Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
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Los autores desean agradecer a Claire Cryer y Fiona Rossi de la Universidad de Edimburgo por su asistencia experta en citometría de flujo. También queremos dar las gracias al personal del hospital Murrayfield que contribuyó proporcionando especímenes de tejido.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la British Heart Foundation y Lipogems, que suministraban kits de procesamiento de tejido adiposo. Las muestras de tejido súbditos humanos se adquirieron con el pleno permiso de ética del Comité de ética de investigación del sureste de Escocia (referencia: 16/SS/0103).

La aprobación ética para el uso de tejidos humanos en esta investigación se obtuvo del Comité de ética de investigación del sureste de Escocia (referencia: 16/SS/0103).
1. Colección de tejido adiposo abdominal subcutáneo
NOTA: Todos los instrumentos utilizados en el procedimiento de lipoaspiración manual son proporcionados por el fabricante del dispositivo de microfragmentación.
<ol><li>Mantenga la esterilidad para todos los fluidos, rec...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

Este artículo describe el fraccionamiento físico, utilizando un dispositivo de sistema cerrado, de tejido adiposo humano en pequeños grupos que muestran la microanatomía normal del tejido adiposo.
El tejido adiposo subcutáneo humano aspirado manualmente y la solución salina se cargan en un cilindro de plástico transparente que contiene grandes esferas metálicas al estilo pinball que, tras el vigoroso temblor manual del dispositivo, rompen la grasa en submilimetro Fragmentos. Los filtro...

El tejido adiposo, utilizado durante mucho tiempo como relleno en cirugía reconstructiva y estética, se ha vuelto recientemente más popular en la medicina regenerativa una vez reconocida como una fuente de células madre mesenquimales (MSC)1. Los lipoaspirados disociados disociados enzimáticamente en suspensiones de una sola célula producen una fracción vascular estromal libre de adipocitos (SVF) que se utiliza inalterada en el paciente o, más comúnmente, se cultiva durante varias semanas en los MSC2.
Sin embargo, la disociación enzimática rompe los microambientes tisulares, asegurando las células reguladoras vecinas de células regenerativas presuntivas que se modifican considerablemente por el cultivo in vitro. Para evitar tales artefactos experimentales y las consiguientes alteraciones funcionales, se han intentado procesar el tejido adiposo para uso terapéutico manteniendo intacta su configuración nativa como posible3,4. En particular, la interrupción mecánica del tejido ha comenzado a reemplazar la disociación enzimática. Con este fin, los microfragmentos de sistema cerrado de inmersión completa lipoaspirados en racimos de tejido submilimétrico, libre de sangre y aceite (por ejemplo, Lipogems) a través de una secuencia de filtración de tamiz y alteración inducida por mármol de acero3. El trasplante autólogo de tejido adiposo microfragmentado, utilizando esta tecnología de sistema cerrado, ha tenido éxito en múltiples indicaciones, abarcando cosméticos, ortopedia, proctología y ginecología4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
La comparación entre el tejido adiposo microfragmentado humano (MAT) obtenido con el dispositivo del sistema cerrado y el SVF isogénico reveló que con respecto a la distribución de células vasculares/estromales y la actividad secretora en el cultivo, MAT contiene más pericitas, que son presuntos MSCs14, y secreta mayores cantidades de factores de crecimiento y citoquinas15.
El presente artículo ilustra la microfragmentación libre de enzimas del tejido adiposo subcutáneo humano utilizando un dispositivo de sistema cerrado, y el procesamiento posterior de dicho tejido adiposo micronizado para cultivo in vitro, inmunohistoquímica y análisis FACS, para identificar los tipos de células presentes y los factores solubles secretados(Figura 1). El método descrito genera de forma segura organoides submilimétricos derivados de adiposoques que contienen poblaciones viables de células de tejido adiposo en un nicho intacto, adecuado para aplicaciones y estudios adicionales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

En la última década, los trasplantes de tejido adiposo se han utilizado ampliamente en cirugía plástica y ortopedia para mejorar el agotamiento y/o regeneración de tejidos. En consecuencia, las técnicas para cosechar y procesar el tejido adiposo humano han evolucionado con el fin de obtener rápida y eficientemente grandes cantidades de tejido. Entre ellos, la tecnología de sistema cerrado representa un sistema innovador y fácil de usar para cosechar, procesar y reinyectar tejido graso refinado en poco tiempo y en la misma intervención (intraoperatoriamente). El tejido adiposo se recoge mediante liposucción, lavado, emulsionado, enjuagado y picado mecánicamente en grupos celulares de 0,3 a 0,8 mm. El trasplante autólogo de tejido adiposo fragmentado mecánicamente ha demostrado una eficacia notable en diferentes grupos terapéuticos indicaciones como medicina estética y cirugía, cirugía ortopédica y general. La caracterización del tejido adiposo microfragmentado reveló la presencia de pequeños vasos intactos dentro de los cúmulos de adipocitos; por lo tanto, el nicho perivascular se deja imperturbado. Estos cúmulos se enriquecen en células perivasculares (es decir, ancestros de células madre mesenquimales (MSC)) y el análisis in vitro mostró una mayor liberación de factores de crecimiento y citoquinas implicadas en la reparación y regeneración de tejidos, en comparación con los MSC derivados enzimáticamente. Esto sugiere que el potencial terapéutico superior del tejido adiposo microfragmentado se explica por una mayor frecuencia de LOS CONE presuntivos y una mayor actividad secretora. No se sabe si estos pericitas añadidos contribuyen directamente a un mayor factor de crecimiento y a la producción de citoquinas. Este procedimiento clínicamente aprobado permite el trasplante de MSC presuntivas sin necesidad de expansión y/o tratamiento enzimático, evitando así los requisitos de las directrices GMP, y reduciendo los costos de las terapias basadas en células.

La disociación mecánica de lipoaspirados manuales dio lugar a la producción de tejido adiposo microfragmentado (MAT), que consiste en un agregado de adipocitos que envuelven una red microvascular(Figura 3). El análisis de inmunofluorescencia de la MAT incrustada en gelatina y criofijada destaca esta estructura, mostrando la red vascular marcada por el receptor Ulex europaeus aglutinina 1 (UEA-1) compuesto principalmente por pequeños vasos capilares ( <st...

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Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

Aquí, presentamos microfragmentación libre de enzimas del tejido adiposo humano utilizando un dispositivo de sistema cerrado. Este nuevo método permite la obtención de racimos submilimétricos de tejido adiposo adecuado para el trasplante in vivo, el cultivo in vitro y el aislamiento y caracterización celular adicional.

Microfragmentación de tejido adiposo humano para fenotipado celular y caracterización de secretos

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Usando este sistema, podemos recoger los racimos submilimétricos de tejido adiposo humano, en el que todo el microambiente de las células regenerativas está intacto. Todo el sistema microvascular también está intacto, por lo que podemos utilizar este tipo de micro órganos para el trasplante in vivo para el cultivo in vitro y para el aislamiento celular para una mayor caracterización. La razón principal para el uso del sistema en el laboratorio de investigación es que el proceso es totalmente libre de enzimas, por lo que permite el procesamiento rápido y eficiente del tejido adiposo humano manteniendo una microarquitectura y será la microvasculatura del tejido totalmente intacto.Y así podemos estudiar directamente un producto de terapia celular que ha demostrado ser ya muy útil en la clínica. Esta tecnología de sistema cerrado es una técnica fácil de usar para la cosecha, procesamiento y reinyección de tejido graso refinado intraoperatorio, y se puede aplicar con éxito en la ortopedia cosmética, la proctología y también la ginecología. Este método permite un mayor estudio del impacto de la grasa en la regeneración tisular.El procedimiento será demostrado por Bianca Vezzani, becaria postdoctoral y por Mario Gómez-Salazar, quien es estudiante de doctorado. Trabajando en condiciones asépticas dentro de las 16 horas de la cosecha, coloque la muestra de abdominoplastia encima de un paño quirúrgico con la piel hacia arriba. Utilice una cánula de infiltración de tejido desechable para inyectar de 50 a 100 mililitros de solución de cloruro sódico de 37 grados Celsius 0,9% en el tejido adiposo subcutáneo.Conecte una jeringa de bloqueo Luer de 10 mililitros a una cánula de liposucción desechable y agarre la muestra en la región cutánea cerca de un borde de la muestra, introduzca cuidadosamente la cánula en el tejido adiposo. Una vez que la cánula está dentro del tejido, extraiga el émbolo y mueva la cánula radialmente dentro de la muestra de tejido adiposo. Es importante manejar el tejido adiposo firmemente durante la lipo-aspiración.Si no se recoge suficiente grasa, considere la posibilidad de realizar una inyección de solución salina adicional. Cuando la jeringa esté llena de lipo-aspirado, retire cuidadosamente la cánula del tejido y reemplace la jeringa completa con una jeringa vacía nueva hasta que se hayan cosechado un total de 60 mililitros de aspirado. Para la micro-fragmentación del lipo-aspirado, retire el dispositivo del paquete y verifique que la unidad principal esté conectada a la bolsa de residuos.Coloque la bolsa de recogida de residuos en el suelo y asegúrese de que las válvulas estén fijadas a las tapas de la unidad de proceso. Perfore el puerto de conexión de la bolsa para conectar el pico de terminal de la línea de entrada a la bolsa salina y coloque la bolsa salina por encima de la unidad de procesamiento. Compruebe que las cinco abrazaderas conectadas a los tubos de los circuitos estén abiertas, coloque la unidad de procesamiento en una posición vertical, permita que la solución salina llene la unidad de procesamiento y confirme que el flujo llega a la bolsa de residuos.Agitar la unidad de procesamiento para eliminar las burbujas de aire y colocar la unidad en una posición vertical con la tapa azul hacia arriba. Cierre la abrazadera junto a la línea de entrada y conecte una jeringa de lipoexpesado a la válvula autoroclusa de la tapa de entrada azul para comenzar a inyectar el lipoexpeto. Manteniendo la unidad de procesamiento vertical, empuje lentamente hacia abajo el émbolo de la jeringa hasta que todo el lipo-aspirado se haya transferido a la unidad.Cuando se haya inyectado todo el lipo-aspirado, abra la abrazadera de entrada para restaurar el flujo salino y agitar vigorosamente la unidad de procesamiento durante al menos dos minutos, comprobando regularmente el flujo de la solución salina en la bolsa de residuos. Cuando la solución salina de la unidad de procesamiento se vuelva transparente, coloque la unidad con la tapa gris hacia arriba y cierre las abrazaderas situadas en el drenaje cerca de las tapas azules y grises. El tejido procesado flotará en la parte superior.A continuación, llene una jeringa luer de 10 mililitros con solución salina y conecte la jeringa a la válvula de carga de la tapa azul. Conecte una jeringa de bloqueo Luer de 10 mililitros vacía con el émbolo completamente insertado a la válvula de la tapa gris. Inyecte firmemente la solución salina en la unidad de procesamiento desde la tapa azul, comprobando que la jeringa conectada a la válvula gris se está llenando con el tejido procesado.Cuando se haya inyectado toda la solución salina, retire cuidadosamente ambas jeringas y repita la perfusión salina hasta que se haya recogido todo el tejido procesado. Al final del procesamiento, retire todas las jeringas, cierre todas las abrazaderas, desenganche la bolsa salina y deseche el dispositivo de acuerdo con los protocolos locales. Cuando se haya recogido todo el tejido procesado, transfiera el tejido adiposo microdes fragmentado a un recipiente estéril y agregue un volumen igual de medio de digestión al recipiente.Coloque el recipiente sellado en un baño de agua agitado de 37 grados Celsius, establecido en 120 rotaciones por minuto durante 45 minutos, deteniendo la digestión con un volumen igual de solución de bloqueo al final de la incubación. Filtrar secuencialmente la muestra, primero a través de un colador celular de 100 micrómetros seguido de filtración a través de un colador celular de 70 micrómetros y centrifugar la suspensión filtrada durante cinco minutos a 200 g. Suspendemos el pellet en aproximadamente 5 mililitros de tónimero de eritrocitos durante 15 minutos a temperatura ambiente.Detenga la lelisis con un volumen igual de solución de bloqueo y filtre la solución a través de un colador celular de 40 micrómetros. A continuación, recoger las células de tejido adiposo micro-fragmentados por centrifugación y suspendemos el pellet en solución de bloqueo fresco con mezcla de harina para el recuento. Después de la disociación y la tinción de anticuerpos, las células grasas micro-fragmentadas se pueden llevar al citómetro de flujo para el análisis celular y / o clasificación.La disociación mecánica de los lipo-aspirados manuales da como resultado la producción de tejido adiposo micro-fragmentado que consiste en un agregado de adipocitos que envuelven una red microvascular. El análisis de inmunofluorescencia de gelatina incrustada en tejido adiposo micro-fragmentado criofijo resalta la estructura, mostrando la red vascular marcada por el marcador celular endotelial Ulex Europaeus Agglutinin 1 receptor y que consiste principalmente en pequeños vasos capilares. En particular, pericitos que expresan antígeno neuro-glial 2 o receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas se distribuyen normalmente, envainando las células endoteliales.Al excluir las células hematopoyéticas cd31 positivas y CD45 positivas, la presencia de per pericitos negativos CD34 positivos CD146 y células adventitiales CD146 negativas y CD34 positivas se pueden identificar dentro de la MAT. El tejido adiposo micro fragmentado puede ser procesado posteriormente por tinción inmunohistoquímica, cultivo in vitro o análisis secretoma para obtener una visión más profunda de la biología del tejido adiposo.Esta técnica permite el estudio de diversos tejidos en su disposición natural, nativa y tridimensional como una especie de pequeños organoides, que son lo suficientemente pequeños como para ser trasplantados en ratones o para ser mantenidos en cultivos a largo plazo. Y utilizamos este sistema principalmente para abordar experimentalmente los diferentes microambientes específicos del órgano. Nuestros donantes de tejido adiposo no se conocen como portadores de infecciones transmisibles.Sin embargo, en ausencia de cualquier otro cribado, todos los tejidos humanos deben considerarse potencialmente contaminados y manipularse en consecuencia.

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Investigación

Biología

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 enriquece el rendimiento de los melanocitos humanos de los tejidos adultos de la piel

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Aislamiento, caracterización y aplicación terapéutica de vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales humanas cultivadas

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...