Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

De auteurs willen Claire Cryer en Fiona Rossi van de Universiteit van Edinburgh bedanken voor hun deskundige hulp bij Flow Cytometry. We willen ook het personeel van het Murrayfield-ziekenhuis bedanken, dat bijgedragen heeft aan het verstrekken van weefsel specimens.
Dit werk werd gesteund door subsidies van de British Heart Foundation en Lipogems, die vetweefsel processing kits leverde. Menselijke weefselmonsters voor volwassenen werden verkregen met volledige ethische toestemming van het onderzoek ethisch comité van Zuidoost-Schotland (Referentie: 16/SS/0103).

Ethische goedkeuring voor het gebruik van menselijke weefsels in dit onderzoek werd verkregen uit het onderzoek ethisch comité van Zuidoost-Schotland (Referentie: 16/SS/0103).
1. subcutane abdominale vetweefsel verzameling
Opmerking: Alle instrumenten die in de handmatige LiPo-aspiratie procedure worden gebruikt, worden geleverd door de fabrikant van de micro-fragmentatie inrichting.
<ol><li>Behoud de steriliteit voor alle vloeistoffen, container...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

Dit artikel beschrijft de fysieke fractionering, met behulp van een gesloten systeem apparaat, van menselijke vetweefsel in kleine clusters weergeven van normale vetweefsel micro anatomie.
Handmatig aanzuiging menselijk onderhuidse vetweefsel en zoutoplossing worden geladen in een transparante plastic cilinder met grote flipperkast-achtige metalen bollen die, na krachtig handmatig schudden van het apparaat, het vet in sub-millimeter breken Fragmenten. Bijgevoegde filters en uitlaat maken het e...

Vetweefsel, lang gebruikt als een vuller in reconstructieve en cosmetische chirurgie, is onlangs populairder geworden in regeneratieve geneeskunde, ooit herkend als een bron voor mesenchymale stamcellen (MSCs)1. Lipoaspiraten gezien enzymatisch in eencellige suspensies opleveren een adipocyte-vrije stromale vasculaire fractie (SvF) die ongewijzigd wordt gebruikt in de patiënt of, meer in het algemeen, wordt gekweekt voor enkele weken in MSCS2.
Echter, enzym dissociatie breekt de weefsel micro-omgevingen, afzondering naburige regelgevende cellen van vermoedelijke regeneratieve cellen die aanzienlijk worden gewijzigd door in vitro cultuur. Om dergelijke experimentele artefacten en de daaruit voortvloeiende functionele veranderingen te vermijden, zijn pogingen gedaan om vetweefsel te verwerken voor therapeutisch gebruik, terwijl de oorspronkelijke configuratie zo intact mogelijk was3,4. Met name, mechanische weefsel verstoring is begonnen met het vervangen van enzymatische dissociatie. Hiertoe, de volledige onderdompeling gesloten systeem micro-fragmenten lipoaspirates in sub-millimeter, bloed-en olievrije weefsel clusters (bijvoorbeeld Lipogems) via een opeenvolging van zeef filtratie en staal marmer geïnduceerde verstoring3. Autologe transplantatie van micro-gefragmenteerd vetweefsel, met behulp van deze gesloten systeemtechnologie, is succesvol geweest in meerdere indicaties, spanning van cosmetica, orthopedie, Proctologie en Gynaecologie4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Vergelijking tussen humaan micro-gefragmenteerd vetweefsel (MAT) verkregen met het gesloten systeem apparaat en isogene SVF onthulde dat met betrekking tot de vasculaire/stromale celverdeling en secretoire activiteit in cultuur, MAT meer pericytes bevat, die vermoedelijke MSCs14, en afscheidigt hogere hoeveelheden groeifactoren en cytokines15.
Het huidige artikel illustreert de enzym vrije micro fragmentatie van menselijk subcutaan vetweefsel met behulp van een gesloten systeem apparaat, en de verdere verwerking van dergelijk gemicroniseerd vetweefsel voor in vitro cultuur, immunohistochemie en FACS analyse, om de aanwezige celtypen te identificeren en de oplosbare factoren te scheiden (Figuur 1). De beschreven methode genereert veilig vetweefsel afgeleide sub-millimeter organoïden met levensvatbare vetweefsel celpopulaties in een intacte niche, geschikt voor verdere toepassingen en studies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

In het afgelopen decennium zijn vetweefsel transplantaties op grote schaal gebruikt in plastische chirurgie en orthopedie om weefsel repletie en/of regeneratie te verbeteren. Dienovereenkomstig zijn technieken voor het oogsten en verwerken van menselijk vetweefsel geëvolueerd om snel en efficiënt grote hoeveelheden weefsel te verkrijgen. Onder deze, de gesloten systeemtechnologie vertegenwoordigt een innovatief en eenvoudig te gebruiken systeem om te oogsten, te verwerken, en opnieuw te injecteren verfijnd vetweefsel in een korte tijd en in dezelfde interventie (intra-operatief). Vetweefsel wordt opgevangen door liposuctie, gewassen, geëmulgeerd, gespoeld en machinaal fijngehakt in celclusters van 0,3 tot 0,8 mm. autologe transplantatie van mechanisch gefragmenteerd vetweefsel heeft opmerkelijke werkzaamheid aangetoond bij verschillende therapeutische indicaties zoals esthetische geneeskunde en chirurgie, orthopedische en algemene chirurgie. Karakterisering van micro-gefragmenteerd vetweefsel onthulde de aanwezigheid van intacte kleine vaten binnen de adipocyten clusters; Vandaar, de perivasculaire niche blijft onperturbed. Deze clusters zijn verrijkt in perivasculaire cellen (dat wil zeggen, mesenchymale stamcel (MSC) voor ouders) en in vitro analyse toonde een verhoogde afgifte van groeifactoren en cytokines die betrokken zijn bij weefselherstel en regeneratie, vergeleken met enzymatisch afgeleide MSCs. Dit suggereert dat het superieure therapeutische potentieel van micro gefragmenteerd vetweefsel wordt verklaard door een hogere frequentie van vermoedelijke MSCs en verbeterde secretoire activiteit. Of deze toegevoegde pericytes rechtstreeks bijdragen aan een hogere groeifactor en de productie van cytokine is niet bekend. Deze klinisch goedgekeurde procedure maakt de transplantatie van vermoedelijke MSCs mogelijk zonder de noodzaak van expansie en/of enzymatische behandeling, waardoor de vereisten van de GMP-richtlijnen worden omzeild en de kosten voor cel-gebaseerde therapieën worden verminderd.

Mechanische dissociatie van handmatige lipoaspiraten resulteerde in de productie van micro-gefragmenteerd vetweefsel (MAT), bestaande uit een aggregaat van adipocytes omhullende een microvasculaire netwerk (Figuur 3). Immunofluorescentie analyse van gelatine-embedded en cryovaste MAT benadrukt deze structuur, met het vasculaire netwerk gemarkeerd door de endotheliale celmarker ulex europaeus agglutinine 1 (UEA-1)-receptor, voornamelijk bestaande uit kleine, c...

Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

Hier presenteren we menselijke vetweefsel enzym-vrije micro-fragmentatie met behulp van een gesloten systeem apparaat. Deze nieuwe methode maakt het verkrijgen van sub-millimeter clusters van vetweefsel geschikt voor in vivo transplantatie, in vitro cultuur, en verdere celisolatie en karakterisering.

Menselijke vetweefsel micro-fragmentatie voor Celfenotyping en Secretome karakterisatie

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Met behulp van dit systeem kunnen we de sub-millimeter clusters van menselijk vetweefsel verzamelen, waarin de hele micro-omgeving van regeneratieve cellen intact is. Het hele microvasculaire systeem is ook intact, en dus kunnen we dit soort microorganen gebruiken voor in-vivo transplantatie voor in-vitro cultuur en voor celisolatie voor verdere karakterisering. De belangrijkste reden voor het gebruik van het systeem in het onderzoekslaboratorium is dat het proces volledig enzymvrij is, en dus maakt het de snelle en efficiënte verwerking van menselijk vetweefsel mogelijk met behoud van een micro-architectuur en het zal de microvasculatuur van het weefsel volledig intact zijn.En zo kunnen we direct een celtherapieproduct bestuderen dat al zeer nuttig is gebleken in de kliniek. Deze gesloten systeemtechnologie is een gebruiksvriendelijke techniek voor het oogsten, verwerken en herinjecteren geraffineerd vetweefsel intraoperatief, en kan met succes worden toegepast in cosmetica orthopedie, proctologie en ook gynaecologie. Deze methode maakt verdere studie van de impact van vet in weefselregeneratie mogelijk.De procedure zal worden aangetoond door Bianca Vezzani, een postdoctoraal fellow en door Mario Gomez-Salazar, die een promovendus. Werken onder aseptische omstandigheden binnen 16 uur na het oogsten, plaats de abdominoplastie monster op de top van een chirurgische doek met de huid naar boven gericht. Gebruik een wegwerpweefsel infiltratie canule te injecteren 50 tot 100 milliliter van 37 graden Celsius 0,9% natriumchloride oplossing in het onderhuidse vetweefsel.Sluit een 10 milliliter Luer lock spuit aan op een wegwerp liposuctie canule en het grijpen van het monster op het cutane gebied in de buurt van een rand van het monster, voorzichtig introduceren van de canule in het vetweefsel. Zodra de canule is in het weefsel, extract van de zuiger en beweeg de canule radiaal binnen het vetweefsel monster. Het is belangrijk om het vetweefsel stevig te behandelen tijdens de lipo-aspiratie.Als er niet genoeg vet wordt verzameld, overweeg dan het uitvoeren van een extra zoutinjectie. Wanneer de spuit vol lipo-aspiraat is, verwijder dan voorzichtig de canule uit het weefsel en vervang de volledige spuit door een nieuwe lege spuit totdat in totaal 60 milliliter aanzuigen is geoogst. Voor microfragmentatie van de lipo-aanzuigen, verwijder het apparaat uit de verpakking en controleer of de hoofdeenheid is aangesloten op de afvalzak.Leg de afvalinzamelzak op de grond en zorg ervoor dat de kleppen aan de doppen van de proceseenheid worden bevestigd. Doorboor de zakverbindingspoort om de terminalpiek van de invoerlijn in de zoutzak aan te sluiten en de zoutzak hoger te positioneren dan de verwerkingseenheid. Controleer of alle vijf de klemmen die op de buizen van de circuits zijn aangesloten, open zijn, plaats de verwerkingseenheid in een verticale positie, laat de zoutoplossing de verwerkingseenheid vullen en bevestig dat de stroom de afvalzak bereikt.Schud de verwerkingseenheid om luchtbellen te verwijderen en plaats het apparaat in een verticale positie met de blauwe dop naar boven gericht. Sluit de klem naast de ingangslijn en sluit een spuit lipo-aspiraat aan op de zelf-occluding klep van de blauwe ingangsdop om te beginnen met het injecteren van de lipo-aspirate. Houd de verwerkingseenheid verticaal, duw langzaam naar beneden op de spuit zuiger totdat alle lipo-aspiraat is overgebracht naar het apparaat.Wanneer alle lipo-aspiraat is geïnjecteerd, open de input klem om de zoutstroom te herstellen en krachtig schudden van de verwerkingseenheid gedurende ten minste twee minuten, regelmatig controleren van de zoutoplossing stroom in de afvalzak. Wanneer de zoutoplossing in de verwerkingseenheid transparant wordt, plaatst u het apparaat met de grijze dop naar boven en sluit u de klemmen op de afvoer in de buurt van zowel de blauwe als de grijze doppen. Het verwerkte weefsel zweeft aan de bovenkant.Vul vervolgens een Luer-sluimer van 10 milliliter Luer met zoute oplossing en sluit de spuit aan op de laadklep van de blauwe dop. Sluit een lege Luer-sluisspuit van 10 milliliter aan met de zuiger die volledig op de klep van de grijze dop wordt geplaatst. De zoutoplossing stevig in de verwerkingseenheid injecteren vanuit de blauwe dop, waarbij wordt gecontroleerd of de met de grijze klep verbonden spuit bijgevolg wordt gevuld met het verwerkte weefsel.Wanneer alle zoute is geïnjecteerd, verwijder voorzichtig beide spuiten en herhaal de zoutoplossing tot alle verwerkte weefsels zijn verzameld. Verwijder aan het einde van de verwerking alle spuiten, sluit alle klemmen, maak de zoutzak los en gooi het apparaat volgens lokale protocollen weg. Wanneer al het verwerkte weefsel is verzameld, breng het micro-gefragmenteerde vetweefsel in een steriele container en voeg een gelijk volume van de spijsvertering medium aan de container.Plaats de verzegelde container in een 37 graden Celsius schudden water bad, ingesteld op 120 rotaties per minuut gedurende 45 minuten, het stoppen van de spijsvertering met een gelijk volume van het blokkeren van oplossing aan het einde van de incubatie. Consequent filteren het monster, eerst door middel van een 100 micrometer cel zeef gevolgd door filtratie door middel van een 70 micrometer cel zeef en centrifugeren de gefilterde suspensie gedurende vijf minuten op 200 keer g. We schorten de pellet in ongeveer 5 milliliter erythrocyte lyse buffer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.Stop de lysis met een gelijk volume van de blokkeringsoplossing en filter de oplossing door een 40 micrometer celzeef. Verzamel vervolgens de micro-gefragmenteerde vetweefselcellen door centrifugatie en we schorten de pellet op in verse blokkeeroplossing met floure-mengen voor het tellen. Na dissociatie en antilichaamkleuring kunnen microfragmenteerde vetcellen naar de stroomcytometer worden gebracht voor celanalyse en/of sortering.Mechanische dissociatie van handmatige lipo-aspiraten resulteert in de productie van micro-gefragmenteerd vetweefsel dat bestaat uit een aggregaat van adipocyten die een microvasculair netwerk omhullen. Immunofluorescentieanalyse van gelatine ingebed in cryofixed micro-gefragmenteerd vetweefsel benadrukt de structuur, met het vasculaire netwerk dat wordt gekenmerkt door de endotheelcelmarker Ulex Europaeus Agglutinine 1-receptor en voornamelijk bestaat uit kleine capillaire vaten. Met name pericyten die neuron-gliaantant 2 of bloedplaatjes-afgeleide groeifactorreceptor bèta uitdrukken, worden normaal gesproken verdeeld, ensheathing endotheelcellen.Door cd31-positieve endotheel- en CD45-positieve hematopoietische cellen uit te sluiten, kan de aanwezigheid van CD146-positieve CD34-negatieve pericyten en CD146-negatieve en CD34-positieve adventitiale cellen worden geïdentificeerd binnen de MAT. Handmatige lipo-aspiratie is een cruciaal onderdeel van de procedure en moet niet meer dan 16 uur na de abdominoplastie onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Micro-gefragmenteerd vetweefsel kan verder worden verwerkt door immunohistochemische kleuring, in vitro cultuur of secretoom analyse om een dieper inzicht in vetweefsel biologie te verkrijgen.Deze techniek maakt het mogelijk om diverse weefsels in hun natuurlijke, inheemse, driedimensionale opstelling te bestuderen als een soort kleine organoïden, die klein genoeg zijn om te worden getransplanteerd in muizen of te worden gehandhaafd in de langetermijncultuur. We gebruiken dit systeem voornamelijk om de verschillende orgaanspecifieke micro-omgevingen experimenteel te benaderen. Onze vetweefseldonoren staan niet bekend als dragers van overdraagbare infecties.Bij gebrek aan verdere screening moeten alle menselijke weefsels echter als mogelijk verontreinigd worden beschouwd en dienovereenkomstig worden behandeld.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actine Co-Sedimentatie Assay, want de analyse van eiwit binding aan F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: Een weefsel Clearing methode voor driedimensionale beeldvorming van vetweefsel

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisatie van 3D witte adipeus weefsel structuur met behulp van geheel-mount kleuring

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 verrijkt de opbrengst van menselijke melanocyten uit volwassen huidweefsels

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Het verkennen van vetweefselstructuur door methylsalicylaatcle clearing en 3D-beeldvorming

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolatie, karakterisering en therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes uit gekweekte menselijke mesenchymale stamcellen

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...