Name: human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization
Uploaded: 2019-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

Författarna vill tacka Claire Cryer och Fiona Rossi vid universitetet i Edinburgh för deras experthjälp med Flow cytometry. Vi vill också tacka Personalen på Murrayfield Hospital som bidrog genom att tillhandahålla vävnadsprover.
Detta arbete stöddes av bidrag från British Heart Foundation och Lipogems, som levererade fettvävnad bearbetning kit. Prover på human vävnad från vuxna har anskaffats med full etik behörighet från forskningsetiska kommittén i sydöstra Skottland (referens: 16/SS/0103).

Etiska godkännanden för användning av mänskliga vävnader i denna forskning erhölls från South East Scotland Research etik Committee (referens: 16/SS/0103).
1. subkutan Bukfettvävnad insamling
Anmärkning: Alla instrument som används i manuell Lipo-aspiration förfarande tillhandahålls av tillverkaren av mikro-fragmentering enhet.
<ol><li>Behåll sterilitet för alla vätskor, behållare, instrument och det operativa området under hela e...

<ol>
	<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Sch&#228;ffler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose+tissue-derived+stromal+cells-basic+and+clinical+implications+for+novel+cell-based+therapies.">Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.</a> Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non+enzymatic+method+and+device+to+obtain+a+fat+tissue+derivative+highly+enriched+in+pericyte-like+elements+by+mild+mechanical+forces+from+human+lipoaspirates.">A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates.</a> Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).</li><li>Raffaini, M., Tremolada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+fractured+and+purified+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+can+improve+the+orthognathic+surgery+outcomes+both+aesthetically+and+in+postoperative+healing.">Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing.</a> CellR4. 2 (4), (2014).</li><li>Cestaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersphincteric+anal+lipofilling+with+micro-fragmented+fat+tissue+for+the+treatment+of+faecal+incontinence:+preliminary+results+of+three+patients.">Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients.</a> Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).</li><li>Fantasia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+and+purified+adipose+tissue+(Lipogems+system)+injections+for+treatment+of+atrophic+vaginitis.">Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis.</a> Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).</li><li>Saibene, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnasal+endoscopic+microfractured+fat+injection+in+glottic+insufficiency.">Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency.</a> B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).</li><li>Giori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+function+in+anal+incontinence+after+micro-fragmented+fat+graft+(Lipogems)+injection:+two+years+follow+up+of+the+first+5+cases.">Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases.</a> CellR4. 3 (2), (2015).</li><li>Tremolada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mesenchymal+stem+cells+and+regenerative+adipose+tissue+graft+(Lipogems)+for+musculoskeletal+regeneration.">Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration.</a> European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).</li><li>Striano, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-responsive+knee+pain+with+osteoarthritis+and+concurrent+meniscal+disease+treated+with+autologous+micro-fragmented+adipose+tissue+under+continuous+ultrasound+guidance.">Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance.</a> CellR4. 3 (5), (2015).</li><li>Randelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems+product+treatment+increases+the+proliferation+rate+of+human+tendon+stem+cells+without+affecting+their+stemness+and+differentiation+capability.">Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li><li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipogems,+a+new+modality+off+at+tissue+handling+to+enhance+tissue+repair+in+chronic+hind+limb+ischemia.">Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia.</a> CellR4. 2 (6), (2014).</li><li>Benzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfractured+lipoaspirate+may+help+oral+bone+and+soft+tissue+regeneration:+a+case+report.">Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report.</a> CellR4. 3 (3), (2015).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).</li><li>Vezzani, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+pericyte+content+and+secretory+activity+of+micro-fragmented+human+adipose+tissue+compared+to+enzymatically+derived+stromal+vascular+fraction.">Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).</li><li>Coleman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+fat+grafting:+more+than+a+permanent+filler.">Structural fat grafting: more than a permanent filler.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+An+update+on+organoid+research.">Editorial: An update on organoid research.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).</li></ol>

Denna uppsats beskriver den fysiska fraktionering, med hjälp av en sluten system enhet, av mänsklig fettvävnad i små kluster som visar normal fettvävnad mikroanatomi.
Manuellt aspirrankade mänskliga subkutana fettvävnad och saltlösning lastas i en genomskinlig plast cylinder som innehåller stora Flipper-stil metalliska sfärer som, vid kraftig manuell skakning av anordningen, bristning fettet i sub-millimeter Fragment. Bifogade filter och utlopp gör det möjligt att eliminera skräp,...

Fettvävnad, länge används som fyllmedel i rekonstruktiv och kosmetisk kirurgi, har nyligen blivit mer populär i regenerativ medicin en gång erkänd som en källa för mesenkymala stamceller (MSCs)1. Lipoaspirates dissocierade enzymatiskt till encelliga suspensioner ger en adipocyte-fri stromacellstumörer vaskulär fraktion (SVF) som används oförändrat i patienten eller, oftare, odlas i flera veckor i MSCs2.
Men, enzym dissociation spricker vävnaden mikromiljöer, avskildhet angränsande reglerande celler från presumtiva regenerativa celler som blir avsevärt ändras genom in vitro-kultur. För att undvika sådana experimentella artefakter och därav funktionella förändringar, försök har gjorts för att bearbeta fettvävnad för terapeutiskt bruk samtidigt som den ursprungliga konfigurationen så intakt som möjligt3,4. I synnerhet har mekaniska vävnads störningar börjat ersätta enzymatisk dissociation. För detta ändamål, hela nedsänkning slutna systemet mikro-fragment lipoaspirates i sub-millimeter, blod-och oljefri vävnad kluster (t. ex., Lipogems) via en sekvens av SIL filtrering och stål marmor inducerad störningar3. Autolog transplantation av mikro-fragmenterad fettvävnad, med hjälp av denna slutna systemteknik, har varit framgångsrik i flera indikationer, spänner kosmetika, ortopedi, proktologi och gynekologi4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Jämförelse mellan humant mikrofragmenterad fettvävnad (Matt) som erhållits med den slutna systemenheten och ISOGEN SVF visade att med avseende på vaskulär/stromalcellsdistribution och sekretorisk aktivitet i kulturen innehåller MAT mer pericyter, som presumtiva MSCs14, och utsöndrar högre halter av tillväxtfaktorer och cytokiner15.
Den nuvarande artikeln illustrerar enzymet-fri mikro-fragmentering av mänskliga subkutan fettvävnad med hjälp av en sluten system enhet, och ytterligare bearbetning av sådana mikroniserade fettvävnad för in vitro-kultur, immunohistokemi och FACS analys, för att identifiera de celltyper som finns och de lösliga faktorerna som utsöndras (figur 1). Den beskrivna metoden genererar säkert fett härledda sub-millimeter organoider som innehåller livskraftiga fettvävnad cellpopulationer i en intakt nisch, lämplig för ytterligare tillämpningar och studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Buffered paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>9317.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>3KB7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;A21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>1158868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigent Diluent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>3218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control (BSA) Compensation Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) &#8211; filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) &#8211; filter V710/50 for BV711 antibodies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Ulex europaeus lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Vector-B1065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-V450</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock concentration: 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm &#8211; AR 13/18) &#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diva software 306 (v.6.0)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo (v.10.0)</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>410870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipogems Surgical Kit</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td>LG SK 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human- NG2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554275</td>
			<td>stock concentration: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235, 25/Pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom 5 mL tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human - PDGFRb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>32570</td>
			<td>stock concentration: 0.15 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjugated-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18)&#160;</td>
			<td>Lipogems&#160;</td>
			<td></td>
			<td>provided in the Lipogems surgical kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>fisher chemicals</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type- II Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Zeiss observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective used: Plan-Apo 20x/0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm;&#160; 555: Green, excitation 555nm;&#160; 647:Red, excitation 630nm&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human adipose tissue micro-fragmentation for cell phenotyping and secretome characterization

Under det senaste decenniet har fettvävnad transplantationer använts i stor utsträckning i plastikkirurgi och ortopedi för att förbättra vävnad tillskott och/eller förnyelse. Följaktligen, tekniker för skörd och bearbetning av mänskliga fettvävnad har utvecklats för att snabbt och effektivt få stora mängder vävnad. Bland dessa, den slutna systemteknik representerar en innovativ och lätt att använda system för att skörda, bearbeta, och åter injicera raffinerad fettvävnad på kort tid och i samma intervention (Intra-operativt). Fettvävnad samlas in genom fettsugning, tvättad, emulgerade, sköljas och mals mekaniskt till cell kluster på 0,3 till 0,8 mm. autolog transplantation av mekaniskt fragmenterad fettvävnad har visat anmärkningsvärd effekt vid olika terapeutiska indikationer såsom estetisk medicin och kirurgi, ortopediska och allmän kirurgi. Karakterisering av mikro-fragmenterad fettvävnad avslöjade närvaron av intakt små fartyg inom fettceller-kluster; Därför är perivaskulär nisch kvar unperturbed. Dessa kluster är berikade i perivaskulära celler (dvs., mesenkymala stamceller (MSC) förfäder) och in vitro-analys visade en ökad frisättning av tillväxtfaktorer och cytokiner inblandade i vävnad reparation och förnyelse, jämfört med enzymatiskt härledda MSCs. Detta tyder på att den överlägsna terapeutiska potentialen av mikrofragmenterad fettvävnad förklaras av en högre frekvens av presumtiva MSCs och förbättrad sekretorisk aktivitet. Om dessa extra pericyter direkt bidrar till högre tillväxtfaktor och cytokin produktion är inte känd. Detta kliniskt godkända förfarande möjliggör transplantation av presumtiva MSCs utan behov av expansion och/eller enzymatisk behandling, vilket kringgår kraven i GMP-riktlinjer och sänker kostnaderna för cellbaserade terapier.

Mekanisk dissociation av manuella lipoaspirates resulterade i produktion av mikro-fragmenterad fettvävnad (Matt), som består av en mängd adipocyter omsluter ett mikrovaskulära nätverk (figur 3). Immunofluorescensanalys av gelatin-inbäddat och kryofast matta belyser denna struktur, som visar det vaskulära nätverket som kännetecknas av endotelceller markör ulex europaeus kall 1 (UEA-1) receptor huvudsakligen består av små, kapillärliknande fartyg (...

Watch this Scientific Journal Video about Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization at JoVE.com

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

Här presenterar vi Human fettvävnad enzym-fri mikro-fragmentering med hjälp av en sluten system enhet. Denna nya metod gör det möjligt att obtainmenten av sub-millimeter kluster av fettvävnad som lämpar sig för in vivo transplantation, in vitro-kultur, och ytterligare cell isolering och karakterisering.

Human fettvävnad mikro-fragmentering för cell fenotypning och Secretome karakterisering

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Med hjälp av detta system kan vi samla in sub-millimeter kluster av mänsklig fettvävnad, där hela mikromiljö av regenerativa celler är intakt. Hela mikrovaskulära systemet är också intakt, och så vi kan använda denna typ av mikroorgan för in vivo transplantation för in vitro-kultur och för cellisolering för ytterligare karakterisering. Den huvudsakliga grunden för användningen av systemet i forskningslaboratoriet är att processen är helt enzymfri, och så det möjliggör snabb och effektiv bearbetning av mänsklig fettvävnad samtidigt som en mikro-arkitektur och det kommer att vara mikrovaskulatur av vävnaden helt intakt.Och så kan vi direkt studera en cellterapi produkt som har visat sig redan mycket användbar på kliniken. Detta slutna system teknik är en lättanvänd teknik för skörd, bearbetning och återinjektion raffinerad fett vävnad intraoperativt, och kan framgångsrikt tillämpas i kosmetika ortopedi, proktologi och även gynekologi. Denna metod möjliggör ytterligare studier av inverkan av fett i vävnadsregenerering.Förfarandet kommer att demonstreras av Bianca Vezzani, en postdoktor och av Mario Gomez-Salazar, som är doktorand. Arbeta under aseptiska förhållanden inom 16 timmar efter skörd, placera bukplastikprovet ovanpå en kirurgisk trasa med huden vänd uppåt. Använd en infiltrations kanyl av engångsvävnad för att injicera 50 till 100 milliliter på 37 grader Celsius 0,9%natriumkloridlösning i den subkutana fettvävnaden.Anslut en 10 milliliter Luer lås spruta till en disponibel fettsugning kanyl och gripa tag i provet vid den testning regionen nära en kant av provet, försiktigt införa kanyl i fettvävnaden. När kanylen är inne i vävnaden, extrahera kolven och flytta kanylen radiellt inom fettvävnadsprovet. Det är viktigt att hantera fettvävnaden ordentligt under lipo-aspirationen.Om inte tillräckligt med fett samlas in, överväga att utföra en extra saltlösning injektion. När sprutan är full av lipo-aspirate, ta försiktigt bort kanylen från vävnaden och sätt tillbaka den fulla sprutan med en ny tom spruta tills totalt 60 milliliter aspirate har skördats. För mikrofragmentering av lipo-aspiraten, ta ut enheten ur förpackningen och verifiera att huvudenheten är ansluten till avfallspåsen.Placera avfallsinsamlingspåsen på marken, och se till att ventilerna är säkrade till processenhetens lock. Stick igenom påsanslutningsporten för att ansluta ingångsledningens polpik i saltlösningspåsen och placera koksaltlösningspåsen högre än bearbetningsenheten. Kontrollera att alla fem av klämmorna som är anslutna till rören på kretsarna är öppna, placera bearbetningsenheten i vertikalt läge, låt saltlösningen fylla bearbetningsenheten och bekräfta att flödet når avfallspåsen.Skaka bearbetningsenheten för att ta bort eventuella luftbubblor och placera enheten i vertikalt läge med den blåa mössan riktad uppåt. Stäng klämman bredvid ingångsledningen och anslut en spruta av lipo-aspirat till den blå ingångslockens självockande ventil för att börja injicera lipo-aspiraten. Hålla bearbetningsenheten vertikal, tryck långsamt ner på sprutkolven tills allt av lipo-aspirat har överförts till enheten.När all lipo-aspirate har injicerats, öppna ingångsklämman för att återställa saltlösningsflödet och kraftigt skaka bearbetningsenheten i minst två minuter, regelbundet kontrollera saltlösningsflödet in i avfallspåsen. När saltlösningen i bearbetningsenheten blir genomskinlig placerar du enheten med det grå locket uppåt och stänger klämmorna som sitter på avloppet nära både de blå och grå kapsylerna. Den bearbetade vävnaden kommer att flyta på toppen.Därefter fyller du en 10 milliliter Luer lås spruta med saltlösning, och anslut sprutan till lastventilen av den blå locket. Anslut en tom 10 milliliter Luer låsspruta med kolven helt insatt i ventilen på den gråa locket. Injicera ordentligt koksaltlösningen i bearbetningsenheten från det blå locket, kontrollera att sprutan som är ansluten till den grå ventilen följaktligen fylls med den bearbetade vävnaden.När hela koksaltlösningen har injicerats, avlägsna noggrant båda sprutorna och upprepa saltlösningsinfusionen tills all bearbetad vävnad har samlats in. I slutet av bearbetningen, ta bort alla sprutor, stäng alla klämmor, ta bort koksaltlösningspåsen och kassera enheten enligt lokala protokoll. När alla av den bearbetade vävnaden har samlats in, överföra mikro-fragmenterad fettvävnad i en steril behållare, och lägga till en lika stor volym av digestionsmedium till behållaren.Placera den förseglade behållaren i en 37 grader Celsius skakvattenbad, inställd på 120 rotationer per minut i 45 minuter, stoppa matsmältningen med en lika stor volym av blockerande lösning i slutet av inkubationen. Seventiellt filtrera provet, först genom en 100 mikrometer cell sil följt av filtrering genom en 70 mikrometer cell sil och centrifug den filtrerade suspensionen i fem minuter vid 200 gånger g. Vi upphäver pelleten i cirka 5 milliliter erytrocytlysbuffert i 15 minuter vid rumstemperatur.Stoppa lysen med en lika stor volym av blockerande lösning och filtrera lösningen genom en 40 mikrometercellsil. Samla sedan de mikrofragmenterade fettvävnadscellerna genom centrifugering och vi suspenderar pelleten i färsk blockerande lösning med floure-blandning för räkning. Efter dissociation och antikroppsfärgning kan mikrofragmenterade fettceller tas till flödescytometern för cellanalys och/eller sortering.Mekanisk dissociation av manuella lipo-aspirates resulterar i produktionen av mikro-fragmenterad fettvävnad som består av ett aggregat av adipocyter som omsluter ett mikrovaskulära nätverk. Immunofluorescensanalys av gelatin inbäddad i kryofixerad mikrofragmenterad fettvävnad belyser strukturen, som visar det kärlnät som markeras av endotelcellsmarkören Ulex Europaeus Agglutinin 1-receptor och huvudsakligen bestående av små kapillärliknande kärl. Noterbart, pericytes uttrycker neuron-glial antigen 2 eller trombocyt-härledda tillväxtfaktor receptor beta distribueras normalt, ensheathing endotelceller.Genom att utesluta CD31 positiva endotel och CD45 positiva hematopoietic celler, förekomsten av CD146 positiva CD34 negativa pericytes och CD146 negativ och CD34 positiva adventitial celler kan identifieras inom MAT. Manuell lipo-strävan är en kritisk del av förfarandet och måste utföras under sterila förhållanden högst 16 timmar efter det bukplastik. Mikro-fragmenterad fettvävnad kan bearbetas ytterligare genom immunohistochemical färgning, in vitro-kultur eller secretome analys för att få en djupare insikt i fettvävnad biologi.Denna teknik gör det möjligt att studera olika vävnader i deras naturliga, inhemska, tredimensionella arrangemang som ett slags små organoider, som är tillräckligt små för att transplanteras i möss eller för att upprätthållas i långsiktig kultur. Och vi använder detta system främst för att närma sig experimentellt de olika organspecifika mikromiljöerna. Våra fettvävnadsdonatorer är inte kända som bärare av överförbara infektioner.Men i avsaknad av ytterligare screening, alla mänskliga vävnader bör betraktas som potentiellt förorenade och hanteras därefter.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering av mitokondrier från minimala kvantiteter av mus skelettmuskulatur för hög genomströmning Microandnings Mätningar

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vävnad Clearing metod för tredimensionell avbildning av fettvävnad

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering av 3D vit fettvävnad struktur med hjälp av hela-mount färgning

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Berikar avkastningen av mänskliga melanocyter från vuxna hudvävnader

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Exploring Adipose Tissue Structure genom Metylsalicylate Clearing och 3D-avbildning

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering och terapeutisk tillämpning av extracellulära vesiklar från odlade humana mesenkymala stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolering och identifiering av mesenkymala stamceller härrörande från fettvävnad från Sprague Dawley-råttor

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Halvautomatisk isolering av den stromala vaskulära fraktionen från murin vit fettvävnad med användning av en vävnadsdissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...