Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
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Os autores desejam agradecer a Claire Cryer e Fiona Rossi na Universidade de Edimburgo por sua assistência especializada com citometria de fluxo. Também gostaríamos de agradecer ao pessoal do hospital Murrayfield que contribuiu com o fornecimento de espécimes de tecidos.
Este trabalho foi apoiado por subvenções da British Heart Foundation e Lipogems, que forneceu kits de processamento de tecidos adiposos. Amostras de tecido adulto humano foram adquiridas com total permissão de ética do Comitê de ética em pesquisa do sudeste da Escócia (referência: 16/SS/0103).

A aprovação ética para o uso de tecidos humanos nesta pesquisa foi obtida do Comitê de ética em pesquisa do sudeste da Escócia (referência: 16/SS/0103).
1. coleta de tecido adiposo abdominal subcutâneo
Nota: Todos os instrumentos utilizados no procedimento de lipo-aspiração manual são fornecidos pelo fabricante do dispositivo de microfragmentação.
<ol><li>Mantenha a esterilidade para todos os fluidos, recipientes, instrumentos e a ár...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

Este papel descreve o fractionation físico, usando um dispositivo fechado do sistema, do tecido adiposo humano em conjuntos pequenos que indicam a microanatomia normal do tecido adiposo.
O tecido adiposo subcutaneous humano manualmente aspirado e a solução salina são carregados em um cilindro plástico transparente que contem grandes esferas metálicas do pinball-estilo que, em cima da agitação manual vigorosa do dispositivo, rompam a gordura no submilímetro Fragmentos. Filtros anexados...

O tecido adiposo, usado por muito tempo como um enchimento na cirurgia reconstrutiva e cosmética, tornou-se recentemente mais popular na medicina regenerativa reconhecida uma vez como uma fonte para pilhas de haste mesenquimais (MSCS)1. Os lipoaspirates dissociados enzimaticamente em suspensões da único-pilha rendem uma fração vascular stromal adipocyte-livre (SVF) que seja usada inalterada no paciente ou, mais geralmente, é cultivada por diversas semanas em MSCs2.
No entanto, a dissociação enzimática rompe os microsambientes teciduais, isolando células reguladoras vizinhas de células regenerativas presuntivas que se tornam consideravelmente modificadas pela cultura in vitro. Para evitar tais artefatos experimentais e conseqüentes alterações funcionais, foram feitas tentativas para processar o tecido adiposo para usoterapêutico, mantendosua configuração nativa tão intacta quanto possível3,4. Notavelmente, a ruptura do tecido mecânico começou a substituir a dissociação enzimática. Para este fim, os microfragmentos fechados do sistema da imersão cheia lipoaspirates em aglomerados do tecido do secundário-milímetro, do sangue-e do óleo-livre (por exemplo, Lipogems) através de uma seqüência da filtração da peneira e do rompimento induzido mármore de aço3. A transplantação autóloga do tecido adiposo micro-fragmentado, usando esta tecnologia Closed do sistema, foi bem sucedida em indicações múltiplas, abrangendo cosméticos, orthopedics, Proctologia e Ginecologia4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
A comparação entre o tecido adiposo microfragmentado humano (MAT) obtido com o dispositivo fechado do sistema e o SVF isogênicos revelou que com respeito à distribuição vascular/stromal da pilha e à atividade secretora na cultura, a esteira contem mais pericytes, que são presuntivos MSCS14, e secreta maiores quantidades de fatores de crescimento e citocinas15.
O artigo atual ilustra a microfragmentação enzima-livre do tecido adiposo subcutaneous humano usando um dispositivo fechado do sistema, e o processamento mais adicional de tal tecido adiposo micronizada para a cultura in vitro, immunohistochemistry e a análise de FACS, a fim de identificar os tipos de células presentes e os fatores solúveis secretados (Figura 1). O método descrito com segurança gera os organóides derivados do submilímetro do adiposo que contêm populações viáveis da pilha do tecido adiposo em um nicho intacto, apropriado para umas aplicações e uns estudos mais adicionais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

Na última década, os transplantes de tecido adiposo têm sido amplamente utilizados na cirurgia plástica e ortopedia para melhorar a reposição tecidual e/ou regeneração. Assim, as técnicas de colheita e processamento do tecido adiposo humano evoluíram de forma rápida e eficiente para obter grandes quantidades de tecido. Entre estes, a tecnologia de sistema fechado representa um sistema inovativo e easy-to-use para colher, processar, e re-injetar o tecido gordo refinado em um curto período de tempo e na mesma intervenção (intra-operatively). O tecido adiposo é coletado por lipoaspiração, lavado, emulsionado, lavado e picado mecanicamente em aglomerados de células de 0,3 a 0,8 mm. a transplantação autóloga do tecido adiposo mecanicamente fragmentou demonstrou a eficácia notável em diferentes terapêutica indicações como medicina estética e cirurgia, Ortopedia e cirurgia geral. A caracterização do tecido adiposo microfragmentado revelou a presença de pequenos vasos intactos dentro dos aglomerados de adipócitos; daqui, o Niche perivascular é deixado unperturbed. Estes aglomerados são enriquecidos em células perivasculares (i.e., ancestrais de células-tronco mesenquimais (MSC)) e a análise in vitro mostrou uma maior liberação de fatores de crescimento e citocinas envolvidas na reparação e regeneração tecidual, em comparação com os MSCs enzimaticamente derivados. Isto sugere que o potencial terapêutico superior do tecido adiposo microfragmentado seja explicado por uma freqüência mais elevada de MSCS presuntivos e de atividade secretora realçada. Se estes pericitos adicionados contribuem diretamente ao fator de crescimento mais elevado e à produção do citocinas não é sabido. Este procedimento clinicamente aprovado permite a transplantação de MSCs presuntivos sem a necessidade para a expansão e/ou o tratamento enzimático, assim ignorando as exigências de directrizes do PBF, e reduzindo os custos para terapias Cell-Based.

A dissociação mecânica dos lipoaspirados manuais resultou na produção de tecido adiposo microfragmentado (MAT), constituído por um agregado de adipócitos envolvendo uma rede microvascular (Figura 3). A análise da imunofluorescência da esteira gelatina-encaixada e cryofixed destaca esta estrutura, mostrando a rede vascular marcada pelo receptor da pilha endothelial Ulex europaeus aglutinina 1 (UEA-1) que consiste principalmente em pequenos, vasos capi...

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Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

Aqui, nós apresentamos o tecido adiposo humano microfragmentação enzima-livre usando um dispositivo fechado do sistema. Este novo método permite a obtenção de aglomerados de submilímetro de tecido adiposo adequado para transplante in vivo, cultura in vitro e maior isolamento e caracterização celular.

Micro-fragmentação do tecido adiposo humano para a caracterização do Phenotyping e do Secretome da pilha

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Usando este sistema, podemos coletar os aglomerados submeímetros de tecido adiposo humano, no qual todo o microambiente de células regenerativas está intacto. Todo o sistema microvascular também está intacto, e assim podemos usar esse tipo de micro órgãos para transplante in-vivo para cultura in vitro e para isolamento celular para caracterização posterior. A principal justificativa para o uso do sistema no laboratório de pesquisa é que o processo é totalmente livre de enzimas, e por isso permite o processamento rápido e eficiente do tecido adiposo humano mantendo uma microarcização e será a microvasculatura do tecido totalmente intacta.E assim podemos estudar diretamente um produto de terapia celular que já se mostrou muito útil na clínica. Esta tecnologia de sistema fechado é uma técnica de fácil utilização para colheita, processamento e reinjeção de tecido adiposo refinado intraoperatório, e pode ser aplicada com sucesso em ortopedia cosmética, proctologia e também ginecologia. Este método permite um estudo mais aprofundado do impacto da gordura na regeneração tecidual.O procedimento será demonstrado por Bianca Vezzani, bolsista de pós-doutorado e por Mario Gomez-Salazar, que é doutorando. Trabalhando em condições assépticas dentro de 16 horas após a colheita, coloque a amostra de abdominoplastia em cima de um pano cirúrgico com a pele voltada para cima. Use uma cânula de infiltração de tecido descartável para injetar de 50 a 100 mililitros de 37 graus Celsius 0,9% de solução de cloreto de sódio no tecido adiposo subcutâneo.Conecte uma seringa de bloqueio Luer de 10 mililitros a uma cânula de lipoaspiração descartável e agarrando a amostra na região cutânea perto de uma borda da amostra, introduza cuidadosamente a cânula no tecido adiposo. Uma vez que a cânula esteja dentro do tecido, extraia o êmbolo e mova a cânula radialmente dentro da amostra de tecido adiposo. É importante manusear o tecido adiposo firmemente durante a lipo-aspiração.Se não for coletada gordura suficiente, considere realizar uma injeção salina adicional. Quando a seringa estiver cheia de lipo-aspirado, remova cuidadosamente a cânula do tecido e substitua toda a seringa por uma nova seringa vazia até que um total de 60 mililitros de aspiração tenha sido colhida. Para microfracro da lipo-aspirada, remova o dispositivo da embalagem e verifique se a unidade principal está conectada ao saco de resíduos.Coloque o saco de coleta de lixo no chão e certifique-se de que as válvulas estejam presas às tampas da unidade de processo. Fure a porta de conexão do saco para conectar o pico terminal da linha de entrada ao saco salino e posicione o saco salino mais alto que a unidade de processamento. Verifique se todos os cinco grampos conectados aos tubos dos circuitos estão abertos, coloque a unidade de processamento em posição vertical, permita que a solução salina preencha a unidade de processamento e confirme que o fluxo atinge o saco de resíduos.Agite a unidade de processamento para remover quaisquer bolhas de ar e coloque a unidade em uma posição vertical com a tampa azul voltada para cima. Feche o grampo ao lado da linha de entrada e conecte uma seringa de lipo-aspirado à válvula de auto-ocluante da tampa de entrada azul para começar a injetar o lipo-aspirado. Mantendo a unidade de processamento vertical, empurre lentamente para baixo o êmbolo da seringa até que todo o lipo-aspirado tenha sido transferido para a unidade.Quando toda a lipo-aspirada tiver sido injetada, abra o grampo de entrada para restaurar o fluxo salino e agite vigorosamente a unidade de processamento por pelo menos dois minutos, verificando regularmente o fluxo da solução salina no saco de resíduos. Quando a solução salina na unidade de processamento ficar transparente, coloque a unidade com a tampa cinza para cima e feche os grampos localizados no ralo perto das tampas azul e cinza. O tecido processado flutuará no topo.Em seguida, encha uma seringa de bloqueio Luer de 10 mililitros com solução salina e conecte a seringa à válvula de carregamento da tampa azul. Conecte uma seringa de bloqueio Luer vazia de 10 mililitros com o êmbolo completamente inserido na válvula da tampa cinza. Injete firmemente o soro fisiológico na unidade de processamento a partir da tampa azul, verificando se a seringa conectada à válvula cinza está, consequentemente, sendo preenchida com o tecido processado.Quando toda a solução salina tiver sido injetada, remova cuidadosamente ambas as seringas e repita a infusão salina até que todo o tecido processado tenha sido coletado. No final do processamento, remova todas as seringas, feche todos os grampos, retire o saco salino e descarte o dispositivo de acordo com os protocolos locais. Quando todo o tecido processado tiver sido coletado, transfira o tecido adiposo micro-fragmentado para um recipiente estéril e adicione um volume igual de meio de digestão ao recipiente.Coloque o recipiente selado em um banho de água tremendo de 37 graus Celsius, definido para 120 rotações por minuto durante 45 minutos, parando a digestão com um volume igual de solução de bloqueio no final da incubação. Filtrar sequencialmente a amostra, primeiro através de um filtro de célula de 100 micrômetros seguido de filtração através de um coador de células de 70 micrômetros e centrífugas da suspensão filtrada por cinco minutos a 200 vezes g. Suspendemos a pelota em aproximadamente 5 mililitros de tampão de eritrócito por 15 minutos em temperatura ambiente.Pare a lise com um volume igual de solução de bloqueio e filtre a solução através de um filtro de célula de 40 micrômetros. Em seguida, colete as células teciduais de adiposos micro-fragmentadas por centrifugação e suspendemos a pelota em solução de bloqueio fresco com mistura de farinha para contar. Após a dissociação e a coloração de anticorpos, células de gordura micro-fragmentadas podem ser levadas ao citômetro de fluxo para análise celular e/ou triagem.A dissociação mecânica de lipo-aspirados manuais resulta na produção de tecido adiposo micro-fragmentado que consiste em um agregado de adipócitos envolvendo uma rede microvascular. A análise da imunofluorescência da gelatina embutida no tecido adiposo micro-fragmentado criofixado destaca a estrutura, mostrando a rede vascular marcada pelo marcador celular endotelial Ulex Europaeus Agglutinin 1 receptor e consistindo principalmente de pequenos vasos capilares. Notavelmente, pericítes expressando antígeno neuron-glial 2 ou receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas beta são normalmente distribuídos, ensheathing células endoteliais.Excluindo células endoteliais positivas CD31 e CD45 positivas, a presença de células cancerígenas negativas CD146 e CD146 negativos e CD34 podem ser identificadas dentro do MAT. A lipo-aspiração manual é uma parte crítica do procedimento e deve ser realizada em condições estéreis não mais do que 16 horas após a abdominoplastia. O tecido adiposo micro-fragmentado pode ser processado por coloração imunohistoquímica, cultura in vitro ou análise secretame para obter uma visão mais profunda sobre a biologia do tecido adiposo.Esta técnica permite o estudo de diversos tecidos em seu arranjo natural, nativo, tridimensional como uma espécie de organoides pequenos, que são pequenos o suficiente para serem transplantados em camundongos ou para serem mantidos em cultura de longo prazo. E usamos esse sistema principalmente para abordar experimentalmente os diferentes microambientes específicos de órgãos. Nossos doadores de tecido adiposo não são conhecidos como portadores de infecções transmissíveis.No entanto, na ausência de qualquer triagem adicional, todos os tecidos humanos devem ser considerados como potencialmente contaminados e manuseados em conformidade.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biologia

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Enriquece o rendimento de melanócitos humanos de tecidos de pele adultos

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Explorando estrutura tecidual adiposa por limpeza de metilsalicylate e imagem 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...