Name: investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells
Uploaded: 2019-09-01T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לפרופ ' מינדן (הנסיכה מרגרט מרכז הסרטן, רשת הבריאות של האוניברסיטה, טורונטו, קנדה) לאספקת קו התא OCI-AML3. גם, המחברים רוצים להודות כלי הליבה של הגנומיקה סרטן ו פתוביולוגיה (האוניברסיטה הסינית של הונג קונג) למתן מתקנים וסיוע תמיכה של מחקר זה.

1. עיצוב של crRNA
<ol><li>עיצוב שני crrnas, אחד 5 ' ו 3 השני ' של היצור היעד באמצעות אינטרנט מבוסס מכשיר העיצוב כדור28,29,30,31. ודא כי פאם של NGG ממוקם מיד במורד הזרם של רצף היעד עבור זיהוי Cas9. העיצוב של שני crRNAs (crRNA-1 ו-crRNA-2) למחיקה של RUNX1 משתיק18 מוצג באיור 1. הערה: CrRNA בדרך כלל מכיל 20-מר פרוטומרווח כי הוא משלים את רצף היעד.</li>
	<li>בדוק את הנוכחות של נוקלאוטיד בודד פולימורית (SNPs)/inדלים ב היעד ואת רצפי פאם הסמוך על ידי הזנת מיקומים גנומית של רצפים לתוך תיבת החיפוש של דפדפן הגנום המקוון (למשל, NCBI ג 1000 Genomes או מדפדפן הגנום UCSC). הערה: Snps נפוצים/indels יש תדירות אלל קטין של לפחות 1% באוכלוסיה הכללית.</li>
	<li>שלח את רצפי crRNA שנבחרו לסינתזה עם ספק מסחרי. כמו כן, לרכוש את tracrRNA עבור היווצרות דופלקס gRNA.</li>
</ol>2. עיצוב מחיקה התחל הקרנת
<ol><li>תכנון זוג צבעי יסוד האגף את אזור המחיקה המיועד. ודא כי התחל הם לפחות 50 bp מאתרי המחשוף Cas9 כך הגברה ה-PCR מושפע מינימלית על ידי indels שנוצרו באתרי המחשוף.</li>
	<li>ודא אמפליקון הוא קטן יותר 1,200 bp (רצוי קטן יותר מאשר 600 bp עבור רזולוציית גודל טוב יותר). כמו כן, סמן את אחד התחל עם צבע פלורסנט (למשל, 6-carboxyfluorescein (6-משפחה)) ב 5 '-end עבור איתור. הצבעי היסוד ששימשו להקרנה מחיקת משתיק RUNX1 18 מוצגים באיור 1.</li>
</ol>3. הכנת מכלולי Cas9/gRNA RNP
<ol><li>להשעות מחדש את crRNAs ו tracrRNA ב 1 x מאגר TE (10 מ"מ טריס, 0.1 mM EDTA, pH 7.5) לריכוז הסופי של 200 μM.</li>
	<li>עבור כל crRNA, לערבב 2.2 μL של 200 μM crRNA, 2.2 μL של 200 μM tracrRNA ו-5.6 μL של מאגר 1x TE (סה כ 10 μL) בתוך שפופרת בגודל של 0.2 mL כדי לקבל ריכוז דופלקס סופי של 44 μM.</li>
	<li>מודקון ב 95 ° c עבור 5 דקות בתוך הציקלייט. אפשר לצינורות להתקרר לטמפרטורת החדר עבור היווצרות מורכבות gRNA.</li>
	<li>לדלל 10.4 μl של 62 μm רקומביננטי Cas9 נוקלאז עם 7.6 μl של מלוחים 1x פוספט באגירה (PBS) כדי לקבל ריכוז סופי נוקלאז של 36 μm. הערה: סכום זה מספיק עבור הכנת שני מכלולי Cas9/gRNA.</li>
	<li>מערבבים כרכים שווים (8.5 μl) של נוקלאז מדולל עם כל דופלקסים grna שהתקבלו משלב 3.3.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר עבור 20 דקות כדי לאפשר היווצרות מורכבות RNP. השאר את התערובות על הקרח עד שתגיע לחשמל.</li>
</ol>4. אלקטרופורציה של מכלולי RNP לתוך OCI-AML3 תאים
<ol><li>תרבות OCI-AML3 תאים ב RPMI 1640 בינוני בתוספת של 10% חום בלתי מופעל העובר סרום (FBS), 1x גלוטמקס, 100 יחידות/mL של פניצילין ו 100 μg/mL של סטרפטומיצין (להלן המכונה RPMI השלם 1640 בינוני) ב 37 ° c עם 5% CO2.</li>
	<li>ספירת תאים תוך שימוש בטריבין כחול מכתים. ודא שיכולת הכדאיות של התא בזמן האלקטרופורציה היא מעל 90%.</li>
	<li>צנטריפוגה 2.5 x 106 תאים בצינור 1.5 mL ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים עם 1 מ ל של 1x PBS. לסובב את התאים שוב ולהסיר את כל שרידי supernatant.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים ב-163 μL של RPMI 1640 בינוני ללא פנול אדום.  הוסף 16.7 μL של כל קומפלקס RNP (משלב 3.6) ו 3.6 μL של 100 μM Electroporation משפר את התאים (סה כ נפח = 200 μL). מערבבים בעדינות על ידי ליטוף. הערה: משפר האלקטרופורציה הוא דנ א מוביל לשיפור יעילות העריכה.</li>
	<li>העבר את התערובת לקובט אלקטרופורציה של 0.2 ס מ ללא בועות. בצע אלקטרופורציה עם מערכת אלקטרופורציה (מצב: מעריכי; מתח =: 150 V; קיבוליות = 700 μF; התנגדות = 50 Ω).</li>
	<li>להעביר את התאים בקבוקון תרבות T-25 רקמות המכיל 6 מ ל של RPMI 1640 בינונית להשלים ו-מודטה ב 37 ° צ' עם 5% CO2.</li>
</ol>5. הקרנה ובחירה של שיבוטים תא עם מחיקות Biallelic
<ol><li>לדלל את התאים כדי 5 x 103/מ ב להשלים RPMI 1640 בינוני יום אחד לאחר electroporation. הוסף 100 μL של השעיית התא מדולל לתוך כל טוב של 96-ובכן לוחיות התרבות רקמות ולאפשר לתאים לגדול עבור 7-14 ימים.</li>
	<li>לחלץ דנ א גנומית מן התאים באמצעות מערכת טיהור של תפוקה גבוהה.</li>
	<li>הוסף 100 μL של מאגר כריכת לוחית ומאגרי הליזה לכל טוב של צלחת החילוץ 96 היטב. הוסף 5 x 104 תאים מושעה 10 μl של 1X PBS למאגר ולערבב אותם על ידי ליטוף.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות כדי לאפשר כריכה של דנ א גנומית לבארות.</li>
	<li>מנטול את התמיסה מבארות מבלי לגרד את משטחי הבאר. לשטוף את הבארות עם 120 μL של שטיפת מאגר.</li>
	<li>האוויר יבש את הבארות. המכילות את הדנ א המאוגד</li>
	<li>הכינו 20 μL של שילוב PCR (2 μL של מאגר באיכות גבוהה של 10x, 0.8 μL של 50 mM MgSO4, 0.4 μl של 10 מ"מ dNTPs, 0.4 μl של 10 ΜM משפחה מתויג קדימה (שלב 2.2), 0.4 μl של 10 μm הפוך פריימר לאחור ו-0.4 U של taq DNA פולימראז עבור כל דוגמה). הערה: להכין תערובת הורים כדי להבטיח תוספת של כמויות סטנדרטיות של ריאגנטים בכל מדגם.</li>
	<li>הוסיפו את שילוב ה-PCR לכל הבאר של לוחית החילוץ והפעל את התגובות בציקלונימטר (תנאים: ראשוני 94 ° c עבור 2 דקות, ואחריו 35 מחזורים של 94 ° צ' עבור 15 s, 56 ° c עבור 30 s ו-68 ° c עבור 1 דקות).</li>
	<li>העריכו את כמות המוצרים על ידי מדידת הריכוזים שלהם במספר נבחר של דגימות באמצעות פלואורומטר. לדלל את כל הדגימות עם nuclease-H חינם2O כדי 0.5 Ng/μl.</li>
	<li>מערבבים 1 μL של מוצרי ה-PCR המדולל עם 8.5 μL של מאותמיד של הטופסו 0.5 μL של תקן פלורסנט שכותרתו צבע בקנה מידה 96-באר תואם עם מנתח גנטי. הערה: הכן שילוב מאסטר המכיל. את הטופסהרגיל והגודל הסטנדרטי</li>
	<li>מכסים את הצלחת עם צלחת septa ואת הדגימות ב 95 ° c עבור 3 דקות בתוך התרדנית. . אל תסגור את המכסה של המכונה</li>
	<li>מבצעים אלקטרופורזה בג קפילר כדי להפריד בין מוצרי ה-PCR המסומנים כמתואר בעבר32.</li>
	<li>לאחר האלקטרופורזה, פתח את תוכנת הניתוח כדי לנתח את התוצאות.</li>
	<li>לחץ על פרוייקט חדש ובחר מיקרו- לווין. לאחר מכן לחץ על אישור.</li>
	<li>לחץ על הוסף דוגמאות לפרוייקט ובחר את קבצי התוצאות (מכילים את הסיומת. fsa). לאחר מכן לחץ על הוסף לרשימה כדי לייבא את הקבצים.</li>
	<li>בטבלה המציגה את קבצי התוצאות שנבחרו, בחר בברירת מחדל Microsatellite בעמודה שיטת ניתוח . כמו כן, בחר את תקן הגודל הנמצא בשימוש בעמודה ' גודל רגיל '. לאחר מכן , לחץ על סמל הניתוח, הזן את שם הניסוי ושמור את הניסוי.</li>
	<li>לחץ על מגרשים לתצוגה כדי להציג את התוצאות ובחר בניתוח קטע בהגדרת ההתוויה.</li>
	<li>בחר את הערוצים הצבעוניים המתאימים לניתוח. בדוק את הסמל הכתום כדי להציג את הקטעים שסומנו בתקן הגודל כדי להעריך את איכות ההתקשרות.</li>
	<li>בדוק את הסמל הכחול כדי להציג את מוצרי ה-PCR המסומנים. זהה את הפסגות המתאימות לסוג הפראי ולמוטציות (כלומר, הנושאות את מחיקות הצפויות). העריכו את רמת המוטציות בכל מדגם על-ידי חלוקת האזור מתחת לשיא המוטציות לפי סכום האזור שמתחת לפסגות הסוג הפראי והמוטציות.</li>
	<li>בחר מספר מאגרי תאים עם רמות גבוהות של המחיקות הצפויות לצורך המשך הדילול הסדרתי.</li>
	<li>חזור על הפקת הדי-אן-איי, הפלורסנט וצעדי האלקטרופורזה בנימים. בחר שיבוטים תא עם רמות מוטציה > 95% המייצגים מחיקות biallelic עבור הניתוחים הבאים.</li>
	<li>אמת את זהותו של מחיקות במשובטים שנבחרו על ידי רצף Sanger.</li>
</ol>6. ניתוחים פונקציונליים של מחיקת משתיק קול בזמן אמת כמותי-ניתוח PCR
<ol><li>לחלץ RNA סה כ מן המשובטים שנבחרו ולבצע משלימה DNA (cDNA) סינתזה.</li>
	<li>מערבבים 1 μg של RNA עם 1 μL של 50 μM oligo (dT)20 פריימר ו 1 μl של 10 מ"מ שילוב dntp בנפח כולל של 10 μl. דגירה ב 65 ° צ' עבור 5 דקות ולאחר מכן מקום על הקרח עבור לפחות 1 דקות.</li>
	<li>הוסף 10 μL של שילוב סינתזה של cDNA המכיל 2 μL של מאגר 10x RT, 4 μL של 25 מ"מ MgCl2, 2 μl של 0.1 M dtt, 1 μl של מעכב RNase (40 u/μl) ו-1 μl של היפוך הטרנססקריפט (200 u/μl). מודקון ב 50 ° c עבור 50 דקות ולאחר מכן 85 ° צ' עבור 5 דקות בתוך התרדנית. הערה: הכינו תערובת מאסטר. לתעתיק הפוך</li>
	<li>. תרגיע את הדגימות על הקרח הוסף 1 μL של RNase H ו-דגירה ב 37 ° c עבור 20 דקות. לאחסן את cDNA ב-20 ° c.</li>
	<li>עיצוב התחל ובדיקה TaqMan המכירים באופן ספציפי גרסאות תעתיק בודדות שנוצרו מיזמים חלופיים. הערה: מתוכנן מראש תעתיק-מערכות הבדיקה הספציפיות-מסחרית זמין.</li>
	<li>שיבוט שברי DNA המכיל את רצפי התעתיק הספציפיים ל-DNA פלמיד. הכינו סדרת דילול בעלת 10 מקפלים (106 עד 10 עותקים) של רקומביננטי פלמידים כעקומות סטנדרטיות לתעתיק.</li>
	<li>להכין 20 μL של שילוב PCR (0.5 μL של תבנית ה-DNA, 1 μL של 20 x מעוצב מראש TaqMan בדיקה/פריימר ו 10 μL של 2x TaqMan PCR מאסטר מיקס) עבור כל מדגם (הן cDNA ו פלמיד סטנדרטים). מדוד כל מדגם בטרילקאט. הערה: הכינו תערובת ראשית. ל-PCR בזמן אמת</li>
	<li>הפעל את התגובות ב-PCR בזמן אמת (תנאים: ראשוני 50 ° c עבור 2 דקות ו 95 ° צ' עבור 10 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 94 ° c עבור 15 s ו-60 ° c עבור 1 דקות).</li>
	<li>לאחר הגברה, לחץ על הסמל ' נתח ' בתוכנה כדי לנתח את הנתונים. בדוק את השיפוע ואת מקדם המתאם של עקומות סטנדרטיות כדי להעריך את היעילות ואת יניאריות של התגובות. ודא כי המדרונות הם בין-3.1 ו-3.6 ומקדמי המתאם גדולים מ 0.99.</li>
	<li>לנרמל את מספר העותקים של התעתיקים של היעד בכל מדגם עם גן משק בית (למשל, לגנד).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

Crispr/Cas9 מערכת נעשה שימוש במגוון רחב של יישומים לעריכת הגנום כגון הנוקאאוט גנטי ו טוק-in מחקרים35,36, transcript תקנה37,38, הנדסה גנטית של שונים מודל אורגניזמים39,40,41,42,43,44 וטיפול גנטי45,46. כאן, אנו להדגים את השימוש CRISPR/Cas9 כדי לחקור את ההשלכות הפונקציונליות של מחיקת משתיק קול מנוטרוניק על הגן RUNX1 . המסירה של הרכיבים CRISPR בגישה שלנו לא להסתמך על ה-DNA באמצע, שיבוט של gRNA או וירוס אבל אלקטרופורציה של טרום התאספו Cas9/gRNA RNP מכלולי. זה הוכח כי השימוש ב-DNA אקסוגני יכול להיות קשור עם שילוב לא רצוי של רצפים וקטוריים זרים לתוך הגנום המארח, רעילות מוגברת ויעילות נמוכה25,47,48, בעוד שיטות התמרה וירוסים מגזול זמן רב. בנוסף, ביטוי ממושך של Cas9 מ-DNA פלמיד יכול להגדיל את ההשפעות מחוץ ליעד48. להיפך, הגישה ישיר RNP מבוסס מסירה הוקמה כשיטה המועדפת כפי שהוא מהיר וישיר עם יעילות עריכה משופרת, בסלקטיביות והכדאיות התא. אכן, מגוון של שיטות כגון ליפוף49,50, אלקטרופורציה25,51, חלקיקים52, תאים בעלי חדירה לתא53, itop54 ו triamf 55 פותחו עבור crispr יעיל/Cas9 משלוח לתוך סוגי תאים מגוונים כמו גם בעלי חיים ומינים צמח24,25,26,56,57 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63. מכיוון שאינם קידוד רצפי DNA הם נקודות חמות של וריאציות גנטיות64, בדיקת נוכחות של snps משותף/indels ביעד ורצפי פאם השכנה רלוונטי במיוחד בעת עיצוב grna כי מטרות הרגולציה רכיבים.
צוואר בקבוק ב CRISPR/Cas9 הגנום עריכה כרוכה הקרנת שיבוטים מוטציה הרצוי במספר רב של דגימות. אנו מועסקים ה-PCR הפלורסנט בשילוב עם אלקטרופורזה ג'ל קפילר עבור ההקרנה כמו מוטציה היעד הוא מחיקה גנומית קטנה של כ 300 bp. שיטה זו מהירה ורגישה וניתן לבצעה בצורה של תפוקה גבוהה. כמו כן, שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של רמות מוטציה וגדלי מחיקה בו זמנית. בנוסף, קיימת תמיכה בניתוח של קטעי PCR המסומנים בצבעי פלורסנט שונים. אנחנו כבר באופן שגרתי באמצעות טכניקה זו כדי גנוטיפ הוספות/מחיקות קטנות מיאלואידית מיאלואיד65,66. בניסיון שלנו, אנחנו יכולים לזהות בעקביות גדלי קטעים שונים על ידי 4 bp עם דיוק גבוה ועומס מוטציה עד ~ 3%. עם זאת, יש לציין כי שיטה זו יש מגבלת גודל קטע של 1,200 bp, ולכן הוא אינו מתאים להקרנה של מחיקות גדולות. כמו כן, לא ניתן לזהות החלפות בסיס (כתוצאה מגודל המקטע ללא שינוי) ומאירועים פוטנציאליים מחוץ ליעד באזורים גנומית אחרים. עבור האחרון, רצף הגנום היקר כולו נדרש כדי באופן מקיף שינויים בלתי רצויים גלובלי בפרופיל במשובטים היעד. כדי לאמץ את הגישה הנוכחית שלנו לחקירה של רצפים גדולים שאינם מצפינה קידוד (> 1000 bp), מחיקה מפורטת וניתוח מוטארזיס של אתרי כריכה של שעתוק הגורם באמצעות מבחנה שניתן לבצע מראש כדי להתוות את האזור הפונקציונלי מינימלי עבור CRISPR/Cas9 עריכה18.
כמו גנים רבים מכילים יותר מאשר אחד היזמים3,4, חשוב להיות מודעים לקיומו של יזמים חלופיים במקום הגן היעד כמו מניפולציה אלמנטים הרגולציה עשוי להשפיע על היזמים הדיפרנציאלי. לפיכך, יש למדוד משתנים שמקורם ביזמים שונים כדי להעריך את כל התגובות הספציפיות ליזם. השימוש של TaqMan בדיקה המבוססת על המחקר הוא מועדף על SYBR גרין בגלל ספציפיות יותר ומחדש. אם מערכת ה-PCR הדיגיטלית המתקדמת יותר זמינה, ניתן לבצע את התמליל בצורה מדויקת יותר ללא הצורך בבניית עקומות סטנדרטיות.
שיקול חשוב בביצוע הניסויים CRISPR/Cas9 בתור תאים סרטניים הוא הפלויידי והיעד מספר העתק של התאים בשימוש כמעט כל התאים הסרטניים הנמל שינויים גנטיים כולל וריאציות מבנה העתק מספר. במקרה שלנו, OCI-AML3 יש היפרדיפלואיד קריוטיפ עם 45 כדי 50 כרומוזומים. גם, קו התא נמצא לשאת מספר RUNX1 עותק רגיל כפי שנחשף מתוך האנציקלופדיה קו התא של סרטן67 ו הזריחה במחקר היברידיזציה באתרו18. בעת המיקוד של גן עם רווח מספר עותק, ייתכן ששיטת המסירה צריכה להיות ממוטבת כדי לספק רמות מספיקות של רכיבי CRISPR עבור העריכה. כמו כן, שיבוטים נוספים צריך להיות מוקרן כדי לזהות את הנוק אאוט מלאה. חשוב מכך, זה הוכח כי מיקוד באזורים גנומית מוגברת, במיוחד אלה הנגרמים על ידי הסדרים מבניים, יכול להפעיל התגובות נגד גנים עצמאיים נגד ההתרבות בתאי הסרטן, המוביל לתוצאות שווא-חיוביים בגנים מחקרים פונקציונליים68,69,70. בהקשר זה, גישות חלופיות כמו RNA התערבות (RNAi) הסתרה ו/או cDNA ביטוי יתר צריך להיות מועסק כדי לאמת את ממצאי CRISPR. כמו כן, יש להשתמש בקווי תא מרובים כדי להימנע מפענוח שגוי של אפקטי עריכה ייחודיים לקווי הטלפון אך לא עצמאיים.
מערכת CRISPR/Cas9 יש מהפכה בסיסי מחקר טרנסלtional על ידי מתן אמצעי פשוט ויעיל לעריכת הגנום. כאן אנו מדגימים את הקלות של השימוש CRISPR/Cas9 כדי לשבש משתיק קול בלתי הטרונית ללימודי הטרנסטרונים קו התאים הסרטניים. טכניקה זו מאפשרת לימוד של CREs ברמת ה-DNA ומציעה את ההזדמנויות לבחון את פונקציות היצור בהקשר האנדוגניים ולא את הגנים כתב הטרוולוגי המסורתי. לאחרונה, מערכת העריכה של RNA מבוססי CRISPR יש גם זיהה71 ו עשוי לשמש כלי הרומן ללמוד cres על ידי פילוח של RNA המועתק מן האלמנטים הרגולטורים. על ידי שילוב עם טכניקות לכידת כרומוזום קונפורמציה, CRISPR/Cas9 בהחלט לעזור לפענח את עורבות של CREs בארגון הגנום שונה ביטוי גנים המקושרים בעיות בריאות שונות.

רכיבי ה- Cis-רגולציה (cres) הם רצפי DNA שאינם מצפינה קידוד המכילים אתרי קשירה לרגולטורים טרנססקריפט כדי לשלוט בביטוי הגנים1,2. רכיבים אלה הם בדרך כלל 100 כדי 1,000 זוגות בסיס (bp) ארוך. היזמים ומשפרי הם שני הסוגים האופיינים ביותר של CREs. היזמים נוכחים בסמיכות לאתרי התחלת התמלול ומהווים את יחידת התמלול הבסיסית. גנים רבים יש יותר מיזם אחד והשימוש האלטרנטיבי שלהם תורם הגיוון הטרנססקריפט ורקמות ספציפיות3,4. מצד שני, משפרי להפעיל תמלול יכול להיות ממוקם במעלה, במורד או בתוך introns של הגנים היעד. משפרי יכולות לפעול ממרחק רב (מעל מגאז) וללא תלות באוריינטציה1,2. Cres כוללים גם משתיקי קול ומבודד5,6. מעשים לשעבר באופן משפרי כדי לעכב את ביטוי הגנים על ידי קשירה repressors הטרנס, בעוד האחרון מחיצות את הגנום לתוך תחומים בנפרד טופולוגית כדי לבודד גנים מ CREs אחרים מתחומים שכנים. רכיבים אלה פועלים ביחד עם השני באמצעות אינטראקציות קצרות ו/או טווח ארוך של כרומטין ומאורגנות בתוך רכזות רגולטוריות כדי להפנות ביטוי גנטי מתאים באופן זמני. הפיתוחים האחרונים בטכניקות רצף התפוקה הגבוהה האיצו את זיהוי וביאור פונקציונלי של CREs רבים אשר הקלו מאוד את ההבנות שלנו של רשתות הטרנססקריפט המכתיבים שושלת היוחסין גן ספציפי ביטוי בסוגים שונים של תאים ורקמות7,8,9,10,11,12.
בהינתן התפקידים הבסיסיים של CREs בוויסות התעתיק, השינויים שלהם יכולים להוביל לביטוי גנטי מסוים. הוכח כי cres מופרת לעתים קרובות על ידי שינויים גנטיים ואפיגנטיים בסוגים שונים של סרטן האדם, ובכך לתרום חניכה הגידול, התקדמות ותוקפנות13,14. בנוסף, גורמי הקשירה מוטציה לעתים קרובות ו/או לוחצים בסוגים שונים של סרטן, הדגשת עוד יותר את המשמעות של רגולציה היצור באונבגנזה15. CREs יכול גם להיות מושפע סטיות מבנית, כפי שניתן למשל על ידי הסדרים תכופים מחדש של כרומוזום החיסוני כבדים (הגבוה) משפר גנים כי התוצאה הפעלה חריגה של אונגנים השכנה ב-cell לימפומה16. ב לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML), מיקום מחדש של משפר אחד על ידי כרומוזום 3q הסדרים מחודשת גורם במקביל GATA2 downregulation ו EVI1 הפעלה, אשר יכול להיות ממוקד על ידי ההימור בעיכוב של פונקציות שיפור 17. לאחרונה, אפיינו את הטרנסלוקציה כרומוזומלית מעורבים בRUNX1 משתיק קול שעשוי לתרום להתקדמות AML בחולה ילדיםבן 18. Thus, פענוח הגנום שאינו קידוד מספק שדרות פורה לגילוי המחלה בפתוגנזה מחלה, תגלית ביואריקר והתערבויות טיפוליות, אשר בסופו של דבר לשפר את תוצאות המטופל.
מסלול crispr/Cas9 נוקלאז, מזוהה במקור כמערכת חיסונית אדפטיבית בתאי prokaryotic, נוצל כאמצעי מהיר וחסכוני עבור האתר ספציפי לעריכה גנומית בתאי החיים ואורגניזמים19,20 ,21,22. מערכת CRISPR/Cas9 כוללת שני מרכיבים עיקריים: gRNA ו סטרפטוקוקוס pyogenesנגזר Cas9 nuclease. ה-gRNA מכיל רצף ספציפי הנקרא פרוטוספייס המזהה את אזור היעד ומפנה Cas9 לעריכה. GRNA מורכב משני חלקים: CRISPR RNA (crRNA), בדרך כלל רצף הנוקלאוטיד 20-mer משלימה את ה-DNA היעד, ו crRNA הפעלה טרנס (tracrRNA), אשר משמש הגרדום קשירה עבור nuclease. המוטיב הסמוך מוטיב (פאם) (5 '-NGG) בסמוך לאתר היעד נדרש עבור המחשוף Cas9 ואת אתר המחשוף ממוקם 3 נוקלאוטידים במעלה הזרם של פאם. CRISPR/Cas9-תיווך העריכה באופן שכיח על ידי בתאי החוצה עם באמצע הפלזמה המקודד Cas9 והוא משוכפל gRNA23. עם זאת, גישה זו מאתגרת עבור תאים המטבטיים, אשר לעתים קרובות קשה transfect ודורשים שיטות ממושך המבוססת על וירוסים. גישה חלופית היא משלוח סלולרי ישיר של טרום התאספו Cas9/gRNA RNP מתחמי24. שיטה נפוצה עבור משלוח rnp היא אלקטרופורציה, אשר מייצרת נקבוביות זמניות בקרום התא, ובכך מאפשר כניסה של מכלולי rnp לתוך התאים25,26. היתרונות של גישה זו כוללים קלות שימוש, הפחתת היעד של ההשפעות והיציבות של מכלולי RNP. כאן, אנו מתארים פרוטוקול של שימוש בשיטת משלוח RNP כדי לחקור את התפקיד הטרנסקריפטלי של משתיק RUNX1 אינטרוניק ב-OCI-AML3 לוקמיה קו התאים18, אשר הוקמה מן הדם ההיקפי של מטופל AML שאובחנו עם הסוג הצרפתי-אמריקאי-בריטי של M427. הפרוטוקול כולל את העיצוב של crRNA, הכנת מכלולי RNP, אלקטרופורציה, כמו גם הקרנה והאפיון הבאים של המשובטים הרצוי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">0.2 cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652086</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1&#215;TE buffer, pH7.5</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">10mM dNTP mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">3500 Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4405673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 System SDS Software</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td>Version 1.3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Bio-Rad Gene Pulser Xcell system</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">CS11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-1</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-2</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Electroporation Enhancer</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">10270098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fluorometer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneMapper Software 5</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4475073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneScan 600 LIZ Size Standard</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4408399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PBS, 10X Solution, pH7.4</td>
			<td style="width:208px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:176px;">75889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11304029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1081058</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium without phenol red</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1a TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs04186042_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1b/c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs00231079_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs01021966_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1072533</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TRIzol Reagent</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Unlabeled PCR reverse primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells

החלק העיקרי של הגנום האנושי (~ 98%) מורכבת מרצפים שאינם מצפינה קידוד. רכיבי Cis-רגולטוריות (cres) הם שאינם קידוד רצפי DNA המכילים אתרי קשירה עבור הרגולטורים הטרנססקריפט כדי לווסת את הביטוי הגנטי. שינויים של CREs היו מעורבים במחלות שונות כולל סרטן. בעוד היזמים משפרי היו CREs העיקרי עבור לימוד התקנה גנים, מעט מאוד ידוע על התפקיד של משתיק קול, שהוא סוג אחר של היצור המדיטים גנים הדיכוי. זוהה במקור כמו מערכת חסינות אדפטיבית prokaryotes, crispr/Cas9 כבר ניצל להיות כלי רב עוצמה עבור הגנום איקריוטית. כאן, אנו מציגים את השימוש בטכניקה זו כדי למחוק משתיק קול ב- RUNX1 gene האנושי ולחקור את ההשפעות על הביטוי הגנטי בתאי OCI-AML3 לוקמיה. הגישה שלנו מסתמך על משלוח אלקטרופורציה-מתווך של שני התאספו Cas9/מדריך RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) מתחמי ליצור שני שבירת הגדיל כפול (DSBs) כי האגף משתיק קול. מחיקות ניתן לוקרן בקלות על ידי ניתוח קטע. ניתוח ביטויים של mRNAs השונים ששועתק מיזמים חלופיים מסייעים בהערכת אפקטים תלויי-היזם. אסטרטגיה זו ניתן להשתמש כדי ללמוד CREs אחרים והוא מתאים במיוחד עבור תאים המטבטיים, אשר לעתים קרובות קשה transfect עם שיטות מבוססות פלבאמצע. השימוש באסטרטגיה מגנטית ונטולת וירוסים מאפשר הערכות פשוטות ומהירות של פונקציות רגולטוריות של גנים.

מטרת הניסוי הזה היא למחוק משתיק קול בגנים הRUNX1 ולבחון את ההשפעות על תמלול RUNX1 בתאים OCI-AML3. משתיק קול זוהה על ידי גישה מולקולרית קומבינטורית ומצאו להכיל אלמנט הליבה bp 20918. כדי לאפשר הערכה מדויקת יותר של רכיב ליבה זה בשליטה RUNX1 Expression, crRNAs (crrna-1 ו-crrna-2) תוכננו להתמקד קרוב לאזור זה18 (איור 1). הCas9 החזוי אתרי המחשוף שהובאו על ידי crRNA-1 ו-crRNA-2 היו 29 bp ו 35 bp מאלמנט הליבה, בהתאמה (איור 1). יצוין כי בעוד האתרים פאם של שני crRNAs שוכנים על קווצות מנוגדים, DSBs תתרחש באופן עצמאי מיקום הרצף של פאם. כך, המבוא המקביל של שני Cas9/gRNA RNP מתחמי מונחה על ידי crRNA-1 ו-crRNA-2 צפוי לבלו את אלמנט משתיק קול מלוקוס RUNX1 .
כדי לעבור על המסך עבור מחיקות הרצוי במספר רב של דגימות, פורמט 96-היטב של ערכת החילוץ DNA גנומית שימש לטיהור תפוקה גבוהה. כמו כן, ה-DNA כרוך על הבארות של לוחיות החילוץ יכול להיות נתון הגברה ישירה, ובכך מזעור שגיאות או זיהום עקב העברה לדוגמה חוזרת. הצבעי היסוד המשמשים להקרנת מחיקות18 מוצגים באיור 1. הגודל הצפוי של מוצר ה-PCR מסוג פראי הוא כ 500 bp. מאז המחיקה מיועד משתרע על 273 bp, המוצר מוטציה צפוי להיות כ 230 bp. טווח גודל זה מאפשר ניתוח השבר פשוט ומהיר על ידי אלקטרופורזה ג'ל קפילר. סך של 160 בריכות התאים הראשוניים הוקרן ו 14 נמצאו לבצע מחיקות צפוי עם רמות מוטציה של לפחות 70%. חמש בריכות נבחרו אז עבור מדלל סדרתי נוסף כדי לזהות שיבוטים הנושאת biallelic מחיקות. הנציג electropherograms מתוך שיבוטים תא עם רמות שונות של מוצרי מוטציה מוצגים באיור 2א. זהות המחיקות אומתה באמצעות רצפי רצף של סאנגר (איור 2ב'). כצפוי, indels שנוצרו על ידי שאינם הומוולוגיים הצטרפות התיקון של DSBs33 נצפו באתרי המחשוף החזוי במשובטים המחיקה. התוצאה היא הגברה של מוצרי מוטציה בגדלים שונים, אשר ניתן גם לזהות על ידי אלקטרופורזה קפילר (איור 2א).
הגן RUNX1 מכיל שני היזמים כלומר המרוחק P2 האבותיים, אשר מופרדים על ידי אינטרון גדול מחסה את אלמנט משתיק34. שלושה התעתיקים העיקריים של mRNA מיוצרים על ידי היזמים הללו: RUNX1c על-ידי P1 ו- RUNX1a RUNX1b על-ידי P234. רצף נוקלאוטיד של RUNX1c ו RUNX1b זהים למעט לשעבר יש N-טרמינוס ייחודי, ממנו שיטת הביטוי הגן הספציפי taqman יכול להיות מעוצב (איור 3א). כדי למדוד RUNX1b, שיטת TaqMan מזהה הן RUNX1b והן RUNX1c היה בשימוש (איור 3א). רמות RUNX1b נקבע אז על ידי הפחתת סך RUNX1b/RUNX1c מ RUNX1c. RUNX1a הוא isoform קצר במובהק עקב שחבור חלופיים ושיטת TaqMan ספציפית זמינה עבור variant זה (איור 3א). כך, את הפעילות של P1 ו P2 היזמים ניתן לקבוע בנפרד. בזמן אמת כמותי RT-PCR הראה כי מחיקה של אלמנט משתיק קול באופן משמעותי את רמות הביטוי של התעתיקים של P1 ו-P2 הנגזר (איור 3ב).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig1.jpg"> איור 1 : אסטרטגיה למחוק את משתיק הקול הRUNX1 נית. משתיק קול (אדום תיבה) ממוקם אינטרון הראשון של הגן RUNX1 הפרדת שני היזמים P1 ו P2 (קואורדינטות hg19 מוצגים). שני crRNAs (crRNA-1 ו-crRNA-2) נועדו להחדיר DSBs מאגף את אלמנט משתיק קול. הCas9 החזוי אתרי המחשוף מצוינים על ידי קווים אדומים אנכיים ואתרי פאם (NGG) הם בסגול. שני הצבעי היסוד המשמשים להקרנת המחיקות מיוצגים באמצעות חיצים פתוחים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig2.jpg"> איור 2 : זיהוי של המשובטים מחיקה. (א) מייצג אלקטרו pheroגרמות של שיבוטים תא מראה רמות שונות של מוטאנטים PCR מוצרים (MUT). הגודל של מוצרי מוטציה משתנה בין המשובטים בגלל indels שנוצרו באתרי המחשוף. WT = פראי. (ב) אימות מחיקות של שיבוטים מייצגים על ידי קביעת רצף של סאנגר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig3.jpg"> איור 3 : השלכות פונקציונליות של מחיקת משתיק קול. (א) שלושת RUNX1 הצורות המרכזיות (RUNX1a, RUNX1b ו-RUNX1c) מוצגות. גרסאות אלה מכילות את אותו תחום כריכת ה-DNA של גמד, אבל שונה N-(כתום) או C-טרמינוס (כחול). המיקום של זוגות בדיקה/פריימר של TaqMan מצוין על ידי קווים אדומים. מספרים מצביעים על. שאריות חומצת האמינו (ב) בזמן אמת כמותי RT-PCR ניתוח של RUNX1 P1-ו P2 נגזר התעתיקים של אוכלוסיות תאים עם (DEL) או ללא (WT) מחיקות biallelic18. שימוש בגנד לנורמליזציה. * ו * * לציין p < 0.05 ו p < 0.01, בהתאמה על ידי מבחן מאן-ויטני. דמות זו שונתה מצ ואח '18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells at JoVE.com

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

מסירה ישירה של טרום התאספו Cas9/מדריך RNA ribonuאופאנפרוטאין מתחמי הוא אמצעי מהיר ויעיל לעריכת הגנום בתאי המטפאות. כאן, אנו מנצלים את הגישה הזאת כדי למחוק משתיק RUNX1 ביטרוניק ולבחון את התגובות הטרנדיות בתאי OCI-AML3 לוקמיה.

חקירת התפקיד הטרנססאני של משתיק הRUNX1 נית על ידי CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein בתאי לוקמיה מיאלואיד חריפה

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

אלמנטים Cis-רגולטוריים כמו מקדמים משפרי הם הקובעים העיקריים של ביטוי גנים. גישות מסורתיות לחקר אלמנטים אלה הן מייגע ולעתים קרובות כרוך בשימוש בגנים כתב הטרולוגי. כאן אנו מדגימים את השימוש ב- CRISPR כדי לבחון את תפקידו התמלולי של משתיק בלתי טרון RUNX1 בקו תא לוקמיה.הפרוטוקול הוא פשוט לבצע ומאפשר הערכות מהירות של פונקציות רגולטוריות גנים בהקשר הגנים אנדוגני. תאים hematopoietic הם לעתים קרובות קשה לשנות עם שיטות מבוססות פלסמיד. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים באלקטרופוזיה כדי לספק Cas9 מורכב מראש, מדריך RNA, קומפלקסים לתוך התאים.היתרונות של גישה זו כוללים שימוש ביעילות עריכה משופרת וכדאיות התא, כמו גם אפקטים מחוץ ליעד מופחת. כמו כן, השימוש הבא בניתוח שברים מאפשר סינון פשוט ומהיר של שיבוטי המוטנטים הרצויים מכמות גדולה של דגימות. הדגמת ההליך תהיה יוק-לין יונג, טכנאי למעבדה שלי.התחל בתכנון שני RNAs CRISPR, אחד חמישה ראשוניים ושלושת הפריים השני של רכיב cis-תקינה היעד, או CRE. ודא כי PAM של NGG ממוקם מיד במורד הזרם של רצף היעד עבור זיהוי Cas9. כדי ליצור את קומפלקס gRNA, שלב את ה- CRISPR RNA ואת ה- RNA של המעקב במאגר TE בהתאם לכיווני כתב היד, לריכוז דופלקס סופי של 44 מיקרומולרים.הדגירה את התערובת ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לדלל את גרעין Cas9 רקומביננטי עם PBS עבור ריכוז גרעין סופי של 36 מיקרומולר. לאחר מכן מערבבים נפח שווה של הגרעין המדולל עם כל אחד מדופלקסים gRNA ו דגירה אותם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את קומפלקס RNP להיווצר.צנטריפוגה 2.5 מיליון תאים בצינור 1.5 מיליליטר ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. ואז להשליך את supernatant מחדש להשעות את התאים 163 microliters של RPMI 1640 בינוני ללא פנול אדום. הוסף 16.7 microliters של קומפלקס RNP ו 3.6 microliters של 100 מיקרומולרי אלקטרופוזיה משפר לתאים ולהעביר את התערובת 0.2 ס"מ-פער אלקטרופורציה cuvette, דואג לא להציג בועות.אלקטרופולטורה התאים ולהעביר אותם לבקבוק תרבות רקמה T-25 המכיל 6 מיליליטר של מדיום RPMI מלא 1640. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני. יום אחד לאחר אלקטרופורציה, לדלל את התאים ל 5000 תאים למיליליטר במדיום RPMI 1640 מלא.ולהוסיף 100 microliters של ההשעיה התא לתוך כל באר של צלחת תרבות רקמות 96 היטב. תרבות התאים במשך שבעה עד 14 ימים ואז לחלץ DNA גנומי באמצעות מערכת טיהור תפוקה גבוהה. הוסף 100 microliters של לוח מחייב מאגר תזה לכל באר של צלחת מיצוי 96-welled, ואחריו 50, 000 תאים מושעה מחדש ב 10 microliters של PBS.מערבבים את תכולת הבאר על ידי צינור למעלה ולמטה. להדגרת הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות כדי לאפשר לדנ"א הגנומי להיקשר ל הבארות. לאחר מכן בזהירות שאפו את הפתרון מה בארות ולשטוף אותם עם 120 microliters של חיץ לשטוף.האוויר מייבש את הצלחת. הוסף 20 microliters של PCR לערבב לכל באר ולהפעיל PCR על פי הוראות כתב יד. לאחר השלמת ההגברה, להעריך את כמות המוצר על ידי מדידת הריכוז של מספר נבחר של דגימות עם פלואורומטר.לדלל את כל הדגימות ל 0.5 ננוגרם למיקרוליטר עם מים חופשיים גרעין. יש לערבב מיקרוליטר אחד של מוצר PCR מדולל עם 8.5 מיקרוליטרים של נוקאמידים לא מיומנים ו-0.5 מיקרוליטרים של תקן גודל פלורסנט המסומן בצבע בפלטה של 96 באר התואמת לניתוח הגנטי. מכסים את הצלחת עם septa צלחת denature את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות בתרמוצ'יקה.בצע אלקטרופורזה נימית כדי להפריד את מוצרי PCR המסווים ולנתח את התוצאות על תוכנת הניתוח. בדוק את הסמל הכתום כדי להציג את הקטעים המסווים ואת תקן הגודל כדי להעריך את איכות הקריאה לגודל. לאחר מכן, בדוק את הסמל הכחול כדי להציג את מוצרי PCR המסווים.זהה את הפסגות המתאימות למוצרים מסוג בר ומוטנטים והערך את רמת המוטנטים בכל מדגם על ידי חלוקת האזור מתחת לשיא המוטנטים בסכום האזור מתחת לפסגות הבר והמוטנטים. בחר מאגרי תאים מרובים עם רמות גבוהות של המחיקות הצפויות לדילול טורי נוסף. חזור על מיצוי ה- DNA, PCR פלואורסצנטי, שלבי אלקטרופורזה נימי ובחר שיבוטים עם רמות מוטנטים גדולות מ - 95% לניתוח הבא.לחלץ RNA הכולל מן השיבוטים שנבחרו ולבצע סינתזת DNA משלימה. מערבבים את ה- RNA עם פריימר פולי-טי ו- dNTPs בהתאם לכיווני כתב היד והידגירה ב-65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, מניחים את התגובה על קרח לפחות דקה אחת.הוסף עשרה microliters של סינתזה cDNA לערבב לתגובה. ואז להדגיר את המדגם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות ו 85 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות בתרמוצ'יקלר. לאחר סינתזת cDNA, לטפל בדגימות עם microliter אחד של RNase H ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.עיצוב פריימרים ובדיקות TaqMan במיוחד עבור שונות תעתיק בודדים שנוצר מיזמים חלופיים לשכפל את שברי ה-DNA המכילים את רצפי התמליל הספציפיים לתוך DNA פלסמיד. הפוך סדרת דילול פי עשרה של פלסמידים רקומביננטי כמו עקומות סטנדרטיות לכמות תעתיק. הכינו 20 מיקרוליטרים של תערובת PCR לכל דגימה והפעילו את ה-PCR בזמן אמת בהתאם לכיווני כתב היד.לנתח את התוצאות ולנרמל את מספר העותק של תעתיקי היעד בכל דגימה עם גן משק בית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה למחיקת המשתיק האנטרוני RUNX1 והמחיקה אושרה עם אלקטרופורזה של ג'ל נימי. הגדלים הצפויים של מוצרי PCR מסוג פראי ומוטנטים הם כ-500 זוגות בסיסים ו-230 זוגות בסיסים בהתאמה.גודל המוצרים המוטנטים יכול להשתנות בין השיבוטים בגלל הכופרים שנוצרו באתרי המחשוף. רצף סנגר שימש לאישור זהות המחיקות. הגן RUNX1 מכיל שני מקדמים, P1 ו- P2 אשר ייצרו שלושה תעתיקי mRNA עיקריים:RUNX1c על ידי P1, ו RUNX1a ו RUNX1b על ידי P2. PCR כמותי בזמן אמת יכול לשמש כדי לקבוע כיצד המחיקה של אלמנט משתיק המשפיעים על הביטוי של תעתיקים אלה.עיצוב טוב של CRISPR RNAs חשוב להערכת הניסוי. ודא ש- CRSIPR RNA ארוז באופן הדוק לאזור המחיקה המיועד. כמו כן, ודא שרצף PAM ממוקם במורד הזרם של רצף היעד עבור זיהוי Cas9.מלבד לימוד CREs, אסטרטגיה זו יכולה לשמש למחקרי מיקום גנים ומשמשת חלופה להתערבות RNA לבחינת תפקודי גנים. על ידי שילוב עם טכניקות לכידת קונפורמציה כרומוזום CRISPR בהחלט יעזור לפענח את המעורבות של CREs בארגון הגנום שונה ביטוי גנים הקשורים לבעיות בריאותיות שונות כמו סרטן.

Research

JoVE Journal

Genetics

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...