Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei Claire Cryer und Fiona Rossi von der Universität Edinburgh für ihre fachkundige Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Wir möchten auch dem Personal des Murrayfield-Krankenhauses danken, das durch die Bereitstellung von Gewebeproben dazu beigetragen hat.
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der British Heart Foundation und Lipogems unterstützt, die Fettgewebe-Verarbeitungskits lieferten. Menschliche Gewebeproben für Erwachsene wurden mit vollständiger ethischer Genehmigung der South East Scotland Research Ethics Committee beschafft (Referenz: 16/SS/0103).

Die Ethikkommission für die Verwendung von menschlichem Gewebe in dieser Forschung wurde von der South East Scotland Research Ethics Committee (Referenz: 16/SS/0103) erteilt.
1. Subkutane Abdominal Adipose Gewebesammlung
HINWEIS: Alle im manuellen Lipo-Aspirationsverfahren verwendeten Instrumente werden vom Hersteller des Mikrofragmentierungsgeräts zur Verfügung gestellt.
<ol><li>Bewahren Sie die Sterilität für alle Flüssigkeiten, Behälter,...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

Dieses Papier beschreibt die physikalische Fraktionierung von menschlichem Fettgewebe in kleinen Clustern, die normale Fettgewebe-Mikroanatomie zeigen, mit einem geschlossenen Systemgerät.
Manuell angesaugte menschliches subkutanes Fettgewebe und eine Saline-Lösung werden in einen transparenten Kunststoffzylinder geladen, der große metallische Kugeln im Flipperstil enthält, die beim kräftigen manuellen Schütteln des Geräts das Fett in sub-Millimeter zerbrechen. Fragmente. Angeschlossene...

Adipose Gewebe, lange als Füllstoff in der rekonstruktiven und kosmetischen Chirurgie verwendet, ist in letzter Zeit beliebter in der regenerativen Medizin einmal als Quelle für mesenchymale Stammzellen (MSCs)anerkannt1 . Lipoaspiraturen, die enzymatisch in einzellige Suspensionen dissoziiert sind, ergeben eine adipozytenfreie stromale Gefäßfraktion (SVF), die unverändert beim Patienten verwendet wird oder, häufiger, für mehrere Wochen in MSCs2kultiviert wird.
Die Enzymdissoziation bricht jedoch die Gewebemikroumgebungen und schützt benachbarte regulatorische Zellen von mutmaßlichen regenerativen Zellen ab, die durch die In-vitro-Kultur erheblich verändert werden. Um solche experimentellen Artefakte und daraus resultierenden funktionellen Veränderungen zu vermeiden, wurden Versuche unternommen, Fettgewebe für den therapeutischen Gebrauch zu verarbeiten und gleichzeitig seine native Konfiguration so intakt wie möglich zu halten3,4. Insbesondere die mechanische Gewebestörung hat begonnen, die enzymatische Dissoziation zu ersetzen. Zu diesem Zweck wird das vollständige Tauchsystem Mikrofragmente Lipoaspiraten in submillimeter-, blut- und ölfreie Gewebehaufen (z.B. Lipogems) über eine Sequenz von Siebfiltration und Stahlmarmor induzierte Störung3. Die autologe Transplantation von mikrofragmentiertem Fettgewebe mit dieser geschlossenen Systemtechnologie war in mehreren Indikationen erfolgreich, die Kosmetika, Orthopädie, Proktologie und Gynäkologie umfassen4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Der Vergleich zwischen menschlichem mikrofragmentiertem Fettgewebe (MAT), das mit dem geschlossenen Systemgerät gewonnen wurde, und isogener SVF ergab, dass MAT in Bezug auf die vaskuläre/stromale Zellverteilung und die sekretorische Aktivität in der Kultur mehr Pericyte enthält, die mutmaßliche MSCs14und sezerniert höhere Mengen an Wachstumsfaktoren und Zytokinen15.
Der vorliegende Artikel veranschaulicht die enzymfreie Mikrofragmentierung des menschlichen subkutanen Fettgewebes mit einem geschlossenen Systemgerät und die Weiterverarbeitung solcher mikronisierten Fettgewebe für In-vitro-Kultur, Immunhistochemie und FACS-Analyse, um die vorhandenen Zelltypen und die sezernierten löslichen Faktoren zu identifizieren (Abbildung 1). Die beschriebene Methode erzeugt sicher adipose abgeleitete Submillimeter-Organoide, die lebensfähige Fettgewebezellpopulationen in einer intakten Nische enthalten, die für weitere Anwendungen und Studien geeignet ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

In den letzten zehn Jahren wurden Fettgewebetransplantationen häufig in der plastischen Chirurgie und Orthopädie eingesetzt, um die Gewebeaufreicherung und/oder Regeneration zu verbessern. Dementsprechend haben sich Techniken zur Ernte und Verarbeitung von menschlichem Fettgewebe entwickelt, um schnell und effizient große Mengen an Gewebe zu erhalten. Unter diesen stellt die geschlossene Systemtechnologie ein innovatives und einfach zu bedienendes System zur Ernte, Verarbeitung und Reinjektion von raffiniertem Fettgewebe in kurzer Zeit und in der gleichen Intervention (intraoperativ) dar. Adiposegewebe wird durch Fettabsaugung, gewaschen, emulgiert, gespült und mechanisch in Zellcluster von 0,3 bis 0,8 mm gehackt. Indikationen wie ästhetische Medizin und Chirurgie, orthopädische und allgemeine Chirurgie. Die Charakterisierung von mikrofragmentiertem Fettgewebe ergab das Vorhandensein intakter kleiner Gefäße in den Adipozyten-Clustern; daher bleibt die perivaskuläre Nische ungestört. Diese Cluster sind in perivaskulären Zellen angereichert (d. h. mesenchymale Stammzell (MSC) Vorfahren) und In-vitro-Analysen zeigten eine erhöhte Freisetzung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen, die an der Gewebereparatur und -regeneration beteiligt sind, im Vergleich zu enzymatisch abgeleiteten MSCs. Dies deutet darauf hin, dass das überlegene therapeutische Potenzial des mikrofragmentierten Fettgewebes durch eine höhere Häufigkeit von mutmaßlichen MSCs und verbesserte sekretore Aktivität erklärt wird. Ob diese zusätzlichen Pericyte direkt zu einem höheren Wachstumsfaktor und zur Zytokinproduktion beitragen, ist nicht bekannt. Dieses klinisch zugelassene Verfahren ermöglicht die Transplantation mutmaßlicher MSCs ohne Erweiterung und/oder enzymatische Behandlung, wodurch die Anforderungen der GMP-Richtlinien umgangen werden und die Kosten für zellbasierte Therapien gesenkt werden.

Die mechanische Dissoziation manueller Lipoaspiraten führte zur Herstellung von mikrofragmentiertem Fettgewebe (MAT), das aus einem Aggregat von Adipozyten besteht, die ein mikrovaskuläres Netzwerk umhüllen (Abbildung 3). Die Immunfluoreszenzanalyse von gelatine- und kryofixiertem MAT hebt diese Struktur hervor und zeigt das Gefäßnetzwerk, das durch den endothelialen Zellmarker Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1)-Rezeptor gekennzeichnet ist, der hauptsä...

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Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

Hier präsentieren wir menschliche Fettgewebe enzymfreie Mikrofragmentierung mit einem geschlossenen Systemgerät. Diese neue Methode ermöglicht die Gewinnung von Submillimeter-Clustern von Fettgewebe, die für In-vivo-Transplantationen, In-vitro-Kulturen und weitere Zellisolation und -charakterisierung geeignet sind.

Human Adipose Tissue Mikrofragmentierung für Zell-Phänotypisierung und Secretome-Charakterisierung

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Mit diesem System können wir die Submillimeter-Cluster des menschlichen Fettgewebes sammeln, in denen die gesamte Mikroumgebung von regenerativen Zellen intakt ist. Das gesamte mikrovaskuläre System ist ebenfalls intakt, und so können wir diese Art von Mikroorganen für In-vivo-Transplantationen zur In-vitro-Kultur und zur Zellisolation zur weiteren Charakterisierung nutzen. Die Hauptbegründung für den Einsatz des Systems im Forschungslabor ist, dass der Prozess völlig enzymfrei ist, und so ermöglicht es die schnelle und effiziente Verarbeitung von menschlichem Fettgewebe unter Beibehaltung einer Mikroarchitektur und es wird die Mikrovaskulatur des Gewebes völlig intakt sein.Und so können wir direkt ein Zelltherapieprodukt studieren, das sich in der Klinik bereits als sehr nützlich erwiesen hat. Diese geschlossene Systemtechnologie ist eine einfach zu bedienende Technik zur intraoperativen Ernte, Verarbeitung und Reinjektion von raffiniertem Fettgewebe und kann erfolgreich in der kosmetischen Orthopädie, Proktologie und auch gynäkologischen Anwendung gebracht werden. Diese Methode ermöglicht eine weitere Untersuchung der Auswirkungen von Fett bei der Geweberegeneration.Das Verfahren wird von Bianca Vezzani, einer Postdoktorandin, und von Mario Gomez-Salazar, einem Doktoranden, demonstriert. Arbeiten Sie unter aseptischen Bedingungen innerhalb von 16 Stunden nach der Ernte, legen Sie die Abdominoplastikprobe auf ein chirurgisches Tuch mit der Haut nach oben. Verwenden Sie eine Einweg-Gewebeinfiltrationskanüle, um 50 bis 100 Milliliter 37 Grad Celsius 0,9% Natriumchloridlösung in das subkutane Fettgewebe zu injizieren.Verbinden Sie eine 10 Milliliter Luer Lock Spritze mit einer Einweg-Liposuktionskanüle und greifen Sie die Probe an der Hautregion in der Nähe eines Rands der Probe, bringen Sie die Kanüle vorsichtig in das Fettgewebe ein. Sobald sich die Kanüle im Gewebe befindet, extrahieren Sie den Kolben und bewegen Sie die Kanüle radial innerhalb der Fettgewebeprobe. Es ist wichtig, das Fettgewebe während der Lipo-Aspiration fest zu behandeln.Wenn nicht genug Fett gesammelt wird, erwägen Sie eine zusätzliche Saline-Injektion. Wenn die Spritze voll von Lipo-Aspirat ist, entfernen Sie vorsichtig die Kanüle aus dem Gewebe und ersetzen Sie die volle Spritze durch eine neue leere Spritze, bis insgesamt 60 Milliliter Aspirat geerntet sind. Entfernen Sie zur Mikrofragmentierung des Lipo-Aspirats das Gerät aus der Verpackung und überprüfen Sie, ob die Haupteinheit mit dem Abfallbeutel verbunden ist.Legen Sie den Abfallsammelbeutel auf den Boden, und stellen Sie sicher, dass die Ventile an den Verschlüssen der Prozesseinheit befestigt sind. Pierce den Sackanschluss, um die Klemmspitze der Eingangsleitung in den Saline-Beutel zu verbinden und den Saline-Beutel höher als die Verarbeitungseinheit zu positionieren. Stellen Sie sicher, dass alle fünf Klemmen, die mit den Rohren der Schaltkreise verbunden sind, geöffnet sind, platzieren Sie die Verarbeitungseinheit in einer vertikalen Position, lassen Sie die Saline-Lösung die Verarbeitungseinheit befüllen und bestätigen Sie, dass der Durchfluss den Abfallbeutel erreicht.Schütteln Sie die Verarbeitungseinheit, um Luftblasen zu entfernen, und platzieren Sie das Gerät in einer vertikalen Position mit der blauen Kappe nach oben. Schließen Sie die Klemme neben der Eingangsleitung und schließen Sie eine Spritze mit Lipo-Aspirat an das selbstverschließende Ventil der blauen Eingangskappe, um mit der Injektion des Lipo-Aspirats zu beginnen. Halten Sie die Verarbeitungseinheit vertikal, drücken Sie langsam auf den Spritzenkolben, bis das gesamte Lipo-Aspirat auf das Gerät übertragen wurde.Wenn das gesamte Lipo-Aspirat injiziert wurde, öffnen Sie die Eingangsklemme, um den Saline-Fluss wiederherzustellen, und schütteln Sie die Verarbeitungseinheit mindestens zwei Minuten lang kräftig, und überprüfen Sie regelmäßig den Schaummittellösungsfluss in den Abfallbeutel. Wenn die Saline-Lösung in der Verarbeitungseinheit transparent wird, legen Sie das Gerät mit der grauen Kappe nach oben und schließen Sie die Klemmen, die sich am Abfluss in der Nähe der blauen und grauen Kappen befinden. Das verarbeitete Gewebe schwebt oben.Als nächstes füllen Sie eine 10 Milliliter Luer-Sperrspritze mit Einer saline Lösung und schließen Sie die Spritze an das Ladeventil der blauen Kappe an. Schließen Sie eine leere 10 Milliliter Luer-Sperrspritze mit vollständig an das Ventil der grauen Kappe eingesetzten Kolben an. Die Saline aus der blauen Kappe fest in die Verarbeitungseinheit einspritzen und überprüfen, ob die mit dem grauen Ventil verbundene Spritze folglich mit dem verarbeiteten Gewebe gefüllt wird.Wenn die gesamte Saline injiziert wurde, entfernen Sie vorsichtig beide Spritzen und wiederholen Sie die Saline-Infusion, bis das gesamte verarbeitete Gewebe gesammelt wurde. Am Ende der Verarbeitung alle Spritzen entfernen, alle Klemmen schließen, den Salinebeutel lösen und das Gerät nach lokalen Protokollen entsorgen. Wenn das gesamte verarbeitete Gewebe gesammelt wurde, übertragen Sie das mikrofragmentierte Fettgewebe in einen sterilen Behälter und fügen Sie dem Behälter ein gleiches Volumen an Verdauungsmedium hinzu.Legen Sie den versiegelten Behälter in ein 37 Grad Celsius schüttelendes Wasserbad, das 45 Minuten lang auf 120 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist, wodurch die Verdauung mit einem gleichen Volumen an Blockierlösung am Ende der Inkubation gestoppt wird. Sequentiell die Probe filtern, zunächst durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb, gefolgt von Filtration durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb und Zentrifuge die gefilterte Suspension für fünf Minuten bei 200 mal g. Wir setzen das Pellet in ca. 5 Milliliter Erythrozytenlysepuffer für 15 Minuten bei Raumtemperatur aus.Stoppen Sie die Lyse mit einem gleichen Volumen der Blockierlösung und filtern Sie die Lösung durch ein 40 Mikrometer Zellsieb. Dann sammeln Sie die mikrofragmentierten Fettgewebezellen durch Zentrifugation und wir setzen das Pellet in frischer Blocklösung mit Mehl-Mischung zum Zählen aus. Nach Dissoziation und Antikörperfärbung können mikrofragmentierte Fettzellen zur Zellanalyse und/oder Sortierung zum Durchflusszytometer gebracht werden.Die mechanische Dissoziation manueller Lipo-Aspirationen führt zur Herstellung von mikrofragmentiertem Fettgewebe, das aus einem Aggregat von Adipozyten besteht, die ein mikrovaskuläres Netzwerk umhüllen. Die Immunfluoreszenzanalyse von Gelatine, die in kryokoniertes mikrofragmentiertes Fettgewebe eingebettet ist, hebt die Struktur hervor und zeigt das Gefäßnetzwerk, das durch den Endothelzellmarker Ulex Europaeus Agglutinin 1-Rezeptor gekennzeichnet ist und hauptsächlich aus kleinen kapillarartigen Gefäßen besteht. Insbesondere pericyte, die neuron-gliale Antigen 2 oder Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor Beta exemiten, sind normal verteilt, Ensheathing Endothelzellen.Durch den Ausschluss von CD31-positiven endotheliale und CD45-positiven hämatopoetischen Zellen kann das Vorhandensein von CD146-positiven CD34-negativen Pericyten und CD146-negativen und CD34-positiven adventlichen Zellen innerhalb des MAT identifiziert werden. Manuelle Lipo-Aspiration ist ein kritischer Teil des Verfahrens und muss unter sterilen Bedingungen nicht mehr als 16 Stunden nach der Abdominoplastik durchgeführt werden. Mikrofragmentiertes Fettgewebe kann durch immunhistochemische Färbung, In-vitro-Kultur oder Sekrelomanalyse weiterverarbeitet werden, um einen tieferen Einblick in die Fettgewebebiologie zu erhalten.Diese Technik ermöglicht das Studium verschiedener Gewebe in ihrer natürlichen, nativen, dreidimensionalen Anordnung als eine Art kleine Organoide, die klein genug sind, um in Mäuse ngetinnen oder in der Langzeitkultur gehalten zu werden. Und wir nutzen dieses System hauptsächlich, um die verschiedenen organspezifischen Mikroumgebungen experimentell anzusprechen. Unsere Fettgewebespender sind nicht als Träger übertragbarer Infektionen bekannt.In Ermangelung eines weiteren Screenings sollten jedoch alle menschlichen Gewebe als potenziell kontaminiert betrachtet und entsprechend behandelt werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisierung von 3D weißen Fettgewebe Schachts ganz-Mount Färbung

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Bereichert die Ausbeute menschlicher Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Untersuchung der Adipose-Gewebestruktur durch Methylsalicylat-Clearing und 3D-Bildgebung

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolierung, Charakterisierung und therapeutische Anwendung extrazellulärer Vesikel aus kultivierten humanen mesenchymalen Stammzellen

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...