Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

המחברים רוצים להודות קלייר Cryer ו פיונה רוסי באוניברסיטת אדינבורו על הסיוע המומחים שלהם עם הזרימה cy, לנסות. אנו גם רוצים להודות לאנשי בית החולים Murrayfield שתרמו על ידי מתן דגימות רקמה.
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של קרן הלב הבריטית וליפואבני חן, אשר סיפק ערכות עיבוד רקמה ברקמת אדיפוז. דגימות רקמה של מבוגרים אנושיים הושגו עם הרשאת אתיקה מלאה של ועדת האתיקה של דרום מזרח סקוטלנד מחקר (התייחסות: 16/SS/0103).

אישור אתי לשימוש ברקמות האדם במחקר זה התקבל מתוך ועדת האתיקה של דרום מזרח סקוטלנד מחקר (התייחסות: 16/SS/0103).
1. אוסף רקמות הבטן התת עורית
הערה: כל המכשירים המשמשים את הנוהל הידני שאיבת שומן מסופקים על ידי היצרן של המכשיר מיקרו פיצול.
<ol><li>שמרו על עקרות עב?...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

נייר זה מתאר את המהומה הפיזית, באמצעות התקן מערכת סגור, של רקמת השומן האנושית לאשכולות קטנים המציגים מיקרואנטומיה רגילה של רקמת השומן.
באופן ידני מרעיף רקמה תת עורית ותמיסת מלח מלוחים לתוך גליל פלסטיק שקוף המכיל כדורים גדולים בסגנון פינבול מתכתי כי, על ניעור נמרץ של המכשיר, ...

ברקמת אדיפוז, שימוש ממושך כמילוי בניתוחים קוסמטיים, הפכה לאחרונה לפופולרית יותר ברפואת ההתחדשות המוכרת כמקור לתאי גזע mesenchymal (MSCs)1. ליפופוטים הנתק אנזימטי לתוך תא יחיד השעיות בהספקויות התשואה של מסטרומה ללא שימוש מרובה וסקולרית (SVF) המשמשת בלתי מחולקת במטופל או, בדרך כלל, היא תרבותית במשך מספר שבועות לתוך MSCs2.
עם זאת, דיסוציאציה האנזים מרוכל את מיקרוסביבות הרקמה, secluding תאים הרגולציה השכנה מתאי משובי שוערת הפכו שונה במידה ניכרת על ידי תרבות מבחנה. כדי למנוע ממצאים ניסיוניים כאלה ושינויים פונקציונליים הסוגר, נעשו ניסיונות לעבד את רקמת האדיפוז לשימוש טיפולית תוך שמירה על התצורה הטבעית שלה בשלמותה ככל האפשר3,4. בעיקר, הפרעה ברקמה המכנית החלה להחליף את הדיסוציאציה האנזימטית. למטרה זו, מערכת סגורה טבילה מלאה מיקרו שברי ליפוף לתוך תת מילימטר, דם ושמן אשכולות רקמות (g., ליפופיטים) באמצעות רצף של סינון מסננת ושיבוש פלדה שיש מושרה3. השתלת אוטוולוגי של רקמת אדיפוז מקוטעת, באמצעות טכנולוגיית מערכת סגורה זו, הצליחה במספר רב של סימנים, מוצרי קוסמטיקה מורחבים, אורטופדיה, פרוטולוגיה ו גינקולוגיה4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
השוואה בין מיקרו-רקמת השומן האנושי מפוצל (MAT) המתקבל עם התקן מערכת סגורה ואיזוגניים SVF חשף כי ביחס כלי דם/סטרומה הפצת תאים ופעילות הפרשה בתרבות, MAT מכיל יותר קרום הלב, אשר שוערת MSCs14, ו מפריש כמויות גבוהות יותר של גורמי צמיחה ציטוקינים15.
המאמר הנוכחי ממחיש את הפיצול נטול האנזימים של רקמת השומן התת עורית האנושית באמצעות מכשיר מערכת סגור, והעיבוד הנוסף של רקמת השומן המיקרובית הזאת לתרבות החוץ-גופית, ניתוח האימונוהיסטוכימיה ו-FACS, על מנת לזהות את סוגי התאים הקיימים ואת הגורמים המוסיסים (איור 1). השיטה המתוארת יוצרת באופן בטוח שיטת האדיפוז משני מילימטר המכיל אוכלוסיות של תאים בעלי שומן קיימא בנישה שלמה, המתאימה ליישומים ולמחקרים נוספים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

במהלך העשור האחרון, השתלות רקמה באמצעות שימוש נרחב בכירורגיה פלסטית ובאורתופדיה כדי לשפר את הרקמה החוזרת של רקמות ו/או התחדשות. לפיכך, טכניקות לקציר ועיבוד של רקמת השומן האנושית התפתחו כדי להשיג במהירות וביעילות כמויות גדולות של רקמות. בין השאר, טכנולוגיית המערכת הסגורה מייצגת מערכת חדשנית וקלה לשימוש כדי לקצור, לעבד ולהזריק מחדש את רקמת השומן המעודנת בזמן קצר ובאותה התערבות (בשיתוף פעולה). רקמת אדיפוז נאסף על ידי שאיבת שומן, שטף, אמולסיה, שטיפת ובטחון מכני לתוך אשכולות תאים של 0.3 כדי 0.8 מ"מ. השתלת אוטוולוגי של רקמת אדיפוז בצורה מכנית הראתה יעילות יוצאת דופן בטיפולי שונות אינדיקציות כגון רפואה אסתטית וניתוח, אורתופדיה וניתוח כללי. אפיון מיקרו-רקמה מפוצלת חשף את נוכחותם של כלי קטן ללא פגע בתוך אשכולות האדיפוציטים; ולכן, הנישה הפריסקולרית נותרה לא מודאג. אשכולות אלה מועשרים בתאי וסקולריים (כלומר, תא גזע mesenchymal (MSC) אבות) ובניתוח חוץ גופית הראה שחרור מוגבר של גורמי גדילה וציטוקינים מעורבים תיקון רקמות והתחדשות, לעומת MSCs נגזר אנזימטי. הדבר מצביע על כך שהפוטנציאל הטיפולי המעולה של רקמת השומן המפוצלים מוסבר בתדירות גבוהה יותר של שוערת MSCs ופעילות הפרשה המשופרת. בין אם הוספת קרום הלב הוסיף במישרין לגורם גדילה גבוה יותר וייצור ציטוקין אינו ידוע. זו הליך מאושר קליני מאפשר השתלת שוערת MSCs ללא צורך התרחבות ו/או טיפול אנזימטי, ובכך לעקוף את הדרישות של הנחיות GMP, וצמצום העלויות עבור טיפולים מבוססי תאים.

דיסוציאציה מכנית של ליפותים ידנית הביא לייצור של מיקרו מפוצל רקמת אדיפוז (MAT), המורכב של צבירה של adipocytes עוטף רשת microvascular (איור 3). Immunofluorescence ניתוח של ג'לטין מוטבע ו קריוקבוע MAT מדגיש מבנה זה, מראה את הרשת כלי הדם מסומן על ידי סמן תא אנדותל Ulex europaeus 1 (ULEX-1) קולטן ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

. בעזרת מכשיר מערכת סגור שיטה חדשה זו מאפשרת בידור של אשכולות תת-מילימטר של רקמת האדיפוז המתאימים להשתלה vivo, בתרבות החוץ-גופית ובבידוד תאים נוסף ואפיון.

מיקרו-הפיצול האנושי של רקמת אדיפוז לפנוטיפים של תאים ואפיון

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

באמצעות מערכת זו, אנו יכולים לאסוף את אשכולות תת מילימטר של רקמת שומן אנושית, שבו כל microenvironment של תאים רגנרטיביים הוא שלם. המערכת המיקרו-וסקולרית כולה גם היא שלמה, ולכן אנו יכולים להשתמש באיברים זעירים מסוג זה להשתלת in-vivo לתרבות במבחנה ולבידוד תאים לאפיון נוסף. הרציונל העיקרי לשימוש במערכת במעבדת המחקר הוא כי התהליך הוא נטול אנזימים לחלוטין, ולכן הוא מאפשר עיבוד מהיר ויעיל של רקמת שומן אנושית תוך שמירה על מיקרו ארכיטקטורה וזה יהיה microvasculature של הרקמה שלם לחלוטין.וכך אנו יכולים ללמוד ישירות מוצר טיפול בתא אשר הוכיח כבר מאוד שימושי במרפאה. טכנולוגיית מערכת סגורה זו היא טכניקה קלה לשימוש עבור קציר, עיבוד והזרקה מחדש של רקמת שומן מזוקקת תוך ניתוחית, והוא יכול להיות מיושם בהצלחה אורתופדיה קוסמטיקה, פרוקטולוגיה וגם גינקולוגיה. שיטה זו מאפשרת מחקר נוסף של ההשפעה של שומן התחדשות רקמות.ההליך יוצג על ידי ביאנקה Vezzani, עמית פוסט דוקטורט ועל ידי מריו גומז-סלזר, שהוא סטודנט לדוקטורט. עבודה תחת תנאים אספטיים בתוך 16 שעות של קציר, מניחים את מדגם abdominoplasty על גבי מטלית כירורגית עם העור פונה כלפי מעלה. השתמש ב cannula חדירת רקמה חד פעמית להזריק 50 עד 100 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס 0.9% פתרון נתרן כלורי לתוך רקמת השומן התת עורית.חבר מזרק מנעול לולר 10 מיליליטר לתוך cannula שאיבת שומן חד פעמית לתפוס את המדגם באזור עורי ליד קצה של המדגם, בזהירות להציג את העצם לתוך רקמת השומן. לאחר cannula הוא בתוך הרקמה, לחלץ את הבוכנה ולהזיז את cannula באופן רדינות בתוך מדגם רקמת השומן. חשוב לטפל ברקמת השומן בחוזקה במהלך שאיפת הליפו.אם לא נאסף מספיק שומן, שקול לבצע הזרקת מלוחים נוספת. כאשר המזרק מלא שאיבת שומן, להסיר בזהירות את cannula מן הרקמה ולהחליף את המזרק המלא עם מזרק ריק חדש עד סך של 60 מיליליטר של שאפתן נקצר. למיקרו-פיצול של שאיבת השפתיים, מוציאים את המכשיר מהחבילה ומוודאים שהיחידה הראשית מחוברת לשקית הפסולת.מניחים את שקית איסוף הפסולת על הקרקע, ולוודא כי השסתומים מאובטחים מכסות יחידת תהליך. פירס את יציאת חיבור התיק כדי לחבר את ספייק המסוף של קו הקלט לתוך שקית מלוחים ולמקם את שקית מלוחים גבוה יותר מאשר יחידת העיבוד. ודא שכל חמשת המהדקים המחוברים לצינורות המעגלים פתוחים, מקם את יחידת העיבוד במצב אנכי, אפשר לתמיסת מלח למלא את יחידת העיבוד, ואשר שהזרימה מגיעה לשקית הפסולת.לנער את יחידת העיבוד כדי להסיר את כל בועות האוויר ולמקם את היחידה במצב אנכי עם הכובע הכחול פונה כלפי מעלה. סגור את המהדק ליד קו הקלט וחבר מזרק של שאיבת שומן לשסתום occluding עצמית של מכסה הקלט הכחול כדי להתחיל להזריק את שאיבת שומן. שמירה על יחידת העיבוד אנכית, לאט לדחוף למטה על בוכנה מזרק עד כל שאיבת שומן הועבר ליחידה.כאשר כל שאיבת השפתיים הוזרקה, פתח את מהדק הקלט כדי לשחזר את זרימת התמיסת מלח ולנער במרץ את יחידת העיבוד במשך שתי דקות לפחות, בודק בקביעות את זרימת תמיסת מלח לתוך שקית הפסולת. כאשר תמיסת מלח ביחידת העיבוד הופכת לשקופה, מקם את היחידה עם הכובע האפור כלפי מעלה וסגור את המהדקים הממוקמים על הניקוז ליד הכובעים הכחולים והאפורים. הרקמה המעובדת תצוף למעלה.לאחר מכן, מלא מזרק מנעול לולר 10 מיליליטר עם תמיסת מלח, ולחבר את המזרק לשסתום הטעינה של הכובע הכחול. חבר מזרק ריק 10 מיליליטר לולר לוקס עם הבוכנה מוכנס לחלוטין לשסתום של הכובע האפור. בתקיפות להזריק את מלוחים לתוך יחידת העיבוד מן הכובע הכחול, בודק כי המזרק מחובר שסתום אפור הוא כתוצאה מכך מתמלא עם הרקמה המעובדת.כאשר כל מלוחים הוזרק, להסיר בזהירות את שני המזרקים ולחזור על עירוי מלוחים עד כל הרקמה המעובדת נאסף. בסוף העיבוד, להסיר את כל המזרקים, לסגור את כל המהדקים, לנתק את שקית מלוחים, ולהיפטר המכשיר על פי פרוטוקולים מקומיים. כאשר כל הרקמה המעובדת נאספה, מעבירים את רקמת השומן המיקרו-מקוטעת למיכל סטרילי ומוסיפים נפח שווה של אמצעי עיכול למיכל.מניחים את המיכל האטום באמבט מים רועד ב-37 מעלות, מוגדרים ל-120 סיבובים בדקה למשך 45 דקות, ועוצרים את העיכול עם נפח שווה של פתרון חסימה בסוף הדגירה. לסנן ברצף את המדגם, תחילה באמצעות מסננת תא 100 מיקרומטר ואחריו סינון דרך מסננת תא 70 מיקרומטר צנטריפוגה ההשעיה מסוננת במשך חמש דקות ב 200 פעמים g. אנחנו להשעות את גלולה בערך 5 מיליליטר של חיץ תזה אריתרוקיטים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.עצור את התזה עם נפח שווה של פתרון חסימה וסנן את הפתרון באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרומטר. לאחר מכן לאסוף את תאי רקמת שומן מיקרו מקוטע על ידי צנטריפוגה ואנחנו להשעות את גלולה בתותח חסימה טרי עם ערבוב קמח לספירה. לאחר דיסוציאציה וכתם נוגדנים, ניתן לקחת תאי שומן מיקרו-מפוצלים לציטומטר הזרימה לצורך ניתוח ו/או מיון תאים.ניתוק מכני של שאיבת שומן ידנית גורם לייצור רקמת שומן מיקרו-מקוטעת המורכבת ממצטבר של אדיפוציטים העוטפים רשת מיקרו-וסקולרית. ניתוח immunofluorescence של ג'לטין מוטבע ברקמת שומן מיקרו מקוטע cryofixed מדגיש את המבנה, מראה את רשת כלי הדם מסומן על ידי סמן התא אנדותל Ulex Europaeus Agglutinin 1 קולטן מורכב בעיקר של כלי קטן דמוי נימי. יש לציין, pericytes המביעים נוירון גליה אנטיגן 2 או טסיות דם נגזר קולטן קולטן בטא מופצים בדרך כלל, ensheathing תאים אנדותל.על ידי אי הכללת CD31 תאים אנדותל חיובי CD45 חיובי hematopoietic, הנוכחות של CD146 חיובי CD34 pericytes שלילי CD146 שלילי CD34 תאים חיוביים adventitial ניתן לזהות בתוך MAT. ידני lipo-שאיפה הוא חלק קריטי של ההליך חייב להתבצע בתנאים סטריליים לא יותר מ 16 שעות לאחר abdominoplasty. רקמת שומן מיקרו-מקוטעת יכולה להיות מעובדת עוד יותר על ידי כתמים אימונוהיסטוכימיים, תרבות במבחנה או ניתוח סודי כדי לקבל תובנה עמוקה יותר על ביולוגיה של רקמת שומן.טכניקה זו מאפשרת לימוד של רקמות מגוונות בסידור הטבעי, הטבעי והתלת מימדי שלהם כמעין אורגנואידים קטנים, שהם קטנים מספיק כדי להיות מושתלים בעכברים או להישמר בתרבות ארוכת טווח. ואנחנו משתמשים במערכת זו בעיקר כדי לגשת באופן ניסיוני למיקרו-וירוסים שונים הספציפיים לאיברים. תורמי רקמת השומן שלנו אינם ידועים כנשאים של זיהומים transmissible.עם זאת, בהיעדר כל הקרנה נוספת, כל הרקמות האנושיות צריכות להיחשב מזוהמות פוטנציאלית ומטופלות בהתאם.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 מעשיר את התשואה של מלנוציטים אנושיים מרקמות עור למבוגרים

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

בידוד, אפיון ויישום טיפולי של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים בתרבית

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...