Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier Claire Cryer et Fiona Rossi de l'Université d'Édimbourg pour leur aide experte en cytométrie des flux. Nous tenons également à remercier le personnel de l'hôpital de Murrayfield qui a contribué en fournissant des échantillons de tissus.
Ce travail a été soutenu par des subventions de la British Heart Foundation et lipogems, qui a fourni des kits de traitement des tissus adipeux. Des échantillons de tissus humains pour adultes ont été obtenus avec la pleine autorisation éthique du South East Scotland Research Ethics Committee (référence : 16/SS/0103).

L'approbation éthique de l'utilisation des tissus humains dans cette recherche a été obtenue du South East Scotland Research Ethics Committee (référence : 16/SS/0103).
1. Sous-cutané abdominal Adipose Tissue Collection
REMARQUE: Tous les instruments utilisés dans la procédure manuelle de lipo-aspiration sont fournis par le fabricant de l'appareil de micro-fragmentation.
<ol><li>Maintenir la stérilité de tous les fluides, conteneurs, inst...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

Cet article décrit la fractionnement physique, utilisant un dispositif fermé de système, du tissu adipeux humain en petits groupes affichant la microanatomie normale de tissu adipeux.
Le tissu adipeux sous-cutané humain aspiré manuellement et la solution saline sont chargés dans un cylindre en plastique transparent contenant de grandes sphères métalliques de flipper-modèle qui, après secousse manuelle vigoureuse de l'appareil, rupture de la graisse en sous-millimètre Fragments. Les ...

Le tissu adipeux, longtemps utilisé comme remplisseur en chirurgie reconstructive et esthétique, est récemment devenu plus populaire en médecine régénérative autrefois reconnue comme source de cellules souches mésenchymales (MSC)1. Lipoaspirates dissociéens enzymatiquement en suspensions unicellulaires donnent une fraction vasculaire stromale sans adipocyte (SVF) qui est utilisée inchangée chez le patient ou, plus généralement, est cultivée pendant plusieurs semaines dans les MSCs2.
Cependant, la dissociation enzymatique rompt les microenvironnements tissulaires, séquant les cellules régulatrices voisines des cellules régénératrices présumées qui deviennent considérablement modifiées par la culture in vitro. Pour éviter de tels artefacts expérimentaux et les altérations fonctionnelles qui en découlent, des tentatives ont été faites pour traiter le tissu adipeux à des fins thérapeutiques tout en maintenant sa configuration indigène aussi intacte que possible3,4. Notamment, la perturbation mécanique de tissu a commencé à remplacer la dissociation enzymatique. À cette fin, l'immersion complète fermé système micro-fragments lipoaspirates en sous-millimètre, sans sang et sans huile grappes tissulaires (par exemple, Lipogems) via une séquence de filtration de tamis et de marbre d'acier induit perturbation3. La transplantation autologue du tissu adipeux micro-fragmenté, utilisant cette technologie fermée de système, a été réussie dans les indications multiples, couvrant des cosmétiques, orthopédiques, proctologie et gynécologie4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
La comparaison entre le tissu adipeux micro-fragmenté humain (MAT) obtenu avec le dispositif fermé de système et Le SVF isogénique a indiqué qu'en ce qui concerne la distribution vasculaire/stromale de cellules et l'activité sécrétrice dans la culture, MAT contient plus de péricytes, qui sont présumé MSCs14, et sécrète des quantités plus élevées de facteurs de croissance et cytokines15.
Le présent article illustre la micro-fragmentation sans enzymes du tissu adipeux sous-cutané humain à l'aide d'un dispositif système fermé, et le traitement ultérieur de ces tissus adipeux micronisés pour la culture in vitro, l'immunohistochimie et l'analyse FACS, afin d'identifier les types de cellules présentes et les facteurs solubles sécrétés (Figure 1). La méthode décrite génère sans risque des organoïdes dérivés d'adipose sous-millimètres contenant des populations viables de cellules adipeuses dans une niche intacte, adaptée à d'autres applications et études.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

Au cours de la dernière décennie, les greffes de tissus adipeux ont été largement utilisées en chirurgie plastique et en orthopédie pour améliorer la réprobation et/ou la régénération des tissus. En conséquence, les techniques de récolte et de traitement des tissus adipeux humains ont évolué afin d'obtenir rapidement et efficacement de grandes quantités de tissu. Parmi ceux-ci, la technologie du système fermé représente un système novateur et facile à utiliser pour la récolte, le traitement et la réinjection de tissus adipeux raffinés en peu de temps et dans la même intervention (intraopératoire). Le tissu adipeux est recueilli par liposuccion, lavé, émulsionné, rincé et haché mécaniquement en grappes cellulaires de 0,3 à 0,8 mm. La transplantation autologue du tissu adipeux mécaniquement fragmenté a montré une efficacité remarquable dans différents traitements comme la médecine esthétique et la chirurgie, la chirurgie orthopédique et générale. La caractérisation du tissu adipeux micro-fragmenté a indiqué la présence de petits vaisseaux intacts dans les amas d'adipocyte ; par conséquent, la niche périvasculaire est laissée imperturbable. Ces grappes sont enrichies en cellules périvasculaires (c.-à-d. ancêtres de cellules souches mésenchymales (MSC) et l'analyse in vitro a montré une libération accrue de facteurs de croissance et de cytokines impliqués dans la réparation et la régénération des tissus, comparativement aux MSC dérivés enzymatiquement. Ceci suggère que le potentiel thérapeutique supérieur du tissu adipeux microfragmenté s'explique par une fréquence plus élevée des MSC sumptives et de l'activité sécrétrice améliorée. On ne sait pas si ces péricytes ajoutés contribuent directement à un facteur de croissance plus élevé et à la production de cytokine. Cette procédure cliniquement approuvée permet la transplantation de MSC présumés sans avoir besoin d'expansion et/ou de traitement enzymatique, contournant ainsi les exigences des lignes directrices sur les GMP et réduisant les coûts des thérapies cellulaires.

La dissociation mécanique des lipoaspirates manuels a entraîné la production de tissu adipeux micro-fragmenté (MAT), composé d'un agrégat d'adipocytes enveloppant un réseau microvasculaire(figure 3). L'analyse d'immunofluorescence du MAT gélatinisé et cryofixed met en évidence cette structure, montrant le réseau vasculaire marqué par le marqueur cellulaire endothélial Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1) récepteur composé principalement de petit...

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Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

Ici, nous présentons la micro-fragmentation sans enzyme s'adipeux humain à l'aide d'un dispositif système fermé. Cette nouvelle méthode permet l'obtention de grappes de tissus adipeux sous-millimétriques adaptées à la transplantation in vivo, à la culture in vitro et à l'isolement et à la caractérisation des cellules.

Micro-fragmentation humaine des tissus adipeux pour le phénotypage cellulaire et la caractérisation du secretome

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

En utilisant ce système, nous pouvons recueillir les grappes sous-millimétriques de tissu adipeux humain, dans lequel l’ensemble du microenvironnement des cellules régénératrices est intact. L’ensemble du système microvasculaire est également intact, et nous pouvons donc utiliser ce genre de micro-organes pour la transplantation in vivo pour la culture in vitro et pour l’isolement cellulaire pour une caractérisation plus complète. La principale raison d’être de l’utilisation du système dans le laboratoire de recherche est que le processus est totalement sans enzymes, et donc il permet le traitement rapide et efficace des tissus adipeux humains tout en maintenant une micro-architecture et ce sera la microvasculature du tissu totalement intacte.Et donc nous pouvons étudier directement un produit de thérapie cellulaire qui s’est avéré déjà très utile dans la clinique. Cette technologie système fermé est une technique facile à utiliser pour la récolte, le traitement et la réin injection de tissu adipeux raffiné intra-opératoire, et peut être appliquée avec succès dans les cosmétiques orthopédiques, proctologie et aussi gynécologie. Cette méthode permet une étude plus approfondie de l’impact de la graisse dans la régénération des tissus.La procédure sera démontrée par Bianca Vezzani, boursier postdoctoral et par Mario Gomez-Salazar, qui est doctorant. En travaillant dans des conditions aseptiques dans les 16 heures suivant la récolte, placez l’échantillon d’abdominoplastie sur un tissu chirurgical avec la peau orientée vers le haut. Utilisez une canule d’infiltration de tissu jetable pour injecter 50 à 100 millilitres de 37 degrés Celsius 0,9% solution de chlorure de sodium dans le tissu adipeux sous-cutané.Connectez une seringue de verrouillage Luer de 10 millilitres à une canule de liposuccion jetable et saisissez l’échantillon dans la région cutanée près d’un bord de l’échantillon, introduisez soigneusement la canule dans le tissu adipeux. Une fois que la canule est à l’intérieur du tissu, extraire le piston et déplacer la canule radialement dans l’échantillon de tissu adipeux. Il est important de manipuler le tissu adipeux fermement pendant la lipo-aspiration.Si pas assez de graisse est recueillie, envisager d’effectuer une injection saline supplémentaire. Lorsque la seringue est pleine de lipo-aspirate, retirez soigneusement la canule du tissu et remplacez la seringue complète par une nouvelle seringue vide jusqu’à ce qu’un total de 60 millilitres d’aspirate ait été récolté. Pour la micro-fragmentation du lipo-aspirate, retirez l’appareil de l’emballage et vérifiez que l’unité principale est connectée au sac à déchets.Placez le sac de collecte des déchets sur le sol et assurez-vous que les vannes sont fixées aux bouchons de l’unité de traitement. Percer le port de raccordement du sac pour connecter la pointe terminale de la ligne d’entrée dans le sac salin et positionner le sac salin plus haut que l’unité de traitement. Vérifiez que les cinq pinces reliées aux tubes des circuits sont ouvertes, placez l’unité de traitement en position verticale, permettez à la solution saline de remplir l’unité de traitement et confirmez que le flux atteint le sac à déchets.Secouez l’unité de traitement pour enlever les bulles d’air et placez l’appareil en position verticale avec le bouchon bleu orienté vers le haut. Fermez la pince à côté de la ligne d’entrée et connectez une seringue de lipo-aspirate à la valve auto-occluding du bouchon d’entrée bleu pour commencer à injecter le lipo-aspirate. En gardant l’unité de traitement verticale, poussez lentement vers le bas sur le piston de seringue jusqu’à ce que tout le lipo-aspirate ait été transféré à l’unité.Lorsque tout le lipo-aspirate a été injecté, ouvrez la pince d’entrée pour restaurer le flux salin et secouez vigoureusement l’unité de traitement pendant au moins deux minutes, en vérifiant régulièrement le flux de solution saline dans le sac à déchets. Lorsque la solution saline de l’unité de traitement devient transparente, placez l’appareil avec le capuchon gris vers le haut et fermez les pinces situées sur le drain près des bouchons bleus et gris. Le tissu traité flottera au sommet.Ensuite, remplissez une seringue de verrouillage Luer de 10 millilitres avec une solution saline et connectez la seringue à la vanne de chargement du bouchon bleu. Connectez une seringue vide de verrouillage Luer de 10 millilitres avec le piston complètement inséré à la valve du capuchon gris. Injectez fermement la solution saline dans l’unité de traitement à partir du bouchon bleu, en vérifiant que la seringue reliée à la valve grise est donc remplie de tissu traité.Lorsque toute la solution saline a été injectée, retirez soigneusement les deux seringues et répétez l’infusion saline jusqu’à ce que tous les tissus traités aient été prélevés. À la fin du traitement, retirez toutes les seringues, fermez toutes les pinces, détachez le sac salin et jetez l’appareil selon les protocoles locaux. Lorsque tous les tissus traités ont été recueillis, transférer le tissu adipeux micro-fragmenté dans un récipient stérile, et ajouter un volume égal de milieu de digestion au récipient.Placer le récipient scellé dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius, réglé à 120 rotations par minute pendant 45 minutes, en arrêtant la digestion avec un volume égal de solution de blocage à la fin de l’incubation. Filtrer séquentiellement l’échantillon, d’abord à travers une passoire à cellules de 100 micromètres suivie d’une filtration à travers une passoire à cellules de 70 micromètres et centrifugeuse de la suspension filtrée pendant cinq minutes à 200 fois g. Nous suspendons la pastille dans environ 5 millilitres de tampon de lyse érythrocyte pendant 15 minutes à température ambiante.Arrêtez la lyse avec un volume égal de solution de blocage et filtrez la solution à travers une passoire à cellules de 40 micromètres. Ensuite, recueillir les cellules tissulaires adipeuses micro-fragmentées par centrifugation et nous suspendons la pastille dans la solution de blocage frais avec floure-mélange pour le comptage. Après la dissociation et la coloration des anticorps, les cellules adipeuses micro fragmentées peuvent être transportées au cytomètre d’écoulement pour analyse cellulaire et/ou tri.La dissociation mécanique des lipo-aspirates manuels entraîne la production de tissu adipeux micro-fragmenté qui se compose d’un agrégat d’adipocytes enveloppant un réseau microvasculaire. L’analyse d’immunofluorescence de la gélatine incorporée dans le tissu adipeux micro-fragmenté cryofixed accentue la structure, montrant le réseau vasculaire marqué par le marqueur cellulaire endothélial Ulex Europaeus Agglutinin 1 récepteur et se composant principalement de petits vaisseaux capillaires-comme. Notamment, les péricytes exprimant l’antigène neuronal-glial 2 ou la bêta de récepteur de facteur de croissance plaquettète-dérivé sont normalement distribués, ensheathing cellules endothéliales.En excluant les cellules hématopoïétiques positives CD31 et CD45 positives, la présence de péricytes négatifs CD34 positifs CD34 et de cellules adventitielles négatives et CD34 positives CD144 peut être identifiée dans le MAT. La lipo-aspiration manuelle est une partie critique de la procédure et doit être effectuée dans des conditions stériles au plus 16 heures après l’abdominoplastie. Le tissu adipeux micro fragmenté peut être davantage traité par coloration immunohistochimique, culture in vitro ou analyse sécrétome pour obtenir un aperçu plus approfondi de la biologie des tissus adipeux.Cette technique permet d’étudier divers tissus dans leur arrangement naturel, indigène et tridimensionnel comme une sorte de petits organoïdes, qui sont assez petits pour être transplantés chez la souris ou pour être maintenus dans la culture à long terme. Et nous utilisons ce système principalement pour approcher expérimentalement les différents microenvironnements spécifiques aux organes. Nos donneurs de tissus adipeux ne sont pas connus comme porteurs d’infections transmissibles.Toutefois, en l’absence de tout autre dépistage, tous les tissus humains devraient être considérés comme potentiellement contaminés et manipulés en conséquence.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Co-actine sédimentation Assay; pour l&#39;analyse des Binding Protein à F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Recherche

Biologie

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear : Un tissu méthode de compensation pour l’imagerie en trois dimensions du tissu adipeux

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisation de la Structure du tissu adipeux blanc 3D utilisant entier-Montez la souillure

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 enrichit le rendement des mélanocytes humains à partir de tissus cutanés adultes

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Exploration de la structure des tissus adipeux par compensation du méthylsalicylate et imagerie 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolement, caractérisation et application thérapeutique de vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines en culture

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolement et identification de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de rats Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...