Name: investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells
Uploaded: 2019-09-01T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells at JoVE.com

作者要感谢Minden教授（玛格丽特公主癌症中心，加拿大多伦多大学健康网络）提供OCI-AML3细胞系。此外，作者亦感谢癌症基因组学及病理生物学的核心公用事业（香港中文大学）为支持这项研究提供设施和协助。

1. crRNA的设计
<ol><li>使用基于 Web 的 CRISPR 设计工具 28、29、30、31 设计两个 crRNA，一个 5'，另一个 3' 目标 CRE。确保 NGG 的 PAM 位于 Cas9 识别的目标序列的正下游。两个crRNA（crRNA-1和crRNA-2）用于删除RUNX1消音器18的设计如图1所示。 注：crRNA通常包含一个20mer原间隔器，与目标序列互补。</li>
	<li>通过将序列的基因组位置输入在线基因组浏览器的搜索框中（例如，NCBI 1000 基因组或 UCSC 基因组浏览器），检查靶点和相邻 PAM 序列中是否存在单核苷酸多态性 （SNPs）/indels。 注：普通SNPs/indels在一般人群中具有至少1%的轻微等位基因频率。</li>
	<li>提交选定的 crRNA 序列，以便与商业供应商进行合成。此外，购买用于gRNA双工形成的tracrRNA。</li>
</ol>2. 删除筛选引体的设计
<ol><li>设计一对在预定删除区域侧边引的引体。确保引体至少来自 Cas9 裂解位点 50 bp，以便 PCR 扩增受裂解部位形成的印贝的影响最小。</li>
	<li>确保放大子小于 1，200 bp（最好小于 600 bp，以获得更好的尺寸分辨率）。此外，在 5' 端用荧光染料（例如，6-卡博氟辛 （6-FAM）） 标记其中一个引物，以便进行检测。用于筛选RUNX1消音器删除18的引物如图1所示。</li>
</ol>3. 制备Cas9/gRNA RNP复合物
<ol><li>将crRNA和tracrRNA重新悬浮在1xTE缓冲液中（10 mM Tris，0.1 mM EDTA，pH 7.5），最终浓度为200μM。</li>
	<li>对于每个crRNA，在0.2 mL管中混合2.2μL的200μMcrRNA，2.2μL的200μMtracrRNA和5.6μL的1x TE缓冲液（总计10μL），以获得44μM的最终双工浓度。</li>
	<li>在95°C下在热循环器中孵育5分钟。允许管冷却至室温，形成gRNA复合体。</li>
	<li>用7.6μL的1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释10.4μL的62 μM重组Cas9核酸酶，以获得36μM的最终核酸酶浓度。 注：这个量足以制备两个Cas9/gRNA复合物。</li>
	<li>将稀释的核酸酶的等体积（8.5 μL）与步骤3.3中获得的每个gRNA双工混合。</li>
	<li>在室温下孵育20分钟，使RNP形成复杂。将混合物留在冰上，直到电穿孔。</li>
</ol>4. RNP复合物电穿孔到OCI-AML3电池
<ol><li>RPMI 1640 培养基中的 OCI-AML3 细胞辅以 10% 热灭活胎儿牛血清 （FBS）、1x 谷氨酸、100 单位/毫升青霉素和 100 μg/mL 链霉素（以下简称完整 RPMI 1640 介质），在 37°C 下，5% CO2.</li>
	<li>使用锥蓝色染色数细胞。确保电穿孔时细胞的存活性超过90%。</li>
	<li>在室温下，在500 x g的1.5 mL管中将2.5 x 106个细胞离心5分钟。去除上清液，用1mL的1xPBS清洗细胞。再次旋转细胞并去除所有残留的上清液。</li>
	<li>在 163 μL 的 RPMI 1640 培养基中重新悬浮细胞，无苯酚红色。 向细胞中加入每个RNP复合物的16.7 μL（从步骤3.6开始）和3.6μL的100μM电穿孔增强剂（总体积= 200 μL）。通过移液轻轻混合。 注：电穿孔增强剂是提高编辑效率的载体DNA。</li>
	<li>将混合物转移到0.2厘米间隙电穿孔的搅拌机中，没有任何气泡。使用电穿孔系统执行电穿孔（模式：指数;电压 =： 150 V;电容 = 700 μF;电阻 = 50 Ω）。</li>
	<li>将细胞转移到含有6mL完整RPMI 1640介质的T-25组织培养瓶中，在37°C下孵育，CO 2%为2%。</li>
</ol>5. 筛选和选择具有双体删除的细胞克隆
<ol><li>电穿孔后一天，在完全 RPMI 1640 介质中将电池稀释至 5 x 103/mL。将100μL的稀释细胞悬浮液加入96孔组织培养板的每个孔中，让细胞生长7-14天。</li>
	<li>使用高通量纯化系统从细胞中提取基因组DNA。</li>
	<li>在 96 孔萃取板的每个孔中加入 100 μL 的板粘合和莱沙缓冲液。将5 x 104个细胞重新悬浮在10μL的1xPBS中加入缓冲液，并通过移液将其混合。</li>
	<li>在室温下孵育30分钟，使基因组DNA与井结合。</li>
	<li>在不刮掉井面的情况下，从井中吸出溶液。用120 μL的洗涤缓冲液清洗水井。</li>
	<li>空气干燥含有结合DNA的井。</li>
	<li>制备20μL的PCR混合物（2μL的10x高保真缓冲液，0.8 μL的50mMMgSO 4，0.4μL的10mM dNTPs，0.4μL的10μM FAM标记正向底漆（步骤2.2），0.4μL的10μM无标签反向底漆和0.4 U的TaqDNA聚合体每个样品。 注：准备主混合物，以确保在每个样品中添加标准化数量的试剂。</li>
	<li>将PCR混合物加入萃取板的每个井中，在热循环器中运行反应（条件：初始94°C2分钟，然后是35个周期，94°C，15秒，56°C，30秒，68°C1分钟）。</li>
	<li>使用荧光计测量所选样品中的浓度，估计产品量。用无核酸酶 H2O 至 0.5 纳克/μL 稀释所有样品。</li>
	<li>在与基因分析仪兼容的96孔板中，将稀释的PCR产物的1μL与8.5 μL的去离子化形式酰胺和0.5 μL荧光染料标记尺寸标准混合。 注：准备一个主混合物，其中包含去离子化形式酰胺和尺寸标准。</li>
	<li>用板隔膜盖住板，在 95°C 下在热循环器中使样品变性 3 分钟。请勿关闭机器盖。</li>
	<li>执行毛细管凝胶电泳，以分离标签PCR产品如前所述32。</li>
	<li>电泳后，打开分析软件分析结果。</li>
	<li>单击"新建项目"并选择"微型卫星"。然后单击"确定"。</li>
	<li>单击"将示例添加到项目"并选择结果文件（包含 .fsa 扩展名）。然后单击"添加到列表"以导入文件。</li>
	<li>在显示所选结果文件的表中，在"分析方法"列中选择"微卫星默认值"。此外，选择"大小标准"列中使用的尺寸标准。然后单击"分析"图标，输入实验名称并保存实验。</li>
	<li>单击"显示绘图"以查看结果，并在绘图设置中选择"片段分析"。</li>
	<li>选择适当的彩色通道进行分析。检查橙色图标以查看大小标准中标记的片段，以评估大小调用的质量。</li>
	<li>选中蓝色图标以查看标记的 PCR 产品。识别对应于野生型和突变体（即，具有预期缺失）产品的峰值。通过将突变峰下的面积除以野生型和突变峰下面积之和来估计每个样本中的突变水平。</li>
	<li>选择具有较高预期删除级别的多个单元格池，以便进行进一步的串行稀释。</li>
	<li>重复DNA提取、荧光PCR和毛细管电泳步骤。选择突变水平 >95% 的细胞克隆，表示双体缺失，以便后续分析。</li>
	<li>通过 Sanger 排序验证所选克隆中删除的标识。</li>
</ol>6. 实时定量RT-PCR分析消音器删除功能分析
<ol><li>从选定的克隆中提取总RNA，并进行互补DNA（cDNA）合成。</li>
	<li>将1μgRNA与1μL的50μM寡聚物（dT）20引物和1μL的10mM dNTP混合物混合在总体积为10μL中。在65°C下孵育5分钟，然后在冰上放置至少1分钟。</li>
	<li>加入含有2μL10x RT缓冲液、4μL25 mM MgCl 2、2 μL0.1 M DTT、1 μL RNase抑制剂（40 U/μL）和1μL逆转录酶（200 U/μL）的cDNA合成混合物。在50°C孵育50分钟，然后在热循环器中孵育5分钟，然后85°C孵育5分钟。 注：为逆转录准备主混音。</li>
	<li>在冰上冷却样品。加入1μL的RNase H，在37°C孵育20分钟，将cDNA储存在-20°C。</li>
	<li>设计引注和 TaqMan 探头，专门识别从替代启动器生成的单个转录器变体。 注：预先设计的特定于转录的引录/探针套件已上市。</li>
	<li>将包含特定转录序列的DNA片段克隆成质粒DNA。准备10倍稀释系列（106至10份）的重组质粒作为记录量定量的标准曲线。</li>
	<li>为每个样品制备20μL的PCR混合物（0.5 μL的DNA模板，1μL的20x预先设计的TaqMan探针/引体测定和10μL的2xTaqMan PCR主混合物）（cDNA和质粒标准）。测量三元样品。 注：为实时 PCR 准备主组合。</li>
	<li>在实时 PCR 机器中运行反应（条件：初始 50°C 2 分钟，95°C 10 分钟，然后 40 个 94 °C 循环 15 秒，60°C 1 分钟）。</li>
	<li>放大后，单击软件中的"分析"图标以分析数据。检查标准曲线的斜率和相关系数，以评估反应的效率和线性度。确保斜率介于 -3.1 和 -3.6 之间，相关系数大于 0.99。</li>
	<li>用内务管理基因（例如GAPDH）使每个样本中目标抄录本的副本数标准化。</li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

CRISPR/Cas9系统已用于广泛的基因组编辑应用，如基因敲除和敲录研究35，36，转录调节37，38，各种基因工程模型生物体39，40，41，42，43，44和基因治疗45，46。在这里，我们演示了CRISPR/Cas9的使用，以研究删除RUNX1基因上的电子消音器的功能后果。我们方法中CRISPR成分的交付不依赖于质粒DNA、gRNA或病毒的克隆，而是预先组装的Cas9/gRNA RNP复合物的电穿孔。已经表明，使用外源DNA可能与异量序列不可取地结合宿主基因组，增加毒性和低效率25，47，48，而病毒转导方法非常耗时。此外，从质粒DNA中长期表达Cas9可以增加脱靶效应48。相反，基于RNP的直接交付方法被确定为首选方法，因为它快速而直接，提高了编辑效率、选择性和细胞可行性。事实上，各种方法，如利泊物49，50，电穿孔25，51，纳米粒子52，细胞穿透肽53，iTOP54和TRIAMF55已开发用于高效 CRISPR/Cas9 交付到不同的细胞类型以及动物和植物物种24，25，26，56，57,58,59,60,61,62,63.由于非编码DNA序列是基因变异的热点64，在设计针对调控的gRNA时，检查目标序列和相邻PAM序列中是否存在常见的SNPs/indels特别相关元素。
CRISPR/Cas9基因组编辑的一个瓶颈涉及在大量样本中筛选所需的突变克隆。我们使用荧光PCR与毛细管凝胶电泳进行筛选，因为靶向突变是大约300bp的小基因组删除。此方法快速且敏感，可以高通量方式执行。此外，此方法允许同时精确估计突变水平和删除大小。此外，还支持对贴有不同荧光染料的PCR片段进行多路分析。我们一直经常使用这种技术基因型小插入/删除在骨髓肿瘤65，66。根据我们的经验，我们可以以高精度和突变负荷持续检测4 bp的片段大小，并将其突变负荷降至±3%。但是，需要注意的是，此方法的片段大小限制为 1，200 bp，因此不适合筛选大型删除。此外，无法检测其他基因组区域的基本替换（导致片段大小不变）和潜在的脱靶事件。对于后者，需要昂贵的全基因组测序来全面分析目标克隆中的全球不良变化。采用我们目前对大型非编码调控序列（>1，1，000 bp）的调查方法，可以使用体外报告基因测定对假定转录因子结合位点进行详细的删除和突变分析事先为CRISPR/Cas9编辑18划定最小功能区域。
由于许多基因包含多个启动子3，4，重要的是要意识到在目标基因位点中存在替代启动子，因为操纵调节元素可能对启动子产生差异。因此，需要单独测量从不同启动器派生的转录变体，以评估任何启动子特定响应。使用TaqMan基于探针的测定比SYBR Green更可取，因为具有更好的特异性和可重复性。如果有更先进的数字PCR系统，可以更精确地执行成绩单定量，而无需标准曲线构造。
在癌细胞系中执行CRISPR/Cas9实验的一个重要考虑因素是，当几乎所有癌细胞系都带有基因改变（包括结构和拷贝数变异）的细胞中，使用靶向基因拷贝数。在我们的例子中，OCI-AML3具有具有45至50条染色体的超倍体核糖核酸型。此外，细胞系被发现携带正常的RUNX1拷贝号，如从癌症细胞系百科全书67和荧光原位杂交研究18。当以具有拷贝数增益的基因为目标时，可能需要优化传递方法，以便为编辑提供足够的 CRISPR 组件级别。此外，可能需要筛选更多克隆，以便识别完整的挖空。重要的是，已经表明，针对扩增的基因组区域，尤其是那些由结构重组引起的区域，可以触发癌细胞中与基因无关的抗增殖反应，导致基因的假阳性结果功能研究68，69，70.在这方面，应采用RNA干扰（RNAi）敲除和/或cDNA过度表达等替代方法来验证CRISPR的发现。此外，应该使用多个细胞系来避免对细胞系特定但与基因无关的CRISPR编辑效果的误解。
CRISPR/Cas9 系统为基因组编辑提供了简单而高效的方法，彻底改变了基础和翻译研究。在这里，我们演示了使用CRISPR/Cas9来破坏癌细胞系转录研究的电子消音器的便利性。这种技术允许在DNA水平上研究CREs，并提供在内源性背景下检查CRE功能的机会，而不是传统的异源性报告基因。最近，基于CRISPR的RNA编辑系统也被确定为71个，可以作为研究CREs的新工具，通过瞄准从调控元素转录的RNA。通过结合染色体构象捕获技术，CRISPR/Cas9肯定会帮助破译CREs在改变的基因组组织和基因表达中与各种健康问题相关的参与。

Cis-调节元件（CREs）是非编码DNA序列，包含转录调控器的结合位点，用于控制基因表达1，2。这些元素通常为 100 到 1，000 个碱基对 （bp） 长。促进剂和增强剂是 CREs 的两种最具特征的类型。启动器靠近转录起始点，构成转录的基本单位。许多基因有多个促进者，他们的替代用途有助于转录组多样性和组织特异性3，4。另一方面，增强剂激活转录，可以位于目标基因的上游、下游或内源内。增强器可以从远处（在兆基上）起作用，并且独立于方向1，2。CREs还包括消音器和绝缘体5，6。前者与增强剂相反，通过结合转录抑制器来抑制基因表达，而后者将基因组分割成离散的拓扑域，以隔离来自相邻域的其他CREs的基因。这些元素通过短期和/或长距离染色质相互作用相互配合，并组织成调节中心，以引导适当的时空基因表达。高通量测序技术的最新进展加速了许多CRE的识别和功能注释，这大大促进了我们对指令谱系特定基因的转录网络的理解表达在不同的细胞和组织类型7，8，9，10，11，12。
鉴于CREs在调节转录方面的基本作用，它们的改变可能导致异常的基因表达。已经表明，CREs经常受到不同类型的人类癌症的遗传和表观遗传变化的干扰，从而促进肿瘤的启动、进展和攻击性13，14。此外，CRE结合因子往往在各种癌症类型中发生突变和/或表达错误，进一步突出了CRE放松管制在肿瘤发生15中的重要性。CREs也可能受到结构畸变的影响，例如免疫球蛋白重（IgH）基因增强剂的频繁染色体重组，导致B细胞淋巴瘤16中相邻肿瘤基因的异常激活。在急性骨髓性白血病（AML）中，通过染色体3q重新排列重新定位单个增强剂会导致伴随的GATA2降腔和EVI1活化，这有可能被BET抑制增强剂功能所瞄准17.最近，我们描述了一种新的染色体易位，涉及扰动的RUNX1电子消音器，可能有助于AML进展在儿科患者18。因此，破译非编码癌症基因组为阐明疾病发病机制、生物标志物发现和治疗干预提供了富有成果的途径，最终改善了患者的结果。
CRISPR/Cas9核酸酶通路，最初被确定为原核细胞中的适应性免疫系统，已被利用作为活细胞和生物体中特定部位基因组编辑的快速且具有成本效益的手段19、20 ，21，22.CRISPR/Cas9系统包括两个主要成分：gRNA和链球菌-衍生的Cas9核酸酶。gRNA 包含称为原间隔器的特定序列，该序列可识别目标区域并指示 Cas9 进行编辑。gRNA由两个部分组成：CRISPR RNA（crRNA），通常是与靶性DNA互补的20mer核苷酸序列，以及作为核酸酶结合支架的转活crRNA（trRNA）。Cas9 裂解需要紧挨着目标部位的原型空间邻图图案 （PAM） （5'-NGG），而裂解位点位于 PAM 上游的 3 个核苷酸。 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑通常通过转染细胞进行与一个质粒编码Cas9和克隆的gRNA23。然而，这种方法对造血细胞具有挑战性，因为造血细胞通常难以转染，并且需要冗长的基于病毒的转导方法。另一种方法是直接细胞交付预组装的Cas9/gRNA RNP复合物24。RNP输送的常用方法是电穿孔，在细胞膜中产生临时孔隙，从而允许RNP复合物进入细胞25，26。这种方法的优点包括易用性、减少脱靶效应和RNP复合物的稳定性。在这里，我们描述了使用RNP传递方法研究在OCI-AML3白血病细胞系18中RUNX1电子消音器的转录作用的协议，该细胞是从AML患者的外周血中建立的诊断为法美英M4亚型27。该协议包括crRNA的设计，RNP复合物的制备，电穿孔，以及所需克隆的筛选和随后的特征。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">0.2 cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652086</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1&#215;TE buffer, pH7.5</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">10mM dNTP mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">3500 Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4405673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 System SDS Software</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td>Version 1.3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Bio-Rad Gene Pulser Xcell system</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">CS11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-1</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-2</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Electroporation Enhancer</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">10270098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fluorometer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneMapper Software 5</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4475073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneScan 600 LIZ Size Standard</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4408399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PBS, 10X Solution, pH7.4</td>
			<td style="width:208px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:176px;">75889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11304029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1081058</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium without phenol red</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1a TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs04186042_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1b/c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs00231079_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs01021966_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1072533</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TRIzol Reagent</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Unlabeled PCR reverse primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells

人类基因组的大部分（+98%）由非编码序列组成。Cis-调节元件（CREs）是非编码DNA序列，包含转录调控器的结合位点，用于调节基因表达。CREs的改变与癌症等多种疾病有关。虽然促进者和增强剂是研究基因调控的主要CREs，但对消音器的作用知之甚少，而消音器是另一种调节基因抑制的CRE。CRISPR/Cas9最初被确定为原核生物中的适应性免疫系统，现已被利用为真核基因组编辑的有力工具。在这里，我们介绍使用这种技术来删除人类RUNX1基因中的一个电子消音器，并研究对OCI-AML3白血病细胞中基因表达的影响。我们的方法依靠两个预组装的Cas9/指南RNA（gRNA）核糖核蛋白（RNP）复合物的电穿孔介导交付，创建两个双链断裂（DSB），使消音器侧侧。删除内容可以通过片段分析进行轻松筛选。从替代启动子转录的不同mRNA的表达分析有助于评估促进者依赖效应。此策略可用于研究其他 CRE，特别适用于造血细胞，这些细胞通常难以使用基于质粒的方法转染。使用质粒和无病毒策略可以简单、快速地评估基因调控功能。

本实验的目的是删除RUNX1基因中的电子消音器，并检查对OCI-AML3细胞中RUNX1转录的影响。消音器通过组合分子方法鉴定，发现含有209 bp核心元素18。为了在控制RUNX1表达时能够更准确地评估这个核心元素，crRNA（crRNA-1和crRNA-2）被设计成接近这个区域18（图1）。crRNA-1和crRNA-2带来的预测的Cas9裂解位点分别来自核心元素29bp和35bp（图1）。需要注意的是，虽然两个 crRNA 的 PAM 站点位于相反的链上，但 DSB 将独立于 PAM 序列位置发生。因此，同时引入两种由crRNA-1和crRNA-2引导的Cas9/gRNA RNP复合物有望从RUNX1位点中去除消音器元素。
为了筛选大量样本中所需的缺失，基因组DNA提取试剂盒采用96井格式进行高通量纯化。此外，在萃取板井上结合的DNA可以直接放大，从而最大限度地减少重复样品转移造成的误差或污染。用于筛选删除 18 的引注如图1所示。野生型PCR产品的预期尺寸约为500bp。由于预期删除范围为 273 bp，突变产物预计约为 230 bp。这种尺寸范围通过毛细管凝胶电泳实现简单、快速的片段分析。共筛选了160个初始细胞池，发现14个细胞池携带预期缺失，突变水平至少为70%。然后，选择五个池进行进一步的序列稀释，以识别带有双体缺失的克隆。图2A显示了不同突变产物细胞克隆的代表性电目图。删除的标识通过桑格测序验证 （图 2B）。正如所料，在删除克隆中预测的裂解位点观察到由DSB33的非同源端连接修复形成的indel。这些导致不同大小的突变产物的扩增，也可以通过毛细血管电泳来检测（图2A）。
RUNX1基因包含两个启动子，即远端P1和近端P2，它们由一个装有消音器元件34的大内创体分离。三个主要的mRNA转录由这些促进者产生：RUNX1c由P1和RUNX1a和RUNX1b由P234。RUNX1c和RUNX1b的核苷酸序列是相同的，除了前者有一个独特的N-总站，从中可以设计一个特定的TaqMan基因表达测定（图3A）。为了测量RUNX1b，使用了识别RUNX1b和RUNX1c的 TaqMan 测定（图 3A）。然后，通过从RUNX1c中减去总RUNX1b/RUNX1c来确定RUNX1b水平。RUNX1a是一种明显较短的等形，由于替代拼接和特定的 TaqMan 测定可用于此变体 （图 3A）。因此，P1 和 P2 启动子的活动可以单独确定。实时定量RT-PCR显示，消音器元件的删除显著提升了P1和P2衍生转录本的表达水平（图3B）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig1.jpg"> 图 1： 策略删除RUNX1电子消音器。消音器（红色框）位于RUNX1基因的第一个内源，分离两个启动子P1和P2（显示hg19坐标）。设计了两个crRNA（crRNA-1和crRNA-2），以引入在消音器元件两侧的DSB。预测的 Cas9 裂解位点由垂直红线指示，PAM 站点 （NGG） 为紫色。用于筛选删除的两个引注由打开箭头表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig2.jpg"> 图 2：删除克隆的标识。（A） 具有代表性的细胞克隆电目图显示不同水平的突变PCR产物（MUT）。突变产物的大小因裂解部位形成的indel而异。WT = 野生型。（B） 通过桑格测序验证从代表性克隆中删除的删除。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig3.jpg"> 图 3：消音器删除的功能后果。（A） 显示了三个主要的 RUNX1 等形体（RUNX1a、RUNX1b 和 RUNX1c）。这些变体包含相同的 Runt DNA 绑定域，但不同的 N-（橙色）或 C-总站（蓝色）。TaqMan 探头/底漆对的位置用红线表示。数字表示氨基酸残留物。（B） 在 （DEL） 或无 （WT） 双体缺失18的细胞群中，对RUNX1 P1 和 P2 衍生转录本的实时定量 RT-PCR 分析。GAPDH用于规范化。* 和 * 分别指示P < 0.05 和P < 0.01，分别通过 Mann-Whitney 测试。这个数字已由程等人18日修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

直接交付预组装的Cas9/指南RNA核糖核蛋白复合物是造血细胞基因组编辑的快速而有效的方法。在这里，我们利用这种方法删除RUNX1电子消音器，并检查OCI-AML3白血病细胞的转录反应。

CRISPR/Cas9核糖核酸蛋白在急性骨髓性白血病细胞中的RUNX1电子消光器的转录作用研究

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

促进剂和增强剂等 Cis 调控元素是基因表达的关键决定因素。研究这些元素的传统方法非常费力，并且经常涉及使用异质记者基因。在这里，我们演示了CRISPR在白血病细胞系中检查R运行X1内电子消音器的转录作用。该协议执行简单，允许在内源基因环境中快速评估基因调控功能。造血细胞通常很难通过质粒基方法转染。在该协议中，我们使用电穿孔将预组装的Cas9、引导RNA、复合物传递到细胞中。这种方法的优点包括使用改进的编辑效率和细胞生存能力，以及减少目标外效果。此外，随后使用片段分析可以简单、快速地筛选大量样本中所需的突变克隆。演示程序将是余林荣，我的实验室技术员。首先设计两个CRISPRRNA，一个五个最主要，另一个目标 cis 调控元素的三个最主要元素，或 CRE。确保 NGG 的 PAM 位于 Cas9 识别的目标序列的正下游。要形成 gRNA 复合物，请根据手稿方向将CRISPR RNA和示踪剂RNA结合在TE缓冲液中，最终双面浓度为44微摩尔。在95摄氏度下孵育混合物5分钟，让其冷却至室温。用PBS稀释重组的Cas9核酸酶，最终核酸酶浓度为36微摩尔。然后将稀释的核酸酶与每种 gRNA 双工混合等量，并在室温下孵育20分钟，使 RNP 复合物形成。将250万个细胞在1.5毫升管中以500倍g离心5分钟。然后丢弃上流水，在RPMI 1640介质的163微升中重新悬浮细胞，不带酚红色。将 16.7 微升的 RNP 复合物和 3.6 微升的 100 微摩尔电穿孔增强剂添加到细胞中，并将混合物转移到 0.2 厘米间隙电穿孔盒中，注意不要引入任何气泡。电分细胞，并转移到T-25组织培养瓶包含6毫升的完整RPMI 1640介质。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞。电穿孔后一天，在完整的RPMI 1640介质中稀释细胞至每毫升5000个细胞。并将100微升细胞悬浮液加入96井组织培养板的每个井中。培养细胞7至14天，然后使用高通量纯化系统提取基因组DNA。在96井萃取板的每个井中加入100微升的板结合和解液缓冲液，随后在10微升PBS中重新悬浮5万个细胞。通过上下移液混合井内。在室温下孵育板30分钟，使基因组DNA与井结合。然后小心地从井中吸出溶液，然后用120微升的洗涤缓冲液清洗。空气干燥板。在每个井中添加 20 微升 PCR 混合物，然后根据手稿指示运行 PCR。放大完成后，通过用荧光计测量所选样品的浓度来估计产品量。用无核酸酶水稀释所有样品至每微升0.5纳米。将稀释 PCR 产品的一微升与 8.5 微升的去离子甲酰胺和 0.5 微升荧光染料标记尺寸标准混合在与遗传分析仪兼容的 96 井板中。用板隔膜盖住盘子，在95摄氏度下使样品在热循环器中变性三分钟。执行毛细管电泳以分离标记的 PCR 产品，并分析分析软件上的结果。检查橙色图标以查看标记的片段和大小标准，以评估大小调用的质量。然后，检查蓝色图标以查看标记的 PCR 产品。确定与野生类型和突变产品对应的峰，通过将突变峰下的区域除以野生型峰和突变峰下的区域之和来估计每个样本中的突变水平。选择多个具有高预期删除级别的单元池，以进一步进行串行稀释。重复DNA提取、荧光PCR和毛细管电泳步骤，并选择突变水平大于95%的克隆进行后续分析。从选定的克隆中提取总RNA，并进行免费DNA合成。根据手稿方向将RNA与多T底土和dNTP混合，在65摄氏度下孵育5分钟。然后，将反应放在冰上至少一分钟。在反应中加入十微升的cDNA合成混合物。然后在50摄氏度下孵育样品50分钟，在热循环器中孵育5分钟。cDNA合成后，用一微升RNase H处理样品，并在37摄氏度下孵育20分钟。设计底剂和TaqMan专门针对从替代启动子生成的单个转录表方差进行检测，并克隆含有特定转录序列的DNA片段，并克隆成质粒DNA。制作重组质粒的十倍稀释系列，作为转录量的标准曲线。为每个样品准备 20 微升 PCR 混合物，并根据手稿指示运行实时 PCR。分析结果，用家政基因使每个样本中目标转录本的拷贝数正常化。该协议已成功用于删除 RUNX1 电子消音器，并且使用毛细管凝胶电泳确认删除。野生型和突变PCR产品的预期大小分别是约500个碱基对和230个碱基对。突变产品的大小可能因克隆体而异，因为在裂解点形成 indel。桑格测序用于确认删除的标识。RUNX1基因包含两个启动子，P1和P2，它们产生三个主要的mRNA转录：运行X1c（P1）和R跑去1a和R运行X1b（P2）。实时定量 PCR 可用于确定消音器元素的删除如何影响这些脚本的表达。CRISPRRNA的一个好的设计对于它对实验进行评估非常重要。确保CRSIPR RNA与预定的删除区域紧密包装。此外，请确保与 PAM 序列位于 Cas9 识别的目标序列的下游。除了研究CRÉ，此策略可用于基因定位研究，并作为RNA干扰的替代方案，以检查基因功能。通过结合染色体构象捕获技术CRISPR，肯定有助于破译CR参与改变的基因组组织和基因表达与癌症等各种健康问题相关的基因表达。

Research

JoVE Journal

Genetics

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

选择依赖和独立生成CRISPR / Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

科研

遗传学

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

CRISPR/Cas9 和 SsODN 在人细胞中催化点突变修复功能的标准方法研究

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

整合酶缺陷慢病毒载体载体的制备及其在细胞 CRISPR/Cas9-mediated 基因敲除中的表达

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

斑马斑马模型系统中 CRISPR/Cas9-generated 基因挖空的高效生产与鉴定

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 对小鼠和人造血祖细胞的高效基因破坏

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A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

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