Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Клэр Крайер и Фиону Росси из Эдинбургского университета за экспертную помощь в цитометрии потока. Мы также хотели бы поблагодарить персонал больницы Мюррейфилд, который внес свой вклад, предоставив образцы тканей.
Эта работа была поддержана грантами Британского фонда сердца и Lipogems, которые поставляли комплекты для обработки жировой ткани. Образцы тканей взрослых людей были закуплены с полным разрешением этики Комитета по этике исследований юго-восточной Шотландии (справка: 16/SS/0103).

Этическое разрешение на использование человеческих тканей в этом исследовании было получено от Комитета по этике исследований юго-восточной Шотландии (справка: 16/SS/0103).
1. Подкожный брюшной жировой ткани Коллекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Все приборы, использу?...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

В этой статье описывается физическое фракционирование, с помощью закрытого системного устройства, жировой ткани человека в небольшие кластеры, демонстрирующие нормальную микроанатомию жировой ткани.
Вручную аспирированные человеческие подкожные жировые ткани и соле?...

Адипоза ткани, давно используется в качестве наполнителя в реконструктивной и косметической хирургии, в последнее время стал более популярным в регенеративной медицине, когда-то признан в качестве источника мезенхимальных стволовых клеток (MSCs)1. Lipoaspirates диссоциированных ферментативно в одноклеточных суспензий дают адипоцитов свободной стромальной сосудистой фракции (SVF), который используется без изменений в пациента или, чаще всего, культивируется в течение нескольких недель в MSCs2.
Тем не менее, диссоциация ферментов разрывает микроокружение тканей, уединяя соседние регулятивные клетки от предполагаемых регенеративных клеток, которые значительно модифицируются культурой in vitro. Чтобы избежать таких экспериментальных артефактов и последующим функциональным изменениям, были предприняты попытки обработать жировую ткань для терапевтического использования, сохраняя при этом свою родную конфигурацию как можно более нетронутой3,4. Примечательно, что нарушение механической ткани начало заменять ферментативную диссоциацию. С этой целью полное погружение закрытой системы микрофрагментов липоаспирируется в субмиллиметр, кровь и безмасляные тканевые кластеры (например, липогемы) через последовательность фильтрации сито и стального мрамора, индуцированного нарушения3. Автологическая трансплантация микрофрагментированной жировой ткани, используя эту технологию замкнутой системы, была успешной в нескольких показаниях, охватывающих косметику, ортопедию, проктологию и гинекологию4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Сравнение микрофрагментированной жировой ткани человека (MAT), полученной с помощью закрытого системного устройства и изогенного SVF, показало, что в отношении распределения сосудистых/стромальных клеток и секреторной активности в культуре, MAT содержит больше перицитов, которые предполагаемых MSCs14, и выделяет более высокое количество факторов роста и цитокинов15.
В настоящей статье иллюстрируется безферментно-микрофрагментация подкожной жировой ткани человека с помощью закрытого системного устройства, а также дальнейшая обработка такой микронизированной жировой ткани для культуры пробирки, иммуногистохимии и анализа FACS, для того, чтобы определить типы клеток настоящее время и растворимые факторы выделяются (Рисунок 1). Описанный метод безопасно генерирует жировые производные субмиллиметровые органоиды, содержащие жизнеспособные популяции адиповых клеток ткани в нетронутой нише, пригодных для дальнейшего применения и исследований.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

В последнее десятилетие, жировые пересадки тканей были широко использованы в пластической хирургии и ортопедии для повышения истощения тканей и / или регенерации. Соответственно, методы сбора и обработки жировой ткани человека эволюционировали для того, чтобы быстро и эффективно получать большое количество тканей. Среди них технология закрытой системы представляет собой инновационную и простую в использовании систему сбора, обработки и повторной инъекции рафинированной жировой ткани за короткое время и в рамках того же вмешательства (внутриоперативно). Адипоза собирается путем липосакции, промывают, эмульгируют, промывают и измельчаются механически в клеточные кластеры от 0,3 до 0,8 мм. Автологическая трансплантация механически фрагментированной жировой ткани показала замечательную эффективность в различных терапевтических кластерах такие показания, как эстетической медицины и хирургии, ортопедической и общей хирургии. Характеристика микрофрагментированной жировой ткани выявила наличие нетронутых мелких сосудов в адипоцитных кластерах; следовательно, периваскулярная ниша остается невозмутимым. Эти кластеры обогащаются в периваскулярных клетках (т.е. предках мезенхимальных стволовых клеток (MSC) и in vitro анализ показал повышенное высвобождение факторов роста и цитокинов, участвующих в восстановлении и регенерации тканей, по сравнению с ферментативно полученными МСК. Это говорит о том, что превосходный терапевтический потенциал микрофрагментированной жировой ткани объясняется более высокой частотой предполагаемых МСК и повышенной секреторной активностью. Вносят ли эти добавленные перициты непосредственно более высокий фактор роста и производство цитокинов, неизвестно. Эта клинически утвержденная процедура позволяет трансплантации предполагаемых MSCs без необходимости расширения и / или ферментативного лечения, таким образом, в обход требований Руководящих принципов GMP, и снижение расходов на клеточной терапии.

Механическая диссоциация ручных липоаспират, приведшая к выработке микрофрагментированной жировой ткани (МАТ), состоящей из агрегата адипоцитов, окутывающих микрососудистую сеть(рисунок 3). Иммунофлуоресценция анализ желатин-встроенных и криофиксир...

Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

Здесь мы представляем микрофрагментацию жировой ткани человека без микрофрагментации с помощью закрытого системного устройства. Этот новый метод позволяет получить субмиллиметровые кластеры жировой ткани, пригодные для трансплантации in vivo, культуры in vitro, а также дальнейшей изоляции клеток и характеристик.

Человек жировой ткани микро-фрагментации для клеточного фенотипирования и секретома характеристики

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Используя эту систему, мы можем собирать субмиллиметровые скопления жировой ткани человека, в которых цела вся микроокантиния регенеративных клеток. Вся микрососудистая система также не повреждена, и поэтому мы можем использовать такого рода микроохвасти для трансплантации in-vivo для экстракорпорального развития культуры и для изоляции клеток для дальнейшей характеристики. Основным обоснованием использования системы в исследовательской лаборатории является то, что этот процесс полностью без ферментов, и поэтому он позволяет быстрой и эффективной обработки жировой ткани человека при сохранении микро-архитектуры, и это будет микроваскулярно ткани полностью нетронутыми.И поэтому мы можем непосредственно изучить клеточный продукт терапии, который оказался уже очень полезным в клинике. Эта технология закрытой системы является простым в использовании методом для сбора урожая, обработки и повторной инъекции рафинированной жировой ткани внутриоперационной, и может быть успешно применена в косметике ортопедии, проктологии, а также гинекологии. Этот метод позволяет продолжить изучение влияния жира на регенерацию тканей.Процедура будет продемонстрирована Бьянка Vezzani, аспирант и Марио Гомес-Салазар, который является аспирантом. Работая в асептических условиях в течение 16 часов после сбора урожая, поместите образец абдоминопластики поверх хирургической ткани с кожей вверх. Используйте одноразовую канюлю инфильтрации тканей, чтобы ввести 50-100 миллилитров 37 градусов по Цельсию 0,9% раствор хлорида натрия в подкожной жировой ткани.Подключите 10-миллилитровый шприц luer lock к одноразовой липосакционной канюле и схвяв образец в кижной области вблизи края образца, аккуратно ввяйте канюлю в жировую ткань. После того, как канюла находится внутри ткани, извлечь поршень и переместить канюлю радиально в образец жировой ткани. Важно, чтобы справиться с жировой ткани твердо во время липо-аспирации.Если не хватает жира собирается, рассмотреть вопрос о выполнении дополнительных солевые инъекции. Когда шприц полон липо-аспирата, тщательно удалить канюлю из ткани и заменить полный шприц с новым пустым шприцем, пока в общей сложности 60 миллилитров аспирата был собран. Для микро-фрагментации липо-аспирата удалите устройство из упаковки и убедитесь, что основной блок подключен к мешою отходов.Поместите мешок для сбора отходов на землю и убедитесь, что клапаны закреплены на колпачках процесса. Пирс мешок соединения порта для подключения терминала всплеск входной линии в солевой мешок и положение солевой мешок выше, чем процессинговый блок. Убедитесь, что все пять зажимов, подключенных к трубам цепей, открыты, поместите процессинговый блок в вертикальное положение, позвольте солевым раствором заполнить блок обработки и подтвердите, что поток достигает мешка отходов.Встряхните блок обработки, чтобы удалить любые пузырьки воздуха и поместите устройство в вертикальное положение с синей крышкой, обращенной вверх. Закройте зажим рядом с входной линией и соедините шприц липо-аспирата с самоохожающий клапан синей входной крышки, чтобы начать вводить липо-аспират. Сохраняя вертикальный блок обработки, медленно нажимаем вниз на поршень шприца до тех пор, пока весь липо-аспират не будет передан в устройство.Когда все липо-аспират был введен, откройте входной зажим для восстановления солевого потока и энергично встряхнуть процессинговый блок, по крайней мере две минуты, регулярно проверяя солевой раствор потока в мешок отходов. Когда солевой раствор в блоке обработки становится прозрачным, поместите устройство с серой крышкой вверх и закройте зажимы, расположенные на стоке рядом с синими и серыми колпачками. Обработанная ткань будет плавать в верхней части.Затем заполните 10-миллилитровый шприц Luer lock солевым раствором и соедините шприц с погрузочным клапаном синей крышки. Подключите пустой 10-миллилитр Luer блокировки шприц с поршень полностью вставляется в клапан серой крышкой. Твердо ввините солевой раствор в процессинговый блок из синей крышки, проверяя, что шприц, подключенный к серой клапану, следовательно, заполняется обработанной тканью.Когда все солевой раствор был введен, тщательно удалить оба шприца и повторить солевой настой, пока все обработанные ткани были собраны. В конце обработки удалите все шприцы, закройте все зажимы, отсоедините солевой мешок и утилизировать устройство в соответствии с местными протоколами. Когда все обработанные ткани были собраны, передать микро-фрагментированных жировой ткани в стерильный контейнер, и добавить равный объем пищеварения среды в контейнер.Поместите запечатанный контейнер в 37 градусов по Цельсию встряхивая водяной бане, установить до 120 оборотов в минуту в течение 45 минут, останавливая пищеварение с равным объемом блокирующего раствора в конце инкубации. Последовательно фильтровать образец, сначала через 100 микрометровый ситечко клетки следуют фильтрации через 70 микрометровых клеток ситечко и центрифуги фильтрованной подвески в течение пяти минут при 200 раз g. Мы приостанавливаем гранулы примерно в 5 миллилитров буфера лиза эритроцитов в течение 15 минут при комнатной температуре.Остановите лиз с равным объемом блокирующего раствора и отфильтруйте раствор через 40-метровый клеточный ситечко. Затем соберите микро-фрагментированные клетки жировой ткани путем центрифугации, и мы приостанавливаем гранулы в свежем блокирующего растворе с мукой-смешиванием для подсчета. После диссоциации и окрашивания антителами, микро-фрагментированные жировые клетки могут быть доставлены в цитометр потока для анализа клеток и/или сортировки.Механическая диссоциация ручных липоаспиратов приводит к выработке микрофузной жировой ткани, которая состоит из совокупности адипоцитов, окутывающих микрососудикулярную сеть. Иммунофлюоресценция анализа желатина встроенных в криофиксированных микро-фрагментированных жировой ткани подчеркивает структуру, показывая сосудистой сети отмечены эндотелиальной клеточной маркер Ulex Europaeus Agglutinin 1 рецептор и в основном состоит из небольших капиллярных как сосуды. Примечательно, что перициты, выражаюющие нейронно-глиальный антиген 2 или бета-рецептор фактора роста, получаемый тромбоцитами, обычно распространяются, окутая эндотелиальные клетки.Исключая CD31 положительные эндотелиальные и CD45 положительные гематопоэтические клетки, наличие CD146 положительных CD34 отрицательных перицитов и CD146 отрицательных и CD34 положительных адвентитиальных клеток могут быть определены в рамках MAT. Ручная липо-аспирации является важной частью процедуры и должна быть выполнена в стерильных условиях не более чем через 16 часов после абдоминопластики. Микро-фрагментированные жировой ткани могут быть дополнительно обработаны иммуногистохимического окрашивания, в пробирке культуры или секретом анализа, чтобы получить более глубокое понимание биологии жировой ткани.Этот метод позволяет изучать различные ткани в их естественном, родном, трехмерном расположении как своего рода небольшие органоиды, которые достаточно малы, чтобы быть пересаженными у мышей или поддерживаться в долгосрочной культуре. И мы используем эту систему главным образом для экспериментального подхода к различным микроокнониям, специфичным для органов. Наши доноры жировой ткани не известны как носители трансмиссивных инфекций.Однако при отсутствии какого-либо дальнейшего скрининга все человеческие ткани следует рассматривать как потенциально загрязненные и обработанные соответствующим образом.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Актина сотрудничества седиментации Пробирной; для анализа связывание белка с F-актин

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Выделение митохондрий из минимальных количествах мыши скелетных мышц для измерения Высокая пропускная микропланшетов дыхания

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

ADIPO ясно: Ткани, очистка метод для трехмерных изображений жировой ткани

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Визуализация 3D белой жировой ткани структуры, с помощью окрашивания целом гора

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 обогащает урожайность меланоцитов человека из тканей кожи взрослого человека

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Изучение структуры жировой ткани путем очистки метилсалицилата и 3D-изображения

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Выделение, характеристика и терапевтическое применение внеклеточных везикул из культивируемых мезенхимальных стволовых клеток человека

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Выделение и идентификация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани крыс породы Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Полуавтоматическое выделение стромально-васкулярной фракции из белой жировой ткани мыши с помощью тканевого диссоциатора

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...