Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Claire Cryer og Fiona Rossi ved University of Edinburgh for deres eksperthjelp med Flow flowcytometri. Vi ønsker også å takke personell på Murrayfield sykehus som bidro ved å gi vevsprøver.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra British Heart Foundation og Lipogems, som leverte fettvev prosessering kits. Human voksen vevsprøver ble anskaffet med full etikk tillatelse fra South East Scotland Research etikk Committee (referanse: 16/SS/0103).

Etisk godkjenning for bruk av menneskelig vev i denne forskningen ble innhentet fra South East Scotland Research etikk Committee (referanse: 16/SS/0103).
1. subkutan abdominal fettvev samling
Merk: Alle instrumenter som brukes i den manuelle Lipo-aspirasjon prosedyren er levert av produsenten av mikro-fragmentering enheten.
<ol><li>Oppretthold sterilitet for alle væsker, beholdere, instrumenter og det operative området gjennom hele eksperimentet...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

Dette papiret beskriver den fysiske fraksjonering, ved hjelp av en lukket system enhet, av menneskelig fettvev i små klynger som viser normal fettvev microanatomy.
Manuelt pustende menneskelige subkutan fettvev og saltvann er lastet inn i en gjennomsiktig plast sylinder som inneholder store Pinball-stil metalliske kuler som, ved kraftig manuell risting av enheten, brudd fettet i sub-millimeter Fragmenter. Vedlagte filtre og utløp tillate fjerning av rusk, blod og fri lipider og MAT er samlet...

Fettvev, lenge brukt som et fyllstoff i rekonstruktiv og kosmetisk kirurgi, har nylig blitt mer populært i regenererende medisin en gang anerkjent som en kilde for Mesenchymal stamceller (MSCs)1. Lipoaspirates dissosiert enzymatisk til enkelt celle suspensjoner gir en adipocyte-fri stromal vaskulær brøk (SVF) som brukes uendret i pasienten eller, mer vanlig, er kultivert i flere uker i MSCs2.
Men enzym dissosiasjon brudd vevet microenvironments, secluding nabokommunene regulatoriske celler fra presumptive regenererende celler som blir betydelig modifisert av in vitro kultur. For å unngå slike eksperimentelle gjenstander og påfølgende funksjonelle endringer, har det blitt gjort forsøk på å behandle fettvev for terapeutisk bruk og samtidig opprettholde sin opprinnelige konfigurasjon så intakt som mulig3,4. Spesielt, mekanisk vev avbrudd har begynt å erstatte enzymatisk dissosiasjon. For dette formål full nedsenking lukket system mikro-fragmenter lipoaspirates i sub-millimeter, blod-og olje-fri vev klynger (f. eks Lipogems) via en sekvens av sil filtrering og stål marmor indusert avbrudd3. Autologous transplantasjon av mikro-fragmentert fettvev, ved hjelp av denne lukket system teknologi, har vært vellykket i flere indikasjoner, som spenner over kosmetikk, Ortopedi, proctology og gynekologi4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Sammenligning mellom humant mikro-fragmentert fettvev (MAT) innhentet med lukket system enhet og isogenic SVF avslørte at med hensyn til vaskulær/stromal celle distribusjon og sekretoriske aktivitet i kultur, inneholder MAT mer pericytes, som er presumptive MSCs14, og utskiller høyere mengder av vekstfaktorer og cytokiner15.
Den nåværende artikkelen illustrerer enzymet-fri mikro-fragmentering av humant subkutan fettvev ved hjelp av en lukket system enhet, og den videre behandling av slike mikronisert fettvev for in vitro kultur, immunhistokjemi og FACS analyse, for å identifisere celletyper stede og løselige faktorer utskilles (figur 1). Den beskrevne metoden genererer sikkert fett avledet sub-millimeter organoids inneholder levedyktig fettvev celle populasjoner i en intakt nisje, egnet for videre søknader og studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

I det siste tiåret har fettvevet transplantasjon vært mye brukt i plastisk kirurgi og orthopaedics å forbedre vev tilskudd og/eller regenerering. Følgelig, teknikker for høsting og behandling av menneskelig fettvev har utviklet seg for raskt og effektivt å få store mengder vev. Blant disse representerer lukket system teknologi en innovativ og lett-å-bruke systemet til å høste, behandle, og re-injisere raffinert fettvev på kort tid og i samme intervensjon (intra-operativt). Fettvev samles inn av fettsuging, vasket, emulgert, skylles og mekanisk i celle klynger på 0,3 til 0,8 mm. autologous transplantasjon av mekanisk fragmentert fettvev har vist bemerkelsesverdig effekt i ulike terapeutiske indikasjoner som estetisk medisin og kirurgi, ortopedisk og generell kirurgi. Karakterisering av mikro-fragmentert fettvev avdekket tilstedeværelsen av intakt små fartøy innenfor adipocyte klynger; Derfor er inflammasjon nisje igjen Uaffisert. Disse klynger er beriket i inflammasjon celler (dvs. mesenchymal stilk cellen (MSC) forfedre) og in vitro analyse viste en økt frigjøring av vekstfaktorer og cytokiner involvert i vev reparasjon og regenerering, sammenlignet med enzymatisk avledet MSCs. Dette tyder på at den overlegne terapeutiske potensialet i microfragmented fettvev er forklart av en høyere frekvens av presumptive MSCs og forbedret sekretoriske aktivitet. Hvorvidt disse lagt pericytes direkte bidra til høyere vekstfaktor og cytokin produksjon er ikke kjent. Denne klinisk godkjente prosedyren tillater transplantasjon av presumptive MSCs uten behov for ekspansjon og/eller enzymatisk behandling, og dermed omgå kravene i GMP retningslinjer, og redusere kostnadene for celle-baserte terapier.

Mekanisk dissosiasjon av manuelle lipoaspirates resulterte i produksjon av mikro-fragmentert fettvev (MAT), bestående av en mengde adipocytter som omslutter et mikrovaskulær nettverk (Figur 3). Immunofluorescence analyse av gelatin-embedded og cryofixed MAT fremhever denne strukturen, viser det vaskulære nettverket preget av endothelial celle markør Ulex Tiriltunge agglutinin 1 (UEA-1) reseptor hovedsakelig bestående av små, kapillær-lignende fartøy (...

Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

Her presenterer vi menneskelige fettvev enzym-fri mikro-fragmentering ved hjelp av en lukket system enhet. Denne nye metoden gjør det mulig for obtainment av sub-millimeter klynger av fettvev egnet for in vivo transplantasjon, in vitro kultur, og ytterligere celle isolasjon og karakterisering.

Human fettvev Micro-fragmentering for Cell bestemmelse av fenotype og Secretome karakterisering

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Ved hjelp av dette systemet kan vi samle sub-millimeter klynger av humant fettvev, der hele mikromiljøet av regenerative celler er intakt. Hele mikrovaskulære systemet er også intakt, og slik at vi kan bruke denne typen mikroorganer for in-vivo transplantasjon for in-vitro kultur og for celleisolasjon for videre karakterisering. Hovedbegrunnet for bruk av systemet i forskningslaboratoriet er at prosessen er helt enzymfri, og slik at den muliggjør rask og effektiv behandling av humant fettvev samtidig som en mikroarkitektur opprettholdes, og det vil være mikrovaskulaturen av vevet helt intakt.Og så kan vi direkte studere et celleterapiprodukt som allerede har vist seg å være svært nyttig i klinikken. Denne lukkede systemteknologien er en brukervennlig teknikk for høsting, behandling og reinjeksjon raffinert fettvev intraoperativt, og kan med hell brukes i kosmetikk ortopedi, proktologi og også gynekologi. Denne metoden tillater videre studier av virkningen av fett i vevregenerering.Prosedyren vil bli demonstrert av Bianca Vezzani, en postdoktor og av Mario Gomez-Salazar, som er ph.d.-student. Arbeide under aseptiske forhold innen 16 timer etter høsting, plasser mageplastikkprøven på toppen av en kirurgisk klut med huden vendt oppover. Bruk en engangsvevinfiltrasjonsmetyle til å injisere 50 til 100 milliliter på 37 grader Celsius 0,9% natriumkloridoppløsning i det subkutane fettvevet.Koble en 10 milliliter Luer låsesprøyte til en engangs fettsugingskant og ta tak i prøven i kutan region nær en kant av prøven, og sett forsiktig kanylen inn i fettvevet. Når kanylen er inne i vevet, trekk ut stempelet og flytt kanylen radialt i fettvevsprøven. Det er viktig å håndtere fettvevet fast under lipo-aspirasjonen.Hvis ikke nok fett samles, bør du vurdere å utføre en ekstra saltvanninjeksjon. Når sprøyten er full av lipo-aspirate, fjern forsiktig kanylen fra vevet og skift ut hele sprøyten med en ny tom sprøyte til totalt 60 milliliter aspirat er høstet. For mikrofragmentering av lipo-aspiraten, fjern enheten fra pakken og kontroller at hovedenheten er koblet til avfallsposen.Plasser avfallsoppsamlingsposen på bakken, og kontroller at ventilene er festet til prosessenhetshettene. Pierce posen tilkoblingsporten for å koble terminalen spissen av inngangslinjen inn i saltvannposen og plassere saltvannposen høyere enn behandlingsenheten. Kontroller at alle de fem klemmene som er koblet til kretsrørene er åpne, plasser behandlingsenheten i vertikal stilling, la saltløsningen fylle behandlingsenheten og bekreft at strømmen når avfallsposen.Rist behandlingsenheten for å fjerne eventuelle luftbobler og plasser enheten i vertikal stilling med den blå hetten vendt oppover. Lukk klemmen ved siden av inngangsledningen og koble en sprøyte med lipo-aspirat til selvokkluderende ventil på den blå inngangshetten for å begynne å injisere lipo-aspiraten. Hold behandlingsenheten loddrett, trykk langsomt ned på sprøytestempelet til hele lipo-aspiraten er overført til enheten.Når hele lipo-aspiraten er injisert, åpner du inngangsklemmen for å gjenopprette saltvannsstrømmen og rister behandlingsenheten kraftig i minst to minutter, og kontrollerer regelmessig saltvannsløsningsstrømmen inn i avfallsposen. Når saltvannsløsningen i behandlingsenheten blir gjennomsiktig, plasserer du enheten med den grå hetten oppover og lukker klemmene på avløpet nær både det blå og de grå hettene. Det bearbeidede vevet vil flyte på toppen.Fyll deretter en 10 milliliter Luer låsesprøyte med saltvannsoppløsning, og kobler sprøyten til lasteventilen på den blå hetten. Koble en tom Luer-låsesprøyte på 10 milliliter med stempelet som er satt helt inn i ventilen på den grå hetten. Injiser saltvannet godt inn i behandlingsenheten fra den blå hetten, og kontroller at sprøyten som er koblet til den grå ventilen, derfor fylles med det bearbeidede vevet.Når hele saltvannet er injisert, fjern forsiktig begge sprøytene og gjenta saltvannsinfusjonen til alt bearbeidet vev er samlet inn. På slutten av behandlingen, fjern alle sprøytene, lukk alle klemmene, ta av saltvannsposen og kast enheten i henhold til lokale protokoller. Når alt det bearbeidede vevet er samlet inn, overfør det mikrofragmenterte fettvevet til en steril beholder, og legg til et likt volum fordøyelsesmedium til beholderen.Plasser den forseglede beholderen i et 37 grader Celsius risting vannbad, satt til 120 rotasjoner per minutt i 45 minutter, stoppe fordøyelsen med et likt volum av blokkerende løsning på slutten av inkubasjonen. Filtrer prøven sekvensielt, først gjennom en 100 mikrometercellesil etterfulgt av filtrering gjennom en 70 mikrometercellesil og sentrifugerer den filtrerte suspensjonen i fem minutter ved 200 ganger g. Vi suspenderer pelleten i ca. 5 milliliter erytrocyttlysbuffer i 15 minutter ved romtemperatur.Stopp lysisen med et likt volum av blokkeringsløsning og filtrer løsningen gjennom en 40 mikrometercellesil. Deretter samler du de mikrofragmenterte fettvevscellene ved sentrifugering, og vi suspenderer pelleten i fersk blokkeringsløsning med melblanding for telling. Etter dissosiasjon og antistofffarging kan mikrofragmenterte fettceller tas til strømningscytometeret for celleanalyse og/eller sortering.Mekanisk dissosiasjon av manuelle lipo-aspirater resulterer i produksjon av mikrofragmentert fettvev som består av en mengde adipocytter som omslutter et mikrovaskulært nettverk. Immunofluorescence analyse av gelatin innebygd i kryofixed mikrofragmentert fettvev fremhever strukturen, viser vaskulært nettverk preget av endotelcellemarkør Ulex Europaeus Agglutinin 1 reseptor og hovedsakelig bestående av små kapillære-lignende fartøy. Spesielt, pericytes uttrykker neuron-glial antigen 2 eller blodplate-avledet vekstfaktor reseptor beta er normalt fordelt, ensheathing endotelceller.Ved å ekskludere CD31 positive endotel- og CD45 positive hematopoetiske celler, kan tilstedeværelsen av CD146 positive CD34 negative pericytes og CD146 negative og CD34 positive adventitialceller identifiseres i MAT. Manuell lipo-aspirasjon er en kritisk del av prosedyren og må utføres under sterile forhold ikke mer enn 16 timer etter mageplastikken. Mikrofragmentert fettvev kan videre behandles av immunohistokjemisk farging, in vitro kultur eller sekretomanalyse for å få et dypere innblikk i fettvevsbiologi.Denne teknikken tillater studiet av ulike vev i deres naturlige, innfødte, tredimensjonale arrangement som en slags små organoider, som er små nok til å bli transplantert hos mus eller opprettholdes i langsiktig kultur. Og vi bruker dette systemet hovedsakelig til å nærme seg eksperimentelt de forskjellige organspesifikke mikromiljøene. Våre fettvevsdonorer er ikke kjent som bærere av overførbare infeksjoner.Men i fravær av ytterligere screening, bør alle menneskelige vev betraktes som potensielt forurenset og håndteres tilsvarende.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering av Mitokondrier fra minimale mengder av Mouse Skeletal Muscle for høy gjennomstrømming Micro respirasjonsmålinger

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vev fjerne metoden for tredimensjonale Imaging av fettvev

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering av 3D hvit fettvev struktur med hele-mount flekker

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Beriker utbyttet av menneskelige melanocytter fra voksen hudvev

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Utforske fettvevsstruktur av Methylsalicylate Clearing og 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering og terapeutisk anvendelse av ekstracellulære vesikler fra dyrkede humane mesenkymale stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolering og identifisering av mesenkymale stamceller avledet fra fettvev av Sprague Dawley-rotter

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Semi-automatisert isolering av den stromale vaskulære fraksjonen fra murine hvitt fettvev ved bruk av en vevsdissosiator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...