Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
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저자는 플로우 세포 측정에 대한 전문가의 도움을 에든버러 대학에서 클레어 크라이어와 피오나 로시에게 감사하고 자합니다. 우리는 또한 조직 표본을 제공함으로써 기여 머레이 필드 병원의 직원에게 감사드립니다.
이 작품은 지방 조직 처리 키트를 공급 영국 심장 재단과 Lipogems에서 보조금에 의해 지원되었다. 인간 성인 조직 샘플은 동남 스코틀랜드 연구 윤리위원회의 완전한 윤리 허가로 조달되었습니다 (참조: 16/SS/0103).

이 연구에서 인간 조직의 사용에 대 한 윤리적 승인 은 동남 스코틀랜드 연구 윤리 위원회 (참조: 16/SS/0103)에서 얻었다.
1. 피하 복부 지방 조직 수집
참고: 수동 리포 포인스 절차에 사용되는 모든 계측기는 마이크로 단편화 장치의 제조업체에서 제공합니다.
<ol><li>실험 전반에 걸쳐 모든 유체, 용기, 기기 및 작동 영역에 대해 멸균을 유지합?...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

이 논문은 폐쇄 된 시스템 장치를 사용하여 인간 지방 조직을 정상적인 지방 조직 미세 해부학을 나타내는 작은 클러스터로 물리적 분획에 대해 설명합니다.
수동으로 흡인 된 인간 피하 지방 조직 과 식염수 용액은 장치의 격렬한 수동 흔들림시 지방을 밀리미터 단위로 파열시키는 큰 핀볼 스타일의 금속 구체가 들어있는 투명한 플라스틱 실린더에 로드됩니다. 조각. 부착된...

회당 조직은 오랫동안 재건 및 성형 수술에서 필러로 사용되어 왔으며, 최근에는 중간엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)의 공급원으로 인식된 재생 의학에서 더 인기를 얻고 있습니다1. 지질흡사염은 단세포 현탁액으로 효소해리되어 환자에서 변경되지 않은 채 사용되거나, 더 일반적으로, MSCs2로몇 주 동안 배양되는 지방세포없는 기질 혈관 분획(SVF)을 산출한다.
그러나, 효소 해리는 시험관 내 문화에 의해 상당히 변형되는 추정 재생 세포로부터 인접한 조절 세포를 외딴 조직 미세 환경을 파열시킵니다. 이러한 실험적 유물 및 그에 따른 기능적 변경을 피하기 위해,가능한한 기본 구성을 그대로 유지하면서 치료용 지방 조직을 처리하려는 시도가3,4. 특히, 기계적 조직 파괴는 효소 해리를 대체하기 시작했습니다. 이를 위해, 완전 침지 폐쇄 시스템은 체 여과 및 강철 대리석 유도중단의서열을 통해 서브 밀리미터, 혈액 및 오일 프리 조직 클러스터(예를 들어, Lipogems)로 리포아스해적을 밀어넣는다 3. 이 폐쇄 된 시스템 기술을 사용하여 마이크로 단편화 된 지방 조직의 자가 이식은 화장품, 정형 외과, 진록학 및부인과에걸쳐 여러 적응증에 성공했습니다 4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
폐쇄 된 시스템 장치와 등소 성 SVF로 얻은 인간 미세 단편 지방 조직 (MAT)과의 비교는 혈관 / 기질 세포 분포 및 배양내분비 활성과 관련하여 MAT가 더 많은 pericytes를 함유하고 있음을 밝혀냈습니다. 추정형자엽(14)과더 많은 양의 성장인자와 사이토카인(15)을 분비한다.
본 논문은 폐쇄된 시스템 장치를 이용한 인간 피하 지방 조직의 효소 프리 미세 단편화, 체외 배양, 면역조직화학 및 FACS 분석을 위한 이러한 미세화된 지방 조직의 추가 처리를 도시하고, 현재 존재하는 세포 유형과 분비되는 수용성 인자를 식별하기 위해(그림 1). 기재된 방법은 자연 틈새 시장에서 생존 가능한 지방 조직 세포 집단을 포함하는 지방 유래 서브 밀리미터 오르가노이드를 안전하게 생성하며, 추가 의 응용 및 연구에 적합합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

지난 10 년 동안, 지방 조직 이식 널리 조직 재생 및 / 또는 재생을 향상시키기 위해 성형 수술 및 정형 외과에 사용되어왔다. 따라서, 인간 지방 조직을 수확하고 가공하는 기술은 다량의 조직을 신속하고 효율적으로 얻기 위해 진화했다. 이 중, 폐쇄 시스템 기술은 수확, 처리, 짧은 시간에 동일한 개입 (수술 중)에서 정제 된 지방 조직을 다시 주입하는 혁신적이고 사용하기 쉬운 시스템을 나타냅니다. 지방 조직은 지방 흡입에 의해 수집, 세척, 유화, 헹구고 0.3 에 0.8 mm의 세포 클러스터로 기계적으로 다진. 기계적으로 단편화 된 지방 조직의 자가 이식은 다른 치료에서 현저한 효능을 보였다 미용 의학 및 수술, 정형 외과 및 일반 수술과 같은 적응증. 미세 단편화 된 지방 조직의 특성화는 지방 세포 클러스터 내에서 손상되지 않은 작은 혈관의 존재를 밝혀; 따라서, 시반 틈새 는 흔들리지 않는 남아있다. 이들 군집은 혈관세포(즉, 중간엽 줄기세포(MSC) 조상)에서 풍부하게 공급되고 시험관내 분석은 효소 유래 중간엽 세포에 비해 조직 수선 및 재생에 관여하는 성장 인자 및 사이토카인의 증가된 방출을 보였다. 이것은 미세 단편화된 지방 조직의 우수한 치료 잠재력이 추정 형 MCS및 향상된 분비 활성의 높은 빈도에 의해 설명된다는 것을 시사한다. 이들 첨가된 pericytes가 더 높은 성장 인자 및 사이토카인 생산에 직접적으로 기여하는지 여부는 알려져 있지 않다. 이 임상적으로 승인된 절차는 확장 및/또는 효소 치료없이 추정 형 MC의 이식을 허용하여 GMP 지침의 요구 사항을 우회하고 세포 기반 치료 비용을 줄일 수 있습니다.

수동 지질 파괴자의 기계적 해리는 미세 혈관 네트워크를 포위하는 지방세포의 집합체로 구성된 미세 단편화된 지방 조직(MAT)의 생산을 초래하였다(그림3). 젤라틴 임베디드 및 극저온 MAT의 면역형 광형 분석이 구조를 강조하여 내피 세포 마커 Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1) 수용체에 의해 표시된 혈관 네트워크를 나타내는 것은 주로 작고 모세관과 같?...

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Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

여기서, 우리는 폐쇄된 시스템 장치를 사용하여 인간 지방 조직 효소-무마이크로 단편화를 제시한다. 이 새로운 방법은 생체 내 이식, 시험관 내 배양, 및 추가적인 세포 격리 및 특성화에 적합한 지방 조직의 서브 밀리미터 클러스터의 획득을 허용한다.

세포 표현형 및 분비 특성화를 위한 인간 지방 조직 미세 단편화

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

이 시스템을 사용하여, 우리는 재생 세포의 전체 미세 환경이 그대로있는 인간 지방 조직의 하위 밀리미터 클러스터를 수집 할 수 있습니다. 전체 미세 혈관 시스템은 또한 손상되지 않으며, 그래서 우리는 체외 배양을 위한 생체 내 이식및 추가 특성화를 위한 세포 격리를 위해 이러한 종류의 마이크로 기관을 사용할 수 있습니다. 연구 실험실에서 시스템의 사용에 대한 주요 근거는 과정이 완전히 효소가 없으며, 미세 아키텍처를 유지하면서 인간 지방 조직의 신속하고 효율적인 처리를 허용하고 조직의 미세 혈관이 완전히 손상되지 않을 것이라는 것입니다.그래서 우리는 진료소에서 이미 매우 유용한 것으로 입증 된 세포 치료 제품을 직접 연구 할 수 있습니다. 이 폐쇄 시스템 기술은 수확, 처리 및 재주입 정제 지방 조직 수술 에 대한 사용하기 쉬운 기술이며, 성공적으로 화장품 정형 외과, 프롬톨로지 및 산부인과에 적용 할 수 있습니다. 이 방법은 조직 재생에 지방의 영향에 대한 추가 연구를 할 수 있습니다.절차는 비앙카 베자니에 의해 입증될 것입니다, 박사 후 동료와 마리오 고메즈 살라자르에 의해, 박사 과정 학생입니다. 수확 후 16시간 이내에 무균 조건에서 작업하면 복부 성형술 샘플을 수술 용 천 위에 올려 놓고 피부가 위쪽으로 향합니다. 일회용 조직 침투 캐뉼라를 사용하여 섭씨 37도의 50~100밀리리터를 피하 지방 조직에 0.9%의 염화나트륨 용액을 주입합니다.일회용 지방 흡입 캐뉼라에 10 밀리리터 루어 잠금 주사기를 연결하고 샘플 가장자리 근처의 큐탄 부위의 샘플을 잡고 조심스럽게 지방 조직에 캐뉼라를 도입하십시오. 캐뉼라가 조직 내부에 있으면 플런저를 추출하고 지방 조직 샘플 내에서 캐뉼라를 복사하여 이동합니다. 리포 포부 동안 지방 조직을 단단히 처리하는 것이 중요합니다.충분한 지방이 수집되지 않는 경우, 추가 식염수 주입을 수행하는 것이 좋습니다. 주사기가 리포 흡혈구로 가득 차면 조직에서 캐뉼라를 조심스럽게 제거하고 총 60 밀리리터의 흡입량이 수확 될 때까지 전체 주사기를 새로운 빈 주사기로 교체하십시오. 리포 흡인의 미세 조각화를 위해 패키지에서 장치를 제거하고 메인 장치가 폐백에 연결되어 있는지 확인합니다.폐기물 수거 백을 바닥에 놓고 밸브가 공정 단위 캡에 고정되어 있는지 확인합니다. 입력 라인의 단자 스파이크를 식염수 백에 연결하고 식염수 가방을 가공 장치보다 높게 배치하기 위해 가방 연결 포트를 관통합니다. 회로의 튜브에 연결된 5개의 클램프가 모두 열려 있는지 확인하고, 가공 장치를 수직 위치에 배치하고, 식염수 용액이 처리 장치를 채울 수 있도록 하고, 흐름이 폐백에 도달하는지 확인한다.가공 장치를 흔들어 기포를 제거하고 파란색 캡이 위쪽으로 향하는 수직 위치에 장치를 배치합니다. 입력 라인 옆의 클램프를 닫고 리포 흡면 주사를 파란색 입력 캡의 자체 폐색 밸브에 연결하여 리포 흡인주사를 삽입합니다. 처리 장치를 수직으로 유지하여 모든 리포 흡인이 장치로 옮겨질 때까지 주사기 플런저에서 천천히 아래로 밀어 넣습니다.모든 리포 흡인체가 주입되면 입력 클램프를 열어 식염수 흐름을 복원하고 처리 장치를 적어도 2 분 동안 격렬하게 흔들어 식염수 용액이 폐기물 백으로 유입되었는지 정기적으로 확인하십시오. 처리 장치의 식염수 용액이 투명하게 변하면 회색 캡이 있는 장치를 위쪽으로 놓고 파란색과 회색 캡 근처의 드레인에 있는 클램프를 닫습니다. 처리된 조직은 상단에 떠 있을 것입니다.다음으로, 10 밀리리터 루어 잠금 주사기를 식염수 용액으로 채우고 주사기를 블루 캡의 로딩 밸브에 연결합니다. 빈 10 밀리리터 루어 잠금 주사기를 회색 캡의 밸브에 완전히 삽입한 플런저와 연결합니다. 식염수는 파란색 캡에서 처리 장치에 식염수들을 단단히 주입하여 회색 판막에 연결된 주사기가 결과적으로 처리 된 조직으로 채워지고 있는지 확인합니다.모든 식염수주입이 발생하면 주사기를 신중하게 제거하고 모든 처리된 조직이 수집될 때까지 식염수 주입을 반복합니다. 처리가 끝나면 모든 주사기를 제거하고 모든 클램프를 닫고 식염수 가방을 분리하고 로컬 프로토콜에 따라 장치를 폐기합니다. 모든 처리된 조직이 수집되면 미세 조각된 지방 조직을 멸균 용기로 옮기고 용기에 동일한 양의 소화 배지를 추가합니다.밀봉된 용기를 섭씨 37도의 흔들리는 수조에 넣고 분당 120회전으로 45분 간 설정하여 인큐베이션 끝에 동일한 양의 블로킹 용액으로 소화를 멈춥춥니까. 샘플을 순차적으로 필터링하여 먼저 100 마이크로미터 세포 여과기를 통해 70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 여과하고 200배 g에서 5분 동안 여과된 서스펜션을 원심분리합니다. 우리는 실온에서 15 분 동안 적혈구 용해 버퍼의 약 5 밀리리터에서 펠릿을 중단합니다.동일한 양의 블로킹 솔루션으로 용액을 중지하고 40 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 용액을 필터링합니다. 그런 다음 원심 분리에 의해 미세 조각된 지방 조직 세포를 수집하고 우리는 계산을위한 밀가루 혼합과 신선한 차단 용액에서 펠릿을 중단합니다. 해리 및 항체 염색 후, 마이크로 단편화된 지방 세포는 세포 분석 및/또는 분류를 위한 유동 세포계로 이동될 수 있다.수동 리포 흡인의 기계적 해리는 마이크로 혈관 네트워크를 둘러싸는 지방 세포의 집합으로 구성된 마이크로 단편화 된 지방 조직의 생산을 초래합니다. 동결 고정 마이크로 단편화 된 지방 조직에 내장 된 젤라틴의 면역 불발 분석은 내피 세포 마커 울렉스 Europaeueus Agglutinin 1 수용체에 의해 표시된 혈관 네트워크를 보여주고 주로 작은 모세 혈관과 같은 혈관으로 구성된 구조를 강조한다. 특히, 뉴런-신경교항원 2 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타를 발현하는 pericytes는 일반적으로 분포되어 내피 세포를 내피 세포에 내피세포로 내피한다.CD31 양성 내피 및 CD45 양성 조혈 세포를 제외함으로써, CD146 양성 CD34 음성 백혈구 및 CD146 음성 및 CD34 양성 출현 세포의 존재는 MAT 내에서 식별될 수 있습니다. 미세 단편화된 지방 조직은 면역조직화학적 염색, 체외 배양 또는 분비 분석에 의해 추가로 처리되어 지방 조직 생물학에 대한 심층적인 통찰력을 얻을 수 있다.이 기술은 마우스에서 이식되거나 장기 문화에서 유지 될 정도로 작은 오르가노이드의 일종으로 자연, 네이티브, 입체 배열에 있는 다양한 조직의 연구를 허용합니다. 그리고 우리는 주로 이 시스템을 사용하여 다른 장기별 마이크로 환경에 실험적으로 접근합니다. 우리의 지방 조직 기증자는 전염성 감염의 운반대로 알려져 있지 않습니다.그러나 추가 검열이 없는 경우에, 모든 인간 적인 조직은 잠재적으로 오염되고 그에 따라 취급되는 것으로 간주되어야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

연구

생물학

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 성인 피부 조직에서 인간 멜라닌 세포의 수율을 강화

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...