Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Claire Cryer e Fiona Rossi dell'Università di Edimburgo per la loro assistenza esperta con citometria di flusso. Desideriamo anche ringraziare il personale dell'ospedale Murrayfield che ha contribuito fornendo campioni di tessuto.
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della British Heart Foundation e Lipogems, che hanno fornito kit di lavorazione dei tessuti adiposi. Campioni di tessuto umano adulto sono stati acquistati con il pieno permesso etico del Comitato etico di ricerca del Sud Est Scozia (riferimento: 16/SS/0103).

L'approvazione etica per l'uso dei tessuti umani in questa ricerca è stata ottenuta dal Comitato etico di ricerca del Sud-Est della Scozia (riferimento: 16/SS/0103).
1. Collezione di tessuti adiposi addominali sottocutanei
 NOT:</</c0> Tutti gli strumenti utilizzati nella procedura manuale lipo-aspirazione sono forniti dal produttore del dispositivo di microframmentazione.
<ol><li>Mantenere la sterilità per tutti i fluidi, contenitori, strumenti...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

Questo documento descrive la frazione fisica, utilizzando un dispositivo di sistema chiuso, del tessuto adiposo umano in piccoli ammassi che mostrano la normale microanatomia del tessuto adiposo.
Il tessuto adipose umano aspirato manualmente e la soluzione salina vengono caricati in un cilindro di plastica trasparente contenente grandi sfere metalliche in stile flipper che, a forte agitazione manuale del dispositivo, rompono il grasso in sub-millimetri Frammenti. I filtri attaccati e le slet c...

Tessuto adiposo, a lungo utilizzato come riempitivo in chirurgia ricostruttiva e estetica, è recentemente diventato più popolare nella medicina rigenerativa una volta riconosciuto come fonte per le cellule staminali mesenchymiche (MSC)1. I lipoaspirati dissociati enzimati in sospensioni unicellulari producono una frazione vascolare stromale senza adipociti (SVF) che viene utilizzata inalterata nel paziente o, più comunemente, viene coltivata per diverse settimane in MSC2.
Tuttavia, la dissociazione enzimatica rompe i microambienti tissutali, appartando le cellule regolatorie vicine da cellule rigenerative presunte che diventano notevolmente modificate dalla coltura in vitro. Per evitare tali artefatti sperimentali e conseguenti alterazioni funzionali, sono stati fatti tentativi di elaborare il tessuto adiposo per uso terapeutico, pur mantenendo la sua configurazione nativa il più intatta possibile3,4. In particolare, l'interruzione meccanica dei tessuti ha iniziato a sostituire la dissociazione enzimatica. A tal fine, la full immersion ha chiuso i micro-frammenti di micro-frammenti lipoaspirati in sottomillimetri, cluster di tessuti privi di sangue e olio (ad esempio, Lipogems) attraverso una sequenza di filtrazione setaccio e marmo d'acciaio indotto interruzione3. Il trapianto autologo di tessuto adiposo micro-frammentato, utilizzando questa tecnologia di sistema chiuso, ha avuto successo in molteplici indicazioni, estendendo cosmetici, ortopedici, proctologia e ginecologia4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Il confronto tra il tessuto adipose umano microframmentato (MAT) ottenuto con il dispositivo di sistema chiuso e la SVF isogenica ha rivelato che per quanto riguarda la distribuzione delle cellule vascolari/stromali e l'attività secretoria nella coltura, il MAT contiene più periciti, che sono presuntistativi MSC14, e secerne maggiori quantità di fattori di crescita e citochine15.
Il presente articolo illustra la microframmentazione senza enzimi del tessuto adiposo sottocutaneo umano utilizzando un dispositivo di sistema chiuso, e l'ulteriore elaborazione di tale tessuto adiposo micronizzato per la coltura in vitro, l'immunohistochimica e l'analisi FACS, per identificare i tipi di cellule presenti e i fattori solubili secreti (Figura 1). Il metodo descritto genera in modo sicuro organoidi sub-millimeter derivati adiposi contenenti popolazioni di cellule adipose vitali in una nicchia intatta, adatta per ulteriori applicazioni e studi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

Nell'ultimo decennio, i trapianti di tessuto adiposo sono stati ampiamente utilizzati nella chirurgia plastica e nell'ortopedia per migliorare la riproduzione e/o la rigenerazione dei tessuti. Di conseguenza, le tecniche per la raccolta e la lavorazione del tessuto adiposo umano si sono evolute al fine di ottenere rapidamente ed efficientemente grandi quantità di tessuto. Tra questi, la tecnologia del sistema chiuso rappresenta un sistema innovativo e facile da usare per raccogliere, elaborare e reiniettare tessuto adiposo raffinato in breve tempo e nello stesso intervento (intraoperatorio). Il tessuto adiposo viene raccolto mediante liposuzione, lavato, emulsionato, sciacquato e sciacquato meccanicamente in grappoli cellulari da 0,3 a 0,8 mm. Il trapianto autologo di tessuto adiposo frammentato meccanicamente ha dimostrato una notevole efficacia in diverse terapie terapeutiche come la medicina estetica e la chirurgia, la chirurgia ortopedica e generale. La caratterizzazione del tessuto adiposo micro-frammentato ha rivelato la presenza di piccoli vasi intatti all'interno degli ammassi adipociti; quindi, la nicchia perivascolare rimane imperturbata. Questi ammassi sono arricchiti in cellule perivascolari (ad esempio, antenati delle cellule staminali mesenchymal (MSC)) e l'analisi in vitro ha mostrato un maggiore rilascio di fattori di crescita e citochine coinvolte nella riparazione e rigenerazione dei tessuti, rispetto alle MSC di degenerazione enzimaticamente. Ciò suggerisce che il potenziale terapeutico superiore del tessuto adiposo microframmentato è spiegato da una maggiore frequenza di MSC presuntivi e una maggiore attività secretoria. Non è noto se questi periciti aggiunti contribuiscano direttamente a un fattore di crescita più elevato e alla produzione di citochine. Questa procedura clinicamente approvata consente il trapianto di sOTT SONdativi senza la necessità di espansione e/o trattamento enzimatico, aggirando così i requisiti delle linee guida GMP e riducendo i costi per le terapie basate sulle cellule.

La dissociazione meccanica dei lipoaspiri manuali ha portato alla produzione di tessuto adiposo microframmentato (MAT), costituito da un aggregato di adipociti che avvolgevano una rete microvascolare (Figura 3). L'analisi dell'immunofluorescenza del MAT incorporato nella gelatina e criofissa evidenzia questa struttura, mostrando la rete vascolare contrassegnata dal marcatore di cellule endoteliali Ulex europaeus agglutinininina 1 (UEA-1) costituita principalm...

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Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

Qui, presentiamo micro-frammentazione senza enzimi adiposi umani utilizzando un dispositivo di sistema chiuso. Questo nuovo metodo consente l'ottenimento di ammassi sub-millimetrici di tessuto adiposo adatto per il trapianto in vivo, la coltura in vitro e l'ulteriore isolamento e caratterizzazione delle cellule.

Tessuto Adiposo Umano Microframmentazione per la Fenotipizzazione Cellulare e la Caratterizzazione del Secretome

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Usando questo sistema, possiamo raccogliere gli ammassi sub-millimetrici del tessuto adiposo umano, in cui l'intero microambiente delle cellule rigenerative è intatto. Anche l'intero sistema microvascolare è intatto, e quindi possiamo usare questo tipo di micro organi per il trapianto in vivo per la coltura in vitro e per l'isolamento cellulare per un'ulteriore caratterizzazione. La logica principale per l'uso del sistema nel laboratorio di ricerca è che il processo è totalmente privo di enzimi, e quindi consente la lavorazione rapida ed efficiente del tessuto adiposo umano mantenendo una micro-architettura e sarà la microvascolarizzazione del tessuto totalmente intatta.E così possiamo studiare direttamente un prodotto di terapia cellulare che si è dimostrato già molto utile in clinica. Questa tecnologia a sistema chiuso è una tecnica facile da usare per la raccolta, la lavorazione e la reiezione del tessuto adiposo raffinato intraoperatorio e può essere applicata con successo in ortopedia cosmetica, proctologia e anche ginecologia. Questo metodo consente un ulteriore studio dell'impatto del grasso nella rigenerazione dei tessuti.La procedura sarà dimostrata da Bianca Vezzani, borsista post-dottorato e da Mario Gomez-Salazar, dottorando. Lavorando in condizioni asettiche entro 16 ore dalla raccolta, posizionare il campione di addominoplastica sopra un panno chirurgico con la pelle rivolta verso l'alto. Utilizzare una cannula di infiltrazione tissutale usa e getta per iniettare da 50 a 100 millilitri di 37 gradi Celsius soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% nel tessuto adiposo sottocutaneo.Collegare una siringa di blocco Luer da 10 millilitri a una cannula monouso per liposuzione e afferrare il campione nella regione cutanea vicino a un bordo del campione, introdurre con cura la cannula nel tessuto adiposo. Una volta che la cannula è all'interno del tessuto, estrarre lo stantuffo e spostare la cannula radialmente all'interno del campione di tessuto adiposo. È importante gestire saldamente il tessuto adiposo durante la lipo-aspirazione.Se non viene raccolto abbastanza grasso, prendere in considerazione l'esecuzione di un'iniezione salina aggiuntiva. Quando la siringa è piena di lipo-aspirato, rimuovere con cura la cannula dal tessuto e sostituire la siringa completa con una nuova siringa vuota fino a quando non è stato raccolto un totale di 60 millilitri di aspirato. Per la microframmentazione del lipo-aspirato, rimuovere il dispositivo dalla confezione e verificare che l'unità principale sia collegata al sacchetto dei rifiuti.Posizionare il sacchetto di raccolta dei rifiuti a terra e assicurarsi che le valvole siano fissate ai tappi dell'unità di processo. Perforare la porta di connessione del sacchetto per collegare il picco terminale della linea di ingresso nel sacchetto salino e posizionare il sacchetto salino più in alto dell'unità di elaborazione. Verificare che tutti e cinque i morsetti collegati ai tubi dei circuiti siano aperti, posizionare l'unità di lavorazione in posizione verticale, consentire alla soluzione salina di riempire l'unità di lavorazione e verificare che il flusso raggiunga il sacchetto di scarico.Agitare l'unità di elaborazione per rimuovere eventuali bolle d'aria e posizionare l'unità in posizione verticale con il cappuccio blu rivolto verso l'alto. Chiudere il morsetto accanto alla linea di ingresso e collegare una siringa di lipo-aspirato alla valvola auto-occluding del tappo di ingresso blu per iniziare a iniettare il lipo-aspirato. Mantenendo l'unità di lavorazione verticale, spingere lentamente verso il basso sullo stantuffo della siringa fino a quando tutto il lipo-aspirato non è stato trasferito all'unità.Una volta iniettato tutto il lipo-aspirato, aprire il morsetto di ingresso per ripristinare il flusso salino e scuotere vigorosamente l'unità di lavorazione per almeno due minuti, controllando regolarmente il flusso della soluzione salina nel sacchetto dei rifiuti. Quando la soluzione salina nell'unità di elaborazione diventa trasparente, posizionare l'unità con il cappuccio grigio verso l'alto e chiudere i morsetti situati sullo scarico vicino sia ai tappi blu che a quello grigio. Il tessuto lavorato galleggerà in alto.Quindi, riempire una siringa di blocco Luer da 10 millilitri con soluzione salina e collegare la siringa alla valvola di carico del cappuccio blu. Collegare una siringa di blocco Luer vuota da 10 millilitri con lo stantuffo completamente inserito nella valvola del cappuccio grigio. Iniettare saldamente la soluzione salina nell'unità di lavorazione dal cappuccio blu, verificando che la siringa collegata alla valvola grigia venga di conseguenza riempita con il tessuto lavorato.Quando tutta la salina è stata iniettata, rimuovere con cura entrambe le siringhe e ripetere l'infusione salina fino a quando tutto il tessuto lavorato non è stato raccolto. Al termine della lavorazione, rimuovere tutte le siringhe, chiudere tutti i morsetti, staccare il sacchetto salino e smaltire il dispositivo secondo i protocolli locali. Una volta raccolto tutto il tessuto lavorato, trasferire il tessuto adiposo micro-frammentato in un contenitore sterile e aggiungere un volume uguale di mezzo di digestione al contenitore.Posizionare il contenitore sigillato in un bagno d'acqua tremante di 37 gradi Celsius, impostato su 120 rotazioni al minuto per 45 minuti, fermando la digestione con lo stesso volume di soluzione di blocco alla fine dell'incubazione. Filtrare in sequenza il campione, prima attraverso un filtro a celle da 100 micrometri seguito dalla filtrazione attraverso un filtro a celle da 70 micrometri e centrifugare la sospensione filtrata per cinque minuti a 200 volte g. Sospendiamo il pellet in circa 5 millilitri di tampone di lisi degli etitrociti per 15 minuti a temperatura ambiente.Interrompere la lisi con lo stesso volume di soluzione di blocco e filtrare la soluzione attraverso un filtro a celle da 40 micrometri. Quindi raccogliere le cellule tissutali adipose micro-frammentate mediante centrifugazione e sospendiamo il pellet in soluzione di blocco fresco con miscelazione di farine per il conteggio. Dopo la dissociazione e la colorazione degli anticorpi, le cellule adipose micro-frammentate possono essere portate nel citometro del flusso per l'analisi cellulare e/o lo smistamento.La dissociazione meccanica delle lipo-aspirati manuali si traduce nella produzione di tessuto adiposo micro-frammentato che consiste in un aggregato di adipociti che avvolgono una rete microvascolare. L'analisi dell'immunofluorescenza della gelatina incorporata nel tessuto adiposo micro-frammentato criofissa evidenzia la struttura, mostrando la rete vascolare contrassegnata dal marcatore cellulare endoteliale Ulex Europaeus Agglutinin 1 e costituita principalmente da piccoli vasi capillari. In particolare, i periciti che esprimono l'antigene gliale neuronale 2 o il recettore beta del fattore di crescita derivato dalle piastrine sono normalmente distribuiti, ensheathing cellule endoteliali.Escludendo le cellule ematopoietiche positive CD31 e CD45 positive, la presenza di periciti negativi CD34 positivi CD146 e cellule avventiziali negative CD146 e CD34 positive può essere identificata all'interno del MAT. La lipo-aspirazione manuale è una parte critica della procedura e deve essere eseguita in condizioni sterili non più di 16 ore dopo l'addominoplastica. Il tessuto adiposo micro-frammentato può essere ulteriormente elaborato mediante colorazione immunoistochimica, coltura in vitro o analisi del secretome per ottenere una visione più approfondita della biologia dei tessuti adiposi.Questa tecnica consente lo studio di tessuti diversi nella loro disposizione naturale, nativa e tridimensionale come una sorta di piccoli organoidi, che sono abbastanza piccoli da essere trapiantati nei topi o da essere mantenuti in coltura a lungo termine. E usiamo questo sistema principalmente per affrontare sperimentalmente i diversi microambientati specifici degli organi. I nostri donatori di tessuti adiposi non sono noti come portatori di infezioni trasmissibili.Tuttavia, in assenza di ulteriori screening, tutti i tessuti umani dovrebbero essere considerati potenzialmente contaminati e trattati di conseguenza.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualizzazione della struttura del tessuto adiposo bianco 3D usando la macchiatura del intero-supporto

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 arricchisce la resa dei melanociti umani dai tessuti della pelle adulta

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Esplorazione della struttura dei tessuti adiposa mediante la compensazione methylsalicylate e l'imaging 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolamento e identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...