsvarende volumen af blokerende opløsning og filtrer opløsningen gennem en 40 mikrometer celle si. Derefter indsamles de mikro-fragmenterede fedtvævsceller ved centrifugering, og vi suspenderer pellet i frisk blokerende opløsning med floure-blanding til optælling. Efter dissociation og antistoffarvning kan mikrofraksploserede fedtceller føres til flowcytometeret til celleanalyse og/eller sortering.Mekanisk dissociation af manuelle lipo-aspirater resulterer i produktion af mikro-fragmenteret fedtvæv, som består af et aggregat af adipocytter omsluttende et mikrovaskulært netværk. Immunofluorescensanalyse af gelatine indlejret i kryofikseret mikroinmenteret fedtvæv fremhæver strukturen, der viser det vaskulære netværk, der er markeret med endotelcellemarkøren Ulex Europaeus Agglutinin 1 receptor og hovedsagelig bestående af små kapillær-lignende beholdere. Især pericytter udtrykke neuron-glia antigen 2 eller blodplade-afledt vækstfaktor receptor beta er normalt fordelt, ensheathing endotelceller.Ved at udelukke CD31 positive endotelceller og CD45-positive hæmatopoietiske celler kan tilstedeværelsen af CD146 positive CD34 negative pericytter og CD146 negative og CD34 positive adventitialceller identificeres i MAT. Manuel lipo-aspiration er en kritisk del af proceduren og skal udføres under sterile forhold ikke mere end 16 timer efter maveplastik. Mikro-fragmenteret fedtvæv kan behandles yderligere ved immunohistokemisk farvning, in vitro kultur eller secretome analyse for at opnå en dybere indsigt i fedtvæv biologi.Denne teknik gør det muligt at studere forskellige væv i deres naturlige, indfødte, tre-dimensionelle arrangement som en slags små organoider, som er små nok til at blive transplanteret i mus eller til at blive opretholdt i langsigtet kultur. Og vi bruger dette system primært til at nærme sig eksperimentelt de forskellige organspecifikke mikromiljøer. Vores fedtvævdonorer er ikke kendt som bærere af overførbare infektioner.I mangel af yderligere screening bør alle humane væv imidlertid betragtes som potentielt kontamineret og håndteres i overensstemmelse hermed.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering af mitokondrier fra minimale mængder af Mouse Skeletmuskel for High Throughput Microplate Respiratory Målinger

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-klar: En væv Clearing metode til tredimensional billeddannelse af fedtvæv

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering af 3D hvidt fedtvæv struktur ved hjælp af hele-mount farvning

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Beriger udbyttet af humane melanocytter fra voksent hudvæv

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Udforskning af fedtvævsstruktur ved methylsalicylatclearing og 3D-billeddannelse

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering og terapeutisk anvendelse af ekstracellulære vesikler fra dyrkede humane mesenkymale stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolering og identifikation af mesenkymale stamceller afledt af fedtvæv fra Sprague Dawley rotter

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Halvautomatisk isolering af den stromale vaskulære fraktion fra murine hvidt fedtvæv ved hjælp af en vævsdissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...