Name: investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells
Uploaded: 2019-09-01T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells at JoVE.com

ويود المؤلفان أن يشكرا البروفيسور م. د. ميندن (مركز الأميرة مارغريت للسرطان، الشبكة الصحية الجامعية، تورنتو، كندا) على توفير خط الخلية OCI-AML3. كما يود المؤلفون أن يشكروا المرافق الأساسية لعلم الجينوم السرطاني وعلم الأمراض (الجامعة الصينية في هونغ كونغ) على توفير التسهيلات والمساعدة لدعم هذا البحث.

1. تصميم crRNA
<ol><li>تصميم اثنين crRNAs، واحد 5 ' والآخر 3 ' من CRE الهدف باستخدام أداة تصميم كريسبر على شبكة الإنترنت28،29،30،31. تأكد من أن PAM من NGG يقع مباشرة المصب من التسلسل المستهدف للاعتراف Cas9. ويرد في الشكل 1تصميم الـ crRNAs اثنين (crRNA-1 وcrRNA-2) لحذف كاتم الصوت RUNX1 18. ملاحظة: يحتوي crRNA عادةً على protospacer 20-mer المكمل للتسلسل المستهدف.</li>
	<li>التحقق من وجود تعدد الأشكال النيوكليوتيدات واحد (SNPs)/indels في تسلسل اتّصال PAM المستهدف والمجاور عن طريق إدخال المواقع الجينية للتسلسلات في مربع البحث في متصفح الجينوم الإلكتروني (على سبيل المثال، الجينوم اتّباع ًا 1000 من النيوكليوتيدات أو متصفح الجينوم UCSC). ملاحظة: وللملوثات خدمة ذلك نونس/الإندلات الشائعة تردد صغير في الأليل لا يقل عن 1 في المائة في عموم السكان.</li>
	<li>إرسال تسلسل crRNA المحدد للتوليف مع بائع تجاري. أيضا، شراء التراكررنا لتشكيل دوبلكس gRNA.</li>
</ol>2. تصميم التمهيديات فحص الحذف
<ol><li>تصميم زوج من التمهيديات التي تحيط منطقة الحذف المقصود. تأكد من أن المواد التمهيدية هي على الأقل 50 نقطة أساس من مواقع الانقسام Cas9 بحيث يتأثر تضخيم PCR الحد الأدنى من الإندلات التي تشكلت في مواقع الانقسام.</li>
	<li>تأكد من أن amplicon أصغر من 1200 نقطة أساس (ويفضل أن يكون أصغر من 600 نقطة أساس لدقة حجم أفضل). أيضا، تسمية واحدة من التمهيديات مع صبغة الفلورسنت (على سبيل المثال، 6-carboxyfluoressin (6-FAM)) في 5'-نهاية للكشف. وترد في الشكل 1التدليلات التمهيدية المستخدمة لفحص حذف كاتم الصوت RUNX1 18.</li>
</ol>3 - إعداد مجمعات Cas9/gRNA RNP
<ol><li>إعادة تعليق crRNAs وtracrRNA في 1X TE العازلة (10 M Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.5) إلى تركيز نهائي من 200 درجة مئوية.</li>
	<li>لكل crRNA، مزيج 2.2 ميكرولتر من 200 ميكرومتر crRNA، 2.2 ميكرولتر من 200 ميكرومتر تراكررنا و 5.6 ميكرولتر من 1X TE العازلة (المجموع 10 ميكرولتر) في أنبوب 0.2 مل للحصول على تركيز مزدوج نهائي من 44 ميكرومتر.</li>
	<li>حضانة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في دراجة حرارية. السماح للأنابيب لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة لتشكيل مجمع gRNA.</li>
	<li>تخفيف 10.4 ميكرولتر من 62 ميكرومتر المؤتلف Cas9 nuclease مع 7.6 ميكرولتر من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) للحصول على تركيز nuclease النهائي من 36 μM. ملاحظة: ويكفي هذا المبلغ لإعداد مجمعين من المجمعات Cas9/gRNA.</li>
	<li>مزيج أحجام متساوية (8.5 درجة مئوية) من nuclease المخففة مع كل من دوبلكس gRNA التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.3.</li>
	<li>حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح RNP تشكيل معقدة. يُحفظ المخاليط على الجليد حتى يتم الكهربة.</li>
</ol>4. الكهربائي من مجمعات RNP في خلايا OCI-AML3
<ol><li>ثقافة OCI-AML3 الخلايا في RPMI 1640 المتوسطة تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني (FBS)، 1X GlutaMAX، 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من العقدية (يشار إليها فيما يلي باسم كامل RPMI 1640 المتوسطة) في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2.</li>
	<li>عد الخلايا باستخدام تلطيخ الأزرق تريبان. تأكد من أن قدرة الخلية على البقاء في وقت الكهرباء أكثر من 90٪.</li>
	<li>الطرد المركزي 2.5 × 106 خلايا في أنبوب 1.5 مل في 500 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant وغسل الخلايا مع 1 مل من 1X PBS. تدور أسفل الخلايا مرة أخرى وإزالة جميع supernatant المتبقية.</li>
	<li>إعادة تعليق الخلايا في 163 درجة مئوية من RPMI 1640 المتوسطة دون الفينول الأحمر.  إضافة 16.7 ميكرولتر من كل مجمع RNP (من الخطوة 3.6) و 3.6 ميكرولتر من 100 μM الكهربائي محسن إلى الخلايا (الحجم الإجمالي = 200 درجة مئوية). يُمزج بلطف عن طريق الأنابيب. ملاحظة: محسن الكهربائي هو الحمض النووي الناقل لتعزيز كفاءة التحرير.</li>
	<li>نقل الخليط إلى 0.2 سم الفجوة الكهربائية cuvette دون أي فقاعات. إجراء الكهرباء مع نظام الكهربائي (الوضع: الأسي؛ الجهد =: 150 فولت؛ السعة = 700 درجة فهرنهايت؛ المقاومة = 50 Ω).</li>
	<li>نقل الخلايا إلى قارورة زراعة الأنسجة T-25 التي تحتوي على 6 مل من RPMI 1640 كاملة المتوسطة وحضانة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.</li>
</ol>5. فحص واختيار استنساخ الخلايا مع حذف Biallelic
<ol><li>تمييع الخلايا إلى 5 × 103/ مل في كامل RPMI 1640 المتوسطة يوم واحد بعد الكهربائي. إضافة 100 درجة مئوية من تعليق الخلية المخففة في كل بئر من لوحات زراعة الأنسجة 96 جيدا والسماح للخلايا تنمو لمدة 7-14 يوما.</li>
	<li>استخراج الحمض النووي الجيني من الخلايا باستخدام نظام تنقية عالية الإنتاجية.</li>
	<li>إضافة 100 درجة مئوية من لوحة ملزمة والعازلة lysis إلى كل بئر من لوحة استخراج 96 جيدا. إضافة 5 × 104 الخلايا التي أعيد تعليقها في 10 μL من PBS 1X إلى المخزن المؤقت ومزجها عن طريق الأنابيب.</li>
	<li>حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح لربط الحمض النووي الجيني إلى الآبار.</li>
	<li>يستنشق الحل من الآبار دون كشط أسطح الآبار. اغسل الآبار بسعة 120 لتر من مخزن الغسيل.</li>
	<li>الهواء يجف الآبار التي تحتوي على الحمض النووي ملزمة.</li>
	<li>إعداد 20 ميكرولتر من مزيج PCR (2 ميكرولتر من 10X عالية الدقة العازلة، 0.8 ميكرولتر من 50 مل مغسو4،0.4 ميكرولتر من 10 mM dNTPs، 0.4 ميكرولتر من 10 μM FAM المسمى التمهيدي إلى الأمام (الخطوة 2.2)، 0.4 ميكرولتر من 10 μM غير المسمى التمهيدي العكسي و 0.4 U من البوليمرات الحمض النووي Taq لكل عينة). ملاحظة: إعداد مزيج رئيسي لضمان إضافة كميات موحدة من الكواشف في كل عينة.</li>
	<li>إضافة مزيج PCR إلى كل بئر من لوحة استخراج وتشغيل ردود الفعل في دراجة حرارية (الشروط: الأولي 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها 35 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ق، 56 درجة مئوية لمدة 30 ق و 68 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة).</li>
	<li>تقدير كمية المنتجات عن طريق قياس تركيزاتها في عدد مختار من العينات باستخدام مقياس الفلور. تمييع جميع العينات مع H2O خالية من النوكلس إلى 0.5 نانوغرام/ميكرولتر.</li>
	<li>مزيج 1 ميكرولتر من منتجات PCR المخففة مع 8.5 ميكرولتر من الفورماميد منزوع الأيونات و 0.5 ميكرولتر من معيار الحجم الفلورسنت المسمى بالصبغة في لوحة 96-well متوافقة مع محلل الوراثية. ملاحظة: إعداد مزيج رئيسي يحتوي على الفورماميد منزوع الأيونات ومعيار الحجم.</li>
	<li>تغطية لوحة مع الحاجز لوحة وتشوه العينات في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في دراجة حرارية. لا تغلق غطاء الجهاز.</li>
	<li>إجراء الكهربائي هلام الشعرية لفصل المنتجات PCR المسمى كما سبق وصفها32.</li>
	<li>بعد الكهربائي، افتح برنامج التحليل لتحليل النتائج.</li>
	<li>انقر فوق مشروع جديد وحدد القمر الصناعي الصغير. ثم انقر فوق موافق.</li>
	<li>انقر فوق إضافة نماذج إلى Project وحدد ملفات النتائج (تحتوي على ملحق .fsa). ثم انقر فوق إضافة إلى قائمة لاستيراد الملفات.</li>
	<li>في الجدول الذي يعرض ملفات النتائج المحددة، اختر افتراضي القمر الصناعي الصغير في العمود أسلوب التحليل. أيضاً، حدد معيار الحجم المستخدم في العمود قياسي الحجم. ثم انقر على أيقونة تحليل، وأدخل اسم التجربة واحفظ التجربة.</li>
	<li>انقر فوق عرض المؤامرات لعرض النتائج واختيار تحليل الأجزاء في إعداد الرسم.</li>
	<li>اختر القنوات الملونة المناسبة للتحليل. تحقق من الرمز البرتقالي لعرض الأجزاء المسماة في معيار الحجم لتقييم جودة استدعاء الحجم.</li>
	<li>تحقق من الرمز الأزرق لعرض منتجات PCR المسماة. تحديد القمم التي تتوافق مع المنتجات البرية والمتحولة (أي تحمل الحذف المتوقع). تقدير مستوى متحولة في كل عينة عن طريق تقسيم المنطقة تحت ذروة متحولة من قبل مجموع المنطقة تحت القمم البرية والمتحولة.</li>
	<li>حدد تجمعات خلايا متعددة مع مستويات عالية من عمليات الحذف المتوقعة لمزيد من التخفيفات التسلسلية.</li>
	<li>كرر استخراج الحمض النووي، PCR الفلورسنت وخطوات الكهربائي الشعرية. حدد استنساخ الخلايا مع مستويات متحولة > 95٪ تمثل الحذف biallelic للتحليلات اللاحقة.</li>
	<li>تحقق من هوية عمليات الحذف في النسخ المحددة بواسطة تسلسل Sanger.</li>
</ol>6. التحليلات الوظيفية لحذف كاتم الصوت عن طريق التحليل الكمي RT-PCR في الوقت الحقيقي
<ol><li>استخراج مجموع الحمض النووي الريبي من استنساخ مختارة وإجراء الحمض النووي التكميلي (cDNA) التوليف.</li>
	<li>مزيج 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مع 1 ميكرولتر من 50 ميكرومتر oligo (dT)20 التمهيدي و 1 ميكرولتر من 10 مل dNTP مزيج في حجم إجمالي قدره 10 درجة مئوية.</li>
	<li>إضافة 10 ميكرولتر من مزيج تخليق cDNA يحتوي على 2 ميكرولتر من 10X RT العازلة، 4 ميكرولتر من 25 مل مغكل2،2 ميكرولتر من 0.1 M DTT، 1 ميكرولتر من مثبطات RNase (40 U/μL) و1 ميكرولتر من النسخ العكسي (200 U/μL). حضانة في 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة ثم 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في دراجة حرارية. ملاحظة: إعداد مزيج رئيسي للنسخ العكسي.</li>
	<li>اهدئي العينات على الثلج إضافة 1 درجة مئوية من RNase H وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.</li>
	<li>تصميم التمهيديات وتحقيقات تقوى التي تعترف على وجه التحديد المتغيرات نسخة الفردية التي تم إنشاؤها من المروجين البديلة. ملاحظة: وتتوفر مجموعات التمهيدي/المسبار المصممة مسبقاً والمحددة للنسخ تجارياً.</li>
	<li>استنساخ شظايا الحمض النووي التي تحتوي على تسلسل نسخة محددة في الحمض النووي بلازميد. إعداد سلسلة تخفيف 10 أضعاف (106 إلى 10 نسخ) من بلازميدات المؤتلف كمنحنيات قياسية للقياس الكمي للنسخة.</li>
	<li>إعداد 20 ميكرولتر من مزيج PCR (0.5 ميكرولتر من قالب الحمض النووي، 1 ميكرولتر من 20X تصميم مسبق التحقيق طاقة / فحص التمهيدي و 10 ميكرولتر من 2X تقوى PCR ماجستير ميكس) لكل عينة (كل من cDNA ومعايير بلازميد). قياس كل عينة في ثلاثة أضعاف. ملاحظة: إعداد مزيج رئيسي لPCR في الوقت الحقيقي.</li>
	<li>تشغيل ردود الفعل في آلة PCR في الوقت الحقيقي (الشروط: الأولي 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 40 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ق و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة).</li>
	<li>بعد التضخيم، انقر فوق الرمز تحليل في البرنامج لتحليل البيانات. تحقق من الميل ومعامل الارتباط للمنحنيات القياسية لتقييم كفاءة وخطية ردود الفعل. تأكد من أن المنحدرات بين -3.1 و -3.6 ومعاملات الارتباط أكبر من 0.99.</li>
	<li>تطبيع عدد نسخ النصوص المستهدفة في كل عينة مع جين التدبير المنزلي (على سبيل المثال، GAPDH).</li>
</ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

وقد تم استخدام نظام CRISPR / Cas9 في مجموعة واسعة من تطبيقات تحرير الجينوم مثل الجينات بالضربة القاضية والدراسات ضرب في35،36، اللائحة النسخ37،38، الهندسة الوراثية لمختلف نموذج الكائنات الحية39،40،41،42،43،44 والعلاج الجيني45،46. هنا، نقوم بإظهار استخدام CRISPR/Cas9 للتحقيق في العواقب الوظيفية لحذف كاتم صوت intronic على جين RUNX1. لم يعتمد تسليم مكونات كريسبر في نهجنا على الحمض النووي البلازميد، واستنساخ الحمض النووي الريبي أو الفيروس، بل الكهربة من مجمعات Cas9/gRNA RNP المجمعة مسبقاً. وقد تبين أن استخدام الحمض النووي الخارجي يمكن أن يرتبط بالتكامل غير المرغوب فيه لتسلسلات ناقلات الأجنبية في الجينوم المضيف، وزيادة السمية وانخفاض الكفاءة25،47،48،في حين أساليب نقل الفيروس تستغرق وقتا طويلا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التعبير لفترات طويلة من Cas9 من الحمض النووي بلازميد زيادة الآثار خارج الهدف48. بل على العكس من ذلك، فقد تم وضع نهج التسليم المباشر القائم على البرنامج الوطني للشرطة الوطني بوصفه الأسلوب المفضل لأنه سريع ومباشر مع تحسين كفاءة التحرير والانتقائية وجدوى الخلايا. في الواقع، مجموعة متنوعة من الأساليب مثل lipofection49،50،الكهربائي25،51،الجسيمات النانوية52،الببتيدات اختراق الخلايا53،iTOP54 وTRIAMF تم تطوير 55 لتقديم كريسبر/كاس9 بكفاءة إلى أنواع متنوعة من الخلايا وكذلك الأنواع الحيوانية والنباتية24،25،26،56،57 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63.وبما أن تسلسلات الحمض النووي غير الترميز هي النقاط الساخنة للاختلافات الوراثية64،والتحقق من وجود SNPs المشتركة / indels في الهدف وتسلسل PAM المجاورة ذات أهمية خاصة عند تصميم gRNA التي تستهدف التنظيمية عناصر.
وينطوي الاختناق في تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 على فحص الحيوانات المستنسخة المتحولة المرغوبة في عدد كبير من العينات. لقد وظفنا PCR الفلورسنت إلى جانب الكهربائي هلام الشعرية للفحص كما الطفرة المستهدفة هو حذف الجينوم الصغيرة من حوالي 300 نقطة أساس. هذه الطريقة سريعة وحساسة ويمكن تنفيذها بطريقة عالية الإنتاجية. أيضا، هذا الأسلوب يسمح تقدير دقيق لمستويات متحولة وأحجام الحذف في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك، يتم دعم تحليل متعددة من أجزاء PCR المسمى مع أصباغ فلورية مختلفة. لقد تم استخدام هذه التقنية بشكل روتيني لجينوتايب الصغيرة الإدراج / الحذف في الأورام النخاعية65،66. في تجربتنا، يمكننا الكشف باستمرار أحجام الشظايا التي تختلف بنسبة 4 نقطة أساس بدقة عالية وعبء متحولة وصولا إلى ~ 3٪. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذه الطريقة لديها حد حجم جزء من 1200 نقطة أساس، وبالتالي فهي ليست مناسبة لفحص عمليات الحذف الكبيرة. كما لا يمكن الكشف عن البدائل الأساسية (التي تؤدي إلى عدم تغيير حجم الأجزاء) والأحداث المحتملة غير المستهدفة في مناطق جينية أخرى. وبالنسبة لهذه الأخيرة، فإن تسلسل الجينوم بأكمله المكلف مطلوب للتعريف الشامل بالتغيرات العالمية غير المرغوب فيها في عمليات الاستنساخ المستهدفة. اعتماد نهجنا الحالي للتحقيق في التسلسلات التنظيمية الكبيرة غير الترميز (>1,000 bp), حذف مفصل وتحليلات الطفرات من مواقع ربط عامل النسخ المفترض باستخدام الاختبارات الجينية في المختبر مراسل يمكن أن يؤدي مسبقا لتحديد المنطقة الوظيفية الحد الأدنى لCRISPR / Cas9 التحرير18.
وبما أن العديد من الجينات تحتوي على أكثر من مروّجواحد 3و4،فمن المهم أن تكون على بينة من وجود المروجين البديلين في موضع الجينات المستهدفة لأن التلاعب بالعناصر التنظيمية قد يؤثر على المروجين بشكل تفاضلي. وبالتالي، فإن متغيرات النسخ المستمدة من مروّجين مختلفين تحتاج إلى قياس فردي لتقييم أي ردود خاصة بالمروجين. ويُفضّل استخدام الاختبارات المستندة إلى التحقيق في "تُكِمان" على "سي بي آر غرين" بسبب خصوصية أفضل وإمكانية استنساخ. إذا كان نظام PCR الرقمي الأكثر تقدماً متوفراً، يمكن إجراء التحديد الكمي للنسخ بشكل أكثر دقة دون الحاجة إلى بناء منحنى قياسي.
ومن الاعتبارات الهامة في إجراء تجارب كريسبر/كاس9 في خطوط الخلايا السرطانية رقم نسخ الجينات المستهدفة في الخلايا المستخدمة كجميع خطوط الخلايا السرطانية تقريباً تحتوي على تغييرات جينية بما في ذلك الاختلافات الهيكلية وتغيرات عدد النسخ. في حالتنا، OCI-AML3 لديه نوع كاريوتيبي فرط ثنائي مع 45 إلى 50 كروموسوم. أيضا، تم العثور على خط الخلية لحمل رقم نسخة RUNX1 العادي كما هو الحال في موسوعة خط الخلايا السرطانية67 والفلورة في دراسات التهجين الموقع18. عند استهداف جين مع كسب رقم نسخة، قد تحتاج طريقة التسليم إلى تحسين لتوفير مستويات كافية من مكونات CRISPR للتحرير. أيضا، قد تحتاج إلى مزيد من استنساخ ليتم فحصها من أجل تحديد بالضربة القاضية كاملة. والأهم من ذلك، فقد تبين أن الاستهداف في المناطق الجينية المضخمة، ولا سيما تلك الناجمة عن إعادة الترتيب الهيكلي، يمكن أن يؤدي إلى استجابات مضادة للانتشار مستقلة عن الجينات في الخلايا السرطانية، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة في الجينات الدراسات الوظيفية68،69،70. وفي هذا الصدد، ينبغي استخدام نُهج بديلة مثل تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) و/أو التعبير المفرط للحمض النووي الريبي للتحقق من نتائج كريسبر. أيضا، يجب استخدام خطوط الخلايا متعددة لتجنب سوء تفسير خط الخلية محددة ولكن الجينات المستقلة كريسبر آثار التحرير.
أحدث نظام CRISPR/Cas9 ثورة في البحوث الأساسية والترجمة من خلال توفير وسيلة بسيطة وفعالة لتحرير الجينوم. هنا نبرهن على سهولة استخدام CRISPR/Cas9 لتعطيل كاتم الصوت غير التروني للدراسات النسخية في خط الخلايا السرطانية. تسمح هذه التقنية لدراسة CREs على مستوى الحمض النووي وتوفر الفرص لفحص وظائف CRE في السياق المحلي بدلاً من الجينات مراسل غير متجانسة التقليدية. وفي الآونة الأخيرة، تم أيضاً تحديد نظام تحرير الحمض النووي الريبي القائم على كريسبر71 وقد يكون بمثابة أداة جديدة لدراسة الـ CREs من خلال استهداف الحمض النووي الريبي المنقول من العناصر التنظيمية. ومن خلال الجمع بين تقنيات التقاط المطابقة للكروموسوم، سيساعد CRISPR/Cas9 بالتأكيد على فك رموز مشاركة الـ CREs في تنظيم الجينوم المتغير والتعبير الجيني المرتبط بمختلف المشاكل الصحية.

عناصرCis-التنظيمية (CREs) هي تسلسلات الحمض النووي غير الترميز التي تحتويعلى مواقع ملزمة للمنظمين النسخ للتحكم في التعبير الجيني 1،2. هذه العناصر عادة ما تكون 100 إلى 1000 أزواج قاعدة (bp) طويلة. المروجين ومحسنات هي النوعين الأكثر تميزا من CREs. المروجين موجودون على مقربة من مواقع بدء النسخ وتشكل الوحدة الأساسية للنسخ. العديد من الجينات لديها أكثر من المروج واستخدامها البديل يساهم في تنوع النسخ وخصوصية الأنسجة3،4. من ناحية أخرى، محسنات تنشيط النسخ ويمكن أن يكون موجودا في المنبع، المصب أو داخل الإنترونات من الجينات المستهدفة. محسنات يمكن أن تعمل من مسافة بعيدة (أكثر من قاعدة عملاقة) ومستقلة عن التوجه1،2. كما تشمل CREs كاتم الصوت والعوازل5و6. الأول يعمل عكس القدرة على منع التعبير الجيني عن طريق ربط المثبطات النسخية، في حين أن هذا الأخير يقسم الجينوم إلى مجالات طوبولوجية منفصلة لعزل الجينات من CREs الأخرى من المجالات المجاورة. وتعمل هذه العناصر بالتنسيق مع بعضها البعض من خلال تفاعلات الكروماتين قصيرة و/أو طويلة المدى، ويتم تنظيمها في محاور تنظيمية لتوجيه التعبير الجيني الصدغي السليم. وقد أدت التطورات الأخيرة في تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية إلى تسريع عملية تحديد العديد من الـ CREs والتعليق العملي لها، مما يسر إلى حد كبير فهمنا للشبكات النسخية التي تملي الجينات الخاصة بالنسب التعبير في أنواع مختلفةمن الخلايا والأنسجة 7،8،9،10،11،12.
وبالنظر إلى الأدوار الأساسية للنظم في تنظيم النسخ، فإن تعديلاتها يمكن أن تؤدي إلى التعبير الجيني الشاذ. وقد تبين أن CREs كثيرا ما تتعطل بسبب التغيرات الوراثية والجينية في أنواع مختلفة من السرطانات البشرية، مما يسهم في بدء الورم، والتقدم والعدوانية13،14. وبالإضافة إلى ذلك، غالباً ما يتم تغيير العوامل الملزمة CRE و/أو التعبير عنها بشكل خاطئ في أنواع السرطان المختلفة، مما يسلط الضوء على أهمية إلغاء الضوابط التنظيمية CRE في التناسل15. يمكن أن تتأثر CREs أيضا بالانحرافات الهيكلية، كما يتضح من إعادة ترتيب الكروموسومات المتكررة من محسن الجينات المناعية الثقيلة (IgH) التي تؤدي إلى تنشيط غير طبيعي للأونكوجينيات المجاورة في الأورام الليمفاوية ب الخلية16. في ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML)، يؤدي تغيير موضع محسن واحد بواسطة إعادة ترتيب كروموسوم 3q إلى انخفاض تنظيم GATA2 المصاحب وتنشيط EVI1، والذي يمكن استهدافه من خلال تثبيط BET لوظائف محسن 17.في الآونة الأخيرة، ونحن تميز رواية نقل الكروموسومات التي تنطوي على اضطراب من كاتم الصوت RUNX1 intronic التي قد تسهم في تطور مكافحة غسل الأموال في مريض الأطفال18. وهكذا، فإن فك رموز جينوم السرطان غير الترميز يوفر سبلا مثمرة لتوضيح مسببات الأمراض، واكتشاف العلامات الحيوية والتدخلات العلاجية، والتي تحسن في نهاية المطاف نتائج المرضى.
تم استغلال مسار كريسبر/كاس9 nuclease، الذي تم تحديده في الأصل على أنه نظام مناعي متكيف في الخلايا البروكاريوتيكية، كوسيلة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتحرير الجينوم الخاص بالموقع في الخلايا الحية والكائنات الحية19و20 ،21،22. وينطوي نظام كريسبر/كاس9 على عنصرين رئيسيين هما: الرنا والعقدياتالمستمدة من Cas9 nuclease. يحتوي gRNA على تسلسل محدد يسمى protospacer يتعرف على المنطقة المستهدفة ويوجه Cas9 للتحرير. يتكون الرنا من جزأين: كريسبر رنا (كررنا)، وعادة ما يكون تسلسل النيوكليوتيد 20-mer مكملة للحمض النووي المستهدف، وcrRNA عبر تفعيل (تراكرنا)، والذي يعمل كسقالة ملزمة للنوكليس. وهناك حاجة إلى عزر متجاوب (PAM) (5'-NGG) بجوار الموقع المستهدف مباشرة لانشقاق Cas9 ويقع موقع الانقسام 3 نيوكليوتيدات في أعلى مجرى الجزء الأُبية. مع بلازميد الذي يشفر Cas9 وgRNA المستنسخة23. ومع ذلك، فإن هذا النهج يشكل تحديا ً للخلايا المكونة للدم، والتي غالباً ما يصعب نقلها وتتطلب أساليب طويلة للانتراب القائم على الفيروس. نهج بديل هو التسليم الخلوي المباشر من المجمعات Cas9 /gRNA RNP24. وهناك طريقة شائعة لتسليم RNP هو الكهربائي، الذي يولد المسام المؤقتة في غشاء الخلية، مما يسمح بدخول المجمعات RNP في الخلايا25،26. وتشمل مزايا هذا النهج سهولة الاستخدام، والحد من الآثار غير المستهدفة، واستقرار مجمعات البرنامج الوطني للمشاريع. هنا، ونحن نصف بروتوكول لاستخدام طريقة التسليم RNP للتحقيق في الدور النسخي من كاتم الصوت RUNX1 intronic في خط خلية سرطان الدم OCI-AML318، الذي أنشئ من الدم المحيطي لمريض مكافحة غسل الأموال تشخيص مع الفرنسية الأمريكية البريطانية M4 Subtype27. ويشمل البروتوكول تصميم crRNA، وإعداد مجمعات RNP، والكهرباء، فضلا عن فحص وتوصيف لاحق للمستنسخين المطلوبين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">0.2 cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652086</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1&#215;TE buffer, pH7.5</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">10mM dNTP mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">3500 Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4405673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 System SDS Software</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td>Version 1.3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Bio-Rad Gene Pulser Xcell system</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">CS11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-1</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-2</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Electroporation Enhancer</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">10270098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fluorometer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneMapper Software 5</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4475073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneScan 600 LIZ Size Standard</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4408399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PBS, 10X Solution, pH7.4</td>
			<td style="width:208px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:176px;">75889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11304029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1081058</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium without phenol red</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1a TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs04186042_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1b/c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs00231079_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs01021966_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1072533</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TRIzol Reagent</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Unlabeled PCR reverse primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells

الجزء الأكبر من الجينوم البشري (~ 98٪) يتكون من تسلسلات غير الترميز. العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة(CREs) هي تسلسلات الحمض النووي غير الترميز التي تحتوي على مواقع ملزمة للمنظمين النسخ لتعديل التعبير الجيني. وقد تورطت في مختلف الأمراض بما في ذلك السرطان تغييرات في الـ CREs. في حين أن المروجين ومحسنات كانت CREs الأولية لدراسة تنظيم الجينات، لا يعرف سوى القليل جدا عن دور كاتم الصوت، وهو نوع آخر من CRE التي تتوسط قمع الجينات. تم استغلال CRISPR/Cas9، الذي تم تحديده في الأصل على أنه نظام مناعة متكيففي في prokaryotes، ليكون أداة قوية لتحرير الجينوم الأوكاريوتيك. هنا، نقدم استخدام هذه التقنية لحذف كاتم صوت intronic في جين RUNX1 البشري والتحقيق في الآثار على التعبير الجيني في خلايا اللوكيميا OCI-AML3. يعتمد نهجنا على تسليم اثنين من المجمعات التي تم تجميعها مسبقاً من Cas9/guide RNA (gRNA) للبروتين الريبونوكليوبروتين (RNP) لإنشاء فواصل مزدوجة حبلاً (DSBs) التي تحيط كاتم الصوت. يمكن فحص عمليات الحذف بسهولة عن طريق تحليل الأجزاء. وتساعد تحليلات التعبير لمختلف الـ mRNAs التي تنسخ من المروجين البديلين في تقييم الآثار التي تعتمد على المروجين. ويمكن استخدام هذه الاستراتيجية لدراسة الـ CREs الأخرى وهي مناسبة بشكل خاص للخلايا المكونة للدم، والتي غالباً ما يصعب نقلها باستخدام الأساليب القائمة على البلازميد. ويتيح استخدام استراتيجية خالية من البلازميد والفيروسات إجراء تقييمات بسيطة وسريعة للوظائف التنظيمية للجينات.

والهدف من هذه التجربة هو حذف كاتم صوت intronic في الجين RUNX1 ودراسة الآثار على النسخ RUNX1 في خلايا OCI-AML3. تم تحديد كاتم الصوت من خلال نهج جزيئي مؤتلف ووجد أنه يحتوي على عنصر أساسي 209 bp18. ولتمكين تقييم أكثر دقة لهذا العنصر الأساسي في التحكم في التعبير RUNX1، تم تصميم crRNAs (crRNA-1و crRNA-2) لاستهداف هذه المنطقة عن كثب18 (الشكل 1). وكانت مواقع الانقسام المتوقعة Cas9 التي جلبتها crRNA-1 وcrRNA-2 29 نقطةأساس و 35 نقطة أساس من العنصر الأساسي، على التوالي (الشكل 1). وتجدر الإشارة إلى أنه في حين أن مواقع PAM من crRNAs اثنين يقيمون على خيوط المعاكسة، وسوف تحدث DSBs بشكل مستقل عن موقع تسلسل PAM. وهكذا، فإن الإدخال المصاحب لمجمعين من الـ Cas9/gRNA RNP يسترشدان بـ crRNA-1 وcrRNA-2 من المتوقع أن يقتطع عنصر كاتم الصوت من موضع RUNX1.
لفحص الحذف المطلوب في عدد كبير من العينات، تم استخدام شكل 96 بئر من مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي لتنقية عالية الإنتاجية. كما يمكن أن يخضع الحمض النووي المقيد على آبار لوحات الاستخراج للتضخيم المباشر، مما يقلل إلى أدنى حد من الأخطاء أو التلوث الناجم عن تكرار نقل العينات. وترد في الشكل 1التدليلات التمهيدية المستخدمة لفحص عمليات الحذف18. الحجم المتوقع للمنتج PCR البرية من النوع حوالي 500 نقطة أساس. وبما أن الحذف المقصود يمتد على 273 نقطة أساس، فمن المتوقع أن يكون المنتج المتحول حوالي 230 نقطة أساس. هذا النطاق حجم يتيح تحليل جزء بسيط وسريع عن طريق الكهربائي هلام الشعرية. تم فحص ما مجموعه 160 تجمع خلايا أولية وتم العثور على 14 لنقل الحذف المتوقع مع مستويات متحولة لا تقل عن 70٪. ثم تم اختيار خمسة برك لمزيد من التخفيفات التسلسلية لتحديد الحيوانات المستنسخة التي تحمل حذف ثنائي. يظهر في الشكل 2Aمخططات الإلكتروفر من استنساخ الخلايا مع مستويات مختلفة من المنتجات المتحولة . تم التحقق من هوية عمليات الحذف بواسطة تسلسل Sanger (الشكل2B). وكما هو متوقع، لوحظت الإندلة التي شكلتها نهاية غير متجانسة عند الانضمام إلى إصلاح DSBs33 في مواقع الانقسام المتوقعة في استنساخ الحذف. وأدى ذلك إلى تضخيم المنتجات المتحولة ذات الأحجام المختلفة، والتي يمكن أيضا الكشف عنها عن طريق الكهربائي الشعري (الشكل2ألف).
يحتوي جين RUNX1 على اثنين من المروجين وهما P1 القاصي وP2 القريب، والتي يتم فصلها بواسطة إينترون كبيرة تأوي عنصر كاتم الصوت34. يتم إنتاج ثلاثة نسخ mRNA الرئيسية من قبل هؤلاء المروجين: RUNX1c من قبل P1 وRUNX1a وRUNX1b من قبل P234. تسلسل النيوكليوتيد من RUNX1c وRUNX1b متطابقة باستثناء الأول لديه فريدة من نوعها N-terminus، والتي يمكن تصميم اختبار تعبير جين تقوى محددة (الشكل3A). لقياس RUNX1b،تم استخدام اختبار TaqMan الذي يعترف بكل من RUNX1b وRUNX1c (الشكل3A). ثم تم تحديد مستويات RUNX1b عن طريق طرح إجمالي RUNX1b/RUNX1c من RUNX1c. RUNX1a هو isoform أقصر بشكل واضح بسبب الربط البديل ومعيار تقوى محدد متاح لهذا البديل (الشكل3A). وبالتالي، يمكن تحديد نشاط المروجين P1 و P2 بشكل فردي. وفي الوقت الحقيقي، أظهر الكمية RT-PCR أن حذف عنصر كاتم الصوت أدى إلى رفع مستويات التعبير عن كل من النصوص المشتقة من P1 وP2 (الشكل3باء).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig1.jpg"> الشكل 1 استراتيجية لحذف كاتم الصوت RUNX1 intronic. يقع كاتم الصوت (المربع الأحمر) في الإنترون الأول من جين RUNX1 الذي يفصل بين المروجين P1 و P2 (يظهر إحداثيات hg19). تم تصميم اثنين crRNAs (crRNA-1 و crRNA-2) لإدخال DSBs المحيطة عنصر كاتم الصوت. يتم الإشارة إلى مواقع الانقسام المتوقعة Cas9 بواسطة خطوط حمراء عمودية ومواقع PAM (NGG) باللون الأرجواني. يتم تمثيل التمهيديين المستخدمة لفحص عمليات الحذف بالأسهم المفتوحة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig2.jpg"> الشكل 2 تعريف استنساخ الحذف: (أ) التصوير الكهربائي التمثيلي لاستنساخ الخلايا التي تظهر مستويات مختلفة من منتجات PCR المتحولة (MUT). يختلف حجم المنتجات المتحولة بين الحيوانات المستنسخة بسبب الإندلات التي تشكلت في مواقع الانقسام. WT = من النوع البري. (ب) التحقق من عمليات الحذف من النسخ المستنسخة التمثيلية بواسطة تسلسل سانجر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig3.jpg"> الشكل 3 النتائج الوظيفية لحذف كاتم الصوت. (A) يتم عرض isoforms RUNX1 الرئيسية الثلاثة (RUNX1a وRUNX1b و RUNX1c). تحتوي هذه المتغيرات على نفس نطاق ربط الحمض النووي Runt ولكن مختلفة N- (البرتقالي) أو C-terminus (الأزرق). يتم الإشارة إلى موقع أزواج التحقيق /التمهيدي من طاقة بخطوط حمراء. تشير الأرقام إلى بقايا الأحماض الأمينية. (ب) تحليل RT-PCR الكمي في الوقت الحقيقي للنسخ المشتقة من RUNX1 P1 و P2 في مجموعات الخلايا مع (DEL) أو بدون (WT) الحذف ثنائي اللال11 . وقد استُخدمت الرابطة من أجل التطبيع. * و ** تشير P < 0.05 و P < 0.01, على التوالي عن طريق اختبار مان ويتني. تم تعديل هذا الرقم من تشنغ وآخرون18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells at JoVE.com

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

التسليم المباشر لمجمعات البروتين الريبي الريبي الريبي الريبي المجمعة مسبقاً هو وسيلة سريعة وفعالة لتحرير الجينوم في خلايا المكونة للدم. هنا، نستخدم هذا النهج لحذف كاتم صوت RUNX1 intronic وفحص الاستجابات النسخية في خلايا اللوكيميا OCI-AML3.

التحقيق في الدور النسخي لـ RUNX1 كاتم الصوت من قبل كريسبر/كاس9 ريبونوكليوبروتين في خلايا سرطان الدم النقوي الحاد

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

رابطة الدول المستقلة العناصر التنظيمية مثل المروجين والمعززات هي المحددات الرئيسية للتعبير الجيني. النهج التقليدية لدراسة هذه العناصر شاقة وغالبا ما تنطوي على استخدام الجينات مراسل غير مغايرة. هنا نبرهن على استخدام CRISPR لفحص دور النسخية كاتم الصوت INTRONIC RUNX1 في خط خلية سرطان الدم.البروتوكول بسيط التنفيذ ويسمح بإجراء تقييمات سريعة لوظائف تنظيم الجينات في سياق الجينات الذاتية. خلايا الدم غالبا ما يكون من الصعب transfect مع أساليب plasmid القائم. في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم electroporation لتقديم Cas9 مجمعة مسبقا، دليل الجيش الملكي النيبالي، المجمعات في الخلايا.وتشمل مزايا هذا النهج استخدام كفاءة التحرير المحسنة وقابلية الخلية للاستمرار، فضلا عن تقليل الآثار خارج نطاق الهدف. كما أن الاستخدام اللاحق لتحليل الأجزاء يتيح إجراء فحص بسيط وسريع للمستنسخات المتحولة المرغوبة من كمية كبيرة من العينات. إثبات الإجراء سيكون يوك لين يونغ، فني لمختبري.تبدأ من خلال تصميم اثنين من RNAs كريسبر، واحد خمسة رئيس الوزراء والأخرى ثلاثة رئيس الوزراء من العنصر التنظيمي رابطة الدول المستقلة الهدف، أو CRE. تأكد من وجود PAM من NGG مباشرة من التسلسل المستهدف للاعتراف Cas9. لتشكيل مجمع GRNA، قم بدمج الحمض النووي الريبي CRISPR والRNA المتتبع في مخزن TE المؤقت وفقًا لاتجاهات المخطوطات، وذلك للتركيز الدوبلوج النهائي لـ 44 ميكرومولار.احتضان الخليط في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق والسماح لها لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. تمييع نوى Cas9 المؤتلف مع PBS لتركيز النوى النهائي من 36 ميكرومولار. ثم اخلطي حجمًا متساويًا من النيوكلاز المخفف مع كل من الدوبليكس GRNA وحضنها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لمجمع RNP بالتشكل.جهاز طرد مركزي 2.5 مليون خلية في أنبوب 1.5 ملليلتر في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق. ثم تجاهل عظمى وإعادة تعليق الخلايا في 163 ميكرولترات من 1640 1640 1640 متوسطة دون الفينول الأحمر. إضافة 16.7 ميكرولترات من مجمع RNP و 3.6 ميكرولترات من 100 محسن كهربائي micromolar إلى الخلايا ونقل الخليط إلى 0.2 سنتيمتر الفجوة الكهربائية cuvette، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات.الكهربائي الخلايا ونقلها إلى قارورة ثقافة الأنسجة T-25 التي تحتوي على 6 ملليلتر من كامل 1640 1640 1640. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد يوم واحد من الكهربة، قم بتخفيف الخلايا إلى 5000 خلية لكل ملليلتر في 1640 دقيقة كاملة.وإضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلية في كل بئر من 96 بئرا النسيج لوحة الثقافة. زراعة الخلايا لمدة سبعة إلى 14 يوما ثم استخراج الحمض النووي الجينوم باستخدام نظام تنقية عالية الإنتاجية. إضافة 100 ميكرولترات من لوحة ملزمة وتحلل العازلة إلى كل بئر من لوحة استخراج 96 جيدا، تليها 50،000 الخلايا إعادة تعليق في 10 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.خلط محتويات جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للحمض النووي الجينومي لربط الآبار. ثم pirate بعناية الحل من الآبار وغسلها مع 120 ميكرولترات من العازلة الغسيل.الهواء يجف الصحن إضافة 20 ميكرولترات من مزيج PCR إلى كل بئر وتشغيل PCR وفقا لاتجاهات المخطوطات. بمجرد اكتمال التضخيم، قم بتقدير كمية المنتج عن طريق قياس تركيز عدد مختار من العينات باستخدام مقياس الفلور.تخفيف جميع العينات إلى 0.5 نانوغرام لكل ميكرولتر مع نواة المياه الحرة. مزيج ميكرولتر واحد من المنتج PCR المخفف مع 8.5 ميكرولترات من الفورماميد deionized و 0.5 ميكرولترات من معيار حجم الفلورسنت صبغ المسمى في 96 جيدا بلات متوافق مع محلل الوراثية. غطي الطبق بطبقة سيبتا وسخ العينات عند درجة 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق في دراجة حرارة.إجراء كهرباء شعرية لفصل المنتجات PCR المسمى وتحليل النتائج على برنامج التحليل. تحقق من رمز برتقالي لعرض الأجزاء المسماة ومستوى الحجم لتقييم جودة استدعاء الحجم. ثم، تحقق من الرمز الأزرق لعرض منتجات PCR المسماة.تحديد القمم المطابقة للمنتجات البرية والمتحولة وتقدير مستوى المتحول في كل عينة عن طريق تقسيم المنطقة تحت الذروة المتحولة حسب مجموع المنطقة تحت القمم البرية والمتحولة. حدد تجمعات الخلايا المتعددة مع مستويات عالية من الحذف المتوقع لمزيد من التخفيفات التسلسلية. كرر استخراج الحمض النووي، وPCR الفلورسنت، وخطوات الكهرباء الشعرية واختيار المستنسخين مع مستويات متحولة أكبر من 95٪ للتحليل اللاحق.استخراج RNA مجموع من المستنسخين المختارين وتنفيذ تخليق الحمض النووي مجانا. اخلطي الحمض النووي الريبي مع التمهيدي المتعدد T و dNTPs وفقًا لاتجاهات المخطوطات وحضن في درجة 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، ضع رد الفعل على الجليد لمدة دقيقة واحدة على الأقل.إضافة عشرة microliters من مزيج التوليف cDNA إلى رد الفعل. ثم احتضان العينة في 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة و 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق في دراجة الحرارة. بعد التوليف cDNA، علاج العينات مع ميكرولتر واحد من RNase H واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.تصميم التمهيدية و TaqMan تحقيقات على وجه التحديد للتباين نسخة الفردية التي تم إنشاؤها من المروجين البديلة واستنساخ شظايا الحمض النووي التي تحتوي على تسلسلات نسخة محددة في الحمض النووي plasmid. جعل سلسلة التخفيف عشرة أضعاف من plasmids المؤتلفة والمنحنيات القياسية لتكميم النص. إعداد 20 ميكرولترات من مزيج PCR لكل عينة وتشغيل PCR في الوقت الحقيقي وفقا لاتجاهات المخطوطات.تحليل النتائج وتطبيع عدد نسخة من النصوص المستهدفة في كل عينة مع جين التدبير المنزلي. وقد تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لحذف كاتم الصوت في ترونيك RUNX1 وتم تأكيد الحذف مع الكهربائي هلام الشعيرات الدموية. الأحجام المتوقعة من المنتجات البرية من النوع وPCR متحولة حوالي 500 أزواج قاعدة و 230 أزواج قاعدة على التوالي.حجم المنتجات المتحولة يمكن أن تختلف بين المستنسخين بسبب indels التي تشكلت في مواقع الانقسام. تم استخدام تسلسل السانجر لتأكيد هوية الحذف. الجين RUNX1 يحتوي على اثنين من المروجين، P1 و P2 التي أنتجت ثلاثة نسخ رئيسية من الميرنا: RUNX1c بواسطة P1، و RUNX1a و RUNX1b بواسطة P2. يمكن استخدام PCR الكمية في الوقت الحقيقي لتحديد كيفية تأثير حذف عنصر كاتم الصوت على التعبير عن هذه النصوص.تصميم جيد من RNAs CRISPR مهم لتقييمها للتجربة. تأكد من أن يتم حزم RNA CRSIPR بشكل وثيق إلى منطقة الحذف المقصودة. أيضا، ضمان من تسلسل PAM يقع في اتجاه المصب من التسلسل المستهدف للتعرف على Cas9.وبصرف النظر عن دراسة CREs، يمكن استخدام هذه الاستراتيجية لدراسات موقع الجينات، وتعمل كبديل لتدخل الحمض النووي الريبي لفحص وظائف الجينات. من خلال الجمع مع تقنيات التقاط التشكل الكروموسومي CRISPR سيساعد بالتأكيد فك تورط CREs في منظمة الجينوم المتغيرة والتعبير الجيني المرتبط بمشاكل صحية مختلفة مثل السرطان.

Research

JoVE Journal

Genetics

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein بوساطة تحرير الجينات الدقيقة عن طريق أنبوب الكهربائي

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

إدخال الجين بالضربة القاضية مباشرة في مرحلة Amastigote من التريبانوسوما كروزي باستخدام نظام CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...