Name: investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells
Uploaded: 2019-09-01T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells at JoVE.com

लेखकों OCI-AML3 सेल लाइन प्रदान करने के लिए प्रो एमडी Minden (प्रिंस मार्गरेट कैंसर सेंटर, विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क, टोरंटो, कनाडा) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इसके अलावा, लेखक इस शोध के समर्थन में सुविधाएं और सहायता प्रदान करने के लिए कैंसर जीनोमिक्स और पैथोबायोलॉजी (चीनी विश्वविद्यालय हांगकांग) की कोर उपयोगिताएँ धन्यवाद देना चाहूंगा।

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

CRISPR/Cas9 प्रणाली जीनोम संपादन अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में इस्तेमाल किया गया है जैसे जीन नॉकआउट और दस्तक में अध्ययन35,36, प्रतिलेखन विनियमन37,38, विभिन्न की आनुवंशिक इंजीनियरिंग निलेश जीव39,40,41,42,43,44 और जीन चिकित्सा45,46. यहाँ, हम RUNX1 जीन पर एक intronic साइलेंसर को हटाने के कार्यात्मक परिणामों की जांच करने के लिए CRISPR/Cas9 के उपयोग का प्रदर्शन. हमारे दृष्टिकोण में CRISPR घटकों की डिलीवरी प्लाज्मिड डीएनए पर निर्भर नहीं था, gRNA या वायरस की क्लोनिंग लेकिन preassembled Cas9/gRNA RNP परिसरों के विद्युत poration. यह दिखाया गया है कि बहिर्जात डीएनए का उपयोग मेजबान जीनोम में विदेशी वेक्टर दृश्यों के अवांछनीय एकीकरण के साथ जुड़ा हो सकता है, विषाक्तता में वृद्धि हुई और कम दक्षता25,47,48, जबकि वायरस transduction तरीकों समय लेने वाली हैं. इसके अलावा, प्लाज्मिड डीएनए से Cas9 की लंबी अभिव्यक्ति बंद लक्ष्य प्रभाव48बढ़ा सकते हैं. इसके विपरीत, प्रत्यक्ष आरएनपी-आधारित वितरण दृष्टिकोण को पसंदीदा विधि के रूप में स्थापित किया गया है क्योंकि यह बेहतर संपादन दक्षता, चयनात्मकता और सेल व्यवहार्यता के साथ तेज और सीधा है। वास्तव में, lipofection49,50, इलेक्ट्रोपोरेशन25,51,नैनोकणों52, सेल-पेरेटिंग पेप्टाइड्स53, iTOP54 और TRIAMF के रूप में तरीकों की एक किस्म 55 कुशल CRISPR/Cas9 वितरण के लिए विभिन्न सेल प्रकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पशु और पौधों की प्रजातियों24,25,26,56,57 में विकसित किया गया है , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63.चूंकि गैर-कोडिंग डीएनए अनुक्रम आनुवंशिक विविधताओं के आकर्षण के केंद्र हैं64, लक्ष्य में सामान्य SNPs/indels की उपस्थिति की जाँच और पड़ोसी पीएएम दृश्यों विशेष रूप से प्रासंगिक है जब gRNA डिजाइन कि नियामक लक्ष्य तत्वों.
CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन में एक बाधा नमूने की एक बड़ी संख्या में वांछित उत्परिवर्ती क्लोन की स्क्रीनिंग शामिल है. हम फ्लोरोसेंट पीसीआर कार्यरत स्क्रीनिंग के लिए केशिका जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस के साथ मिलकर के रूप में लक्ष्य उत्परिवर्तन के बारे में 300 बीपी का एक छोटा सा जीनोमिक विलोपन है. इस विधि तेजी से और संवेदनशील है और एक उच्च throughput फैशन में किया जा सकता है. इसके अलावा, इस विधि उत्परिवर्ती स्तर और हटाने के आकार का सही आकलन एक साथ अनुमति देता है. इसके अलावा, विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल पीसीआर टुकड़े के मल्टीप्लेक्स विश्लेषण का समर्थन किया है। हम नियमित रूप से इस तकनीक का उपयोग माइलॉयड नियोप्लाज्म65,66में जीनोटाइप छोटे निवेशों/ हमारे अनुभव में, हम लगातार टुकड़ा आकार है कि उच्च परिशुद्धता और उत्परिवर्ती बोझ के साथ 4 बीपी से अलग कर रहे हैं का पता लगा सकते हैं $3 % करने के लिए नीचे. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस विधि में 1,200 बीपी का एक टुकड़ा आकार सीमा है, और इस प्रकार यह बड़े विलोपन की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके अलावा, आधार प्रतिस्थापन (अपरिवर्तित टुकड़ा आकार में परिणाम) और अन्य जीनोमिक क्षेत्रों में संभावित ऑफ-लक्ष्य घटनाओं का पता नहीं लगाया जा सकता है। बाद के लिए, महंगा पूरे जीनोम अनुक्रमण व्यापक लक्ष्य क्लोन में वैश्विक अवांछनीय परिवर्तन प्रोफ़ाइल करने के लिए आवश्यक है। बड़े गैर-कोडिंग नियामक दृश्यों की जांच के लिए हमारे वर्तमान दृष्टिकोण को अपनाने के लिए (gt; 1,000 बीपी), एक विस्तृत विलोपन और putative प्रतिलेखन कारक बाइंडिंग साइटों के mutagenesis विश्लेषण इन विट्रो रिपोर्टर जीन परख का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है CRISPR/Cas9 संपादन18के लिए न्यूनतम कार्यात्मक क्षेत्र को रेखांकित करने के लिए पहले से .
चूंकि कई जीनों में एक से अधिक प्रवर्तक3,4होते हैं , इसलिए लक्ष्य जीन टिड्डी में वैकल्पिक प्रवर्तकों के अस्तित्व के बारे में जागरूक होना महत्वपूर्ण है क्योंकि विनियामक तत्वों में हेर-फेर करने से प्रवर्तकों में अंतर प्रभावित हो सकता है। इस प्रकार, विभिन्न प्रमोटरों से व्युत्पन्न ट्रांसक्रिप्ट वेरिएंट को किसी भी प्रमोटर-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए अलग-अलग मापा जाना चाहिए। TakMan जांच आधारित परख का उपयोग बेहतर विशिष्टता और reproducibility की वजह से SYBR ग्रीन पर पसंद किया जाता है. यदि और अधिक उन्नत डिजिटल पीसीआर प्रणाली उपलब्ध है, प्रतिलिपि परिमाणीकरण मानक वक्र निर्माण की आवश्यकता के बिना और अधिक ठीक किया जा सकता है.
कैंसर सेल लाइनों में CRISPR/Cas9 प्रयोगों के प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण विचार loidy और लक्ष्य जीन प्रतिलिपि संख्या लगभग सभी कैंसर सेल लाइनों के रूप में इस्तेमाल किया कोशिकाओं में संरचनात्मक और प्रतिलिपि संख्या विविधताओं सहित आनुवंशिक परिवर्तन बंदरगाह है. हमारे मामले में, OCI-AML3 45 से 50 गुणसूत्रों के साथ एक hyperdipoid karyotype है. इसके अलावा, सेल लाइन एक सामान्य RUNX1 प्रतिलिपि संख्या ले के रूप में कैंसर सेल लाइन विश्वकोश67 और situ संकरीकरण अध्ययन में फ्लोरोसेंट से पता चला पाया गया18. प्रतिलिपि संख्या लाभ के साथ किसी जीन को लक्षित करते समय, वितरण विधि को संपादन के लिए CRISPR घटकों के पर्याप्त स्तर प्रदान करने के लिए ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, अधिक क्लोन पूरी नॉकआउट की पहचान करने के क्रम में जांच करने की आवश्यकता हो सकती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह दिखाया गया है कि प्रवर्धित जीनोमिक क्षेत्रों में लक्ष्यीकरण, विशेष रूप से संरचनात्मक पुनर्व्यवस्थाओं के कारण, कैंसर कोशिकाओं में जीन-स्वतंत्र एंटीप्रोलाइफल प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकता है, जिससे जीन में झूठे सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं कार्यात्मक अध्ययन68,69,70. इस संबंध में, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएई) नॉकडाउन और/या सीडीएनए ओवरएक्सप्रेशन जैसे वैकल्पिक दृष्टिकोणों को CRISPR निष्कर्षों को सत्यापित करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, कई सेल लाइनों सेल लाइन विशेष लेकिन जीन स्वतंत्र CRISPR संपादन प्रभाव की गलत व्याख्या से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
CRISPR/Cas9 प्रणाली जीनोम संपादन के लिए एक सरल और कुशल साधन प्रदान करके बुनियादी और अनुवाद अनुसंधान में क्रांति ला दी है. यहाँ हम CRISPR/Cas9 का उपयोग करने में आसानी का प्रदर्शन करने के लिए एक कैंसर सेल लाइन में ट्रांसक्रिप्शनल अध्ययन के लिए एक intronic silencer बाधित. इस तकनीक के डीएनए स्तर पर CREs के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और अंतर्जात संदर्भ में CRE कार्यों की जांच करने के अवसर प्रदान करता है बजाय पारंपरिक विषमगुण रिपोर्टर जीन. हाल ही में, एक CRISPR आधारित आरएनए संपादन प्रणाली भी71 की पहचान की गई है और नियामक तत्वों से लिखित आरएनए को लक्षित करके सीआरई का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं। गुणसूत्र रचना पर कब्जा तकनीक के साथ संयोजन करके, CRISPR/Cas9 निश्चित रूप से बदल जीनोम संगठन और जीन अभिव्यक्ति विभिन्न स्वास्थ्य समस्याओं से जुड़े में CREs की भागीदारी को समझने में मदद मिलेगी.

Cis-नियामकतत्व (CREs) गैर-कोडिंग डीएनए अनुक्रम हैं जिनमें जीन अभिव्यक्ति1,2को नियंत्रित करने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के लिए बाध्यकारी साइटें होती हैं. इन तत्वों को आम तौर पर कर रहे हैं 100 करने के लिए 1,000 आधार जोड़े (bp) लंबे. प्रमोटरों और enhancers सीआरई के दो सबसे विशेषता प्रकार हैं. प्रमोटरों प्रतिलेखन शुरू साइटों के करीब निकटता में मौजूद हैं और प्रतिलेखन की बुनियादी इकाई का गठन. अनेक जीनों में एक से अधिक प्रवर्तक होते हैं और उनके वैकल्पिक उपयोग का योगदान प्रतिलेखन विविधता तथा ऊतक विशिष्टता3,4में होता है . दूसरी ओर, enhancers प्रतिलेखन को सक्रिय करने और ऊपर, बहाव या लक्ष्य जीन के introns के भीतर स्थित किया जा सकता है. बढ़ाने दूर से कार्य कर सकते हैं (एक megabase से अधिक) और अभिविन्यास के स्वतंत्र1,2. सीआरई में साइलेंसर और इंसुलेटर5,6 भी शामिलहैं. पूर्व कार्य विपरीत enhancers के लिए ट्रांसक्रिप्शनल दमनकारी के लिए बाध्यकारी द्वारा जीन अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए, जबकि बाद में असतत topologically डोमेन में जीनोम विभाजन पड़ोसी डोमेन से अन्य CREs से जीन को बचाने के लिए. ये तत्व लघु और/या लंबी दूरी के क्रोमैटिन बातचीत के माध्यम से एक दूसरे के साथ मिलकर कार्य करते हैं और उचित spatiotemporal जीन अभिव्यक्ति को निर्देशित करने के लिए नियामक केन्द्रों में आयोजित किए जाते हैं। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीकों में हाल की प्रगति ने कई सीआरई की पहचान और कार्यात्मक एनोटेशन को त्वरित किया है जिसने वंश-विशिष्ट जीन को निर्देशित करने वाले ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क की हमारी समझ को बहुत आसान बना दिया है विभिन्न कोशिकाओं और ऊतकों में अभिव्यक्ति7,8,9,10,11,12.
प्रतिलेखन को विनियमित करने में CREs की मौलिक भूमिकाओं को देखते हुए, उनके परिवर्तन aberant जीन अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह दिखाया गया है कि सीआरई अक्सर मानव कैंसर के विभिन्न प्रकार में आनुवंशिक और epigenetic परिवर्तन द्वारा बाधित कर रहे हैं, जिससे ट्यूमर दीक्षा, प्रगति और आक्रामकता13,14के लिए योगदान . इसके अलावा, सीआरई बाध्यकारी कारकों अक्सर उत्परिवर्तित कर रहे हैं और / सीआरई भी संरचनात्मक विपथन से प्रभावित हो सकते हैं, जैसा कि इम्यूनोग्लोबुलिन भारी (आईजीएच) जीन बढ़ाने के लगातार गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थाओं द्वारा उदाहरणदिया जाता है जिसके परिणामस्वरूप बी-सेल लिंफोमा में पड़ोसी ऑनकोजेन्स 16 की असामान्य सक्रियण होती है। घातक माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में, गुणसूत्र 3Q पुनर्व्यवस्थाद्वारा एक एकल बढ़ाने की repositioning सहवर्ती GATA2 downregation और EVI1 सक्रियण, जो संभावित बढ़ाने कार्यों की शर्त अवरोध द्वारा लक्षित किया जा सकता है का कारण बनता है 17.हाल ही में, हम एक उपन्यास गुणसूत्र स्थानांतरण एक RUNX1 intronic साइलेंसर है कि एक बाल चिकित्सा रोगी18में एएमएल प्रगति के लिए योगदान कर सकते हैं के क्षोभ शामिल विशेषता . इस प्रकार, गैर-कोडिंग कैंसर जीनोम को समझने से रोग रोगजनन, बायोमार्कर खोज और चिकित्सीय हस्तक्षेपों को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी अवसर प्रदान होते हैं, जो अंततः रोगी परिणामों में सुधार करते हैं।
CRISPR/Cas9 न्यूक्लिएस मार्ग, मूल रूप से प्रोकैरियोटिक कोशिकाओं में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के रूप में पहचान की, जीवित कोशिकाओं और जीवों में साइट-विशिष्ट जीनोमिक संपादन के लिए एक तेजी से और लागत प्रभावी साधन के रूप में शोषण किया गया है19,20 ,21,22. CRISPR/Cas9 प्रणाली दो प्रमुख घटक शामिल हैं: gRNA और Streptococus pyogenes- व्युत्पन्न Cas9 nuclease. GRNA लक्ष्य क्षेत्र पहचानता है और संपादन के लिए Cas9 निर्देशित प्रोटोस्पेसर नामक एक विशिष्ट अनुक्रम शामिल हैं। GRNA दो भागों से बना है: CRISPR आरएनए (crRNA), आम तौर पर एक 20-मर न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम लक्ष्य डीएनए के पूरक, और एक ट्रांस सक्रिय crRNA (tracrRNA), जो nuclease के लिए एक बाध्यकारी पाड़ के रूप में कार्य करता है. एक प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (PAM) (5'-NGG) तुरंत लक्ष्य साइट के निकट Cas9 दरार के लिए आवश्यक है और दरार साइट स्थित है 3 न्यूक्लियोटाइड PAM के ऊपर. CRISPR/Cas9-मध्यस्थ जीन संपादन आमतौर पर transfecting कोशिकाओं द्वारा किया जाता है एक प्लाज्मिड के साथ जो Cas9 को एन्कोड करता है और क्लोन gRNA23. हालांकि, यह दृष्टिकोण हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के लिए चुनौतीपूर्ण है, जो अक्सर ट्रांसफेक्ट करने के लिए मुश्किल होते हैं और लंबा वायरस-आधारित ट्रांसडक्शन तरीकों की आवश्यकता होती है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण preassembled Cas9/gRNA RNP परिसरों24के प्रत्यक्ष सेलुलर वितरण है. आरएनपी वितरण के लिए एक आम विधि इलेक्ट्रोपोरण है, जो कोशिका झिल्ली में अस्थायी छिद्र उत्पन्न करता है, इस प्रकार कोशिकाओं में आरएनपी परिसरों के प्रवेश की अनुमति देता है25,26. इस दृष्टिकोण के लाभ में उपयोग में आसानी, कम ऑफ-लक्ष्य प्रभाव और आरएनपी परिसरों की स्थिरता शामिल है। यहाँ, हम OCI-AML3 ल्यूकेमिया सेल लाइन18में एक RUNX1 intronic साइलेंसर की ट्रांसक्रिप्शनल भूमिका की जांच करने के लिए आरएनपी वितरण विधि का उपयोग करने के एक प्रोटोकॉल का वर्णन, जो एक एएमएल रोगी के परिधीय रक्त से स्थापित किया गया था फ्रेंच-अमेरिकी-ब्रिटिश M4 उपप्रकार27के साथ का निदान | प्रोटोकॉल crRNA के डिजाइन, आरएनपी परिसरों की तैयारी, इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ ही स्क्रीनिंग और वांछित क्लोन के बाद लक्षण शामिल हैं.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">0.2 cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652086</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1&#215;TE buffer, pH7.5</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">10mM dNTP mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">3500 Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4405673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 System SDS Software</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td>Version 1.3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Bio-Rad Gene Pulser Xcell system</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">CS11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-1</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-2</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Electroporation Enhancer</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">10270098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fluorometer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneMapper Software 5</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4475073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneScan 600 LIZ Size Standard</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4408399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PBS, 10X Solution, pH7.4</td>
			<td style="width:208px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:176px;">75889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11304029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1081058</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium without phenol red</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1a TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs04186042_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1b/c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs00231079_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs01021966_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1072533</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TRIzol Reagent</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Unlabeled PCR reverse primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells

मानव जीनोम के थोक ($98%) गैर-कोडिंग दृश्यों के शामिल है. Cis-नियामक तत्व (CREs) गैर-कोडिंग डीएनए अनुक्रम हैं जिसमें जीन अभिव्यक्ति को मॉड्युलेट करने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के लिए बाध्यकारी साइटें होती हैं. सीआरई के परिवर्तन कैंसर सहित विभिन्न रोगों में फंसाया गया है। जबकि प्रमोटरों और enhancers जीन विनियमन के अध्ययन के लिए प्राथमिक CREs किया गया है, बहुत कम साइलेंसर की भूमिका के बारे में जाना जाता है, जो CRE का एक और प्रकार है कि जीन दमन मध्यस्थता है. मूल रूप से प्रोकैरियोट में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के रूप में पहचान की, CRISPR/Cas9 यूकैरियोटिक जीनोम संपादन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होने के लिए शोषण किया गया है। यहाँ, हम मानव RUNX1 जीन में एक intronic साइलेंसर को नष्ट करने और OCI-AML3 ल्यूकेमिक कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति पर प्रभावों की जांच करने के लिए इस तकनीक का उपयोग प्रस्तुत करते हैं। हमारा दृष्टिकोण दो preassembled Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoप्रोटीन (RNP) परिसरों के इलेक्ट्रोपोरोनेशन-मध्यस्थ वितरण पर निर्भर करता है दो डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) कि साइलेंसर पार्श्व बनाने के लिए. हटाने आसानी से टुकड़ा विश्लेषण द्वारा जांच की जा सकती है. वैकल्पिक प्रवर्तकों से लिखित विभिन्न एमआरनए का अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रवर्तक-निर्भर प्रभावों का मूल्यांकन करने में सहायता करता है। इस रणनीति का उपयोग अन्य सीआरई का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है, जो अक्सर प्लाज्मिड-आधारित तरीकों के साथ ट्रांसफेक्ट करना मुश्किल होता है। एक प्लाज्मिड और वायरस मुक्त रणनीति का उपयोग जीन नियामक कार्यों के सरल और तेजी से आकलन की अनुमति देता है.

इस प्रयोग का उद्देश्य RUNX1 जीन में एक intronic साइलेंसर को नष्ट करने और OCI-AML3 कोशिकाओं में RUNX1 प्रतिलेखन पर प्रभावों की जांच है. साइलेंसर की पहचान एक संयोजी आण्विक दृष्टिकोण द्वारा की गई थी और इसमें 209 बीपी कोर तत्व18था . RUNX1 अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में इस कोर तत्व का अधिक सटीक मूल्यांकन सक्षम करने के लिए, crRNA (crRNA-1 और crRNA-2) इस क्षेत्र18 (चित्र 1) के लिए बारीकी से लक्ष्य करने के लिए डिजाइन किए गए थे। सीआरआरएनए-1 और CRRNA-2 द्वारा लाए गए अनुमानित Cas9 क्लीवेज साइटें क्रमशः कोर तत्व से 29 बीपी और 35 बीपी थीं (चित्र1)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जबकि दो CRRNAs के पीएएम साइटों विपरीत किस्में पर रहते हैं, डीएसबी PAM अनुक्रम स्थान से स्वतंत्र रूप से हो जाएगा. इस प्रकार, CRNA-1 और CRRNA-2 द्वारा निर्देशित दो Cas9/GRNA RNP परिसरों के सहवर्ती परिचय RUNX1 टिड्डी से साइलेंसर तत्व का उत्पादन करने की उम्मीद है।
नमूनों की एक बड़ी संख्या में वांछित विलोपन के लिए स्क्रीन करने के लिए, जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट के एक 96 अच्छी तरह से प्रारूप उच्च throughput शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया गया था. इसके अलावा, निष्कर्षण प्लेटों के कुओं पर बाध्य डीएनए प्रत्यक्ष प्रवर्धन के अधीन किया जा सकता है, इस प्रकार त्रुटियों या प्रदूषण को बार-बार नमूना हस्तांतरण के कारण कम से कम। विलोपन18 की स्क्रीनिंग के लिए प्रयुक्त प्राइमर चित्र 1में दिखाए गए हैं . जंगली प्रकार पीसीआर उत्पाद की उम्मीद आकार के बारे में है 500 बीपी. के बाद से इरादा विलोपन 273 बीपी तक फैला है, उत्परिवर्ती उत्पाद के बारे में 230 बीपी होने की उम्मीद है. इस आकार रेंज केशिका जेल electrophoresis द्वारा सरल और तेजी से टुकड़ा विश्लेषण सक्षम बनाता है. कुल 160 प्रारंभिक सेल पूल की जांच की गई और 14 को कम से कम 70% के उत्परिवर्ती स्तर के साथ अपेक्षित विलोपन ले जाने के लिए पाया गया। पांच पूल तो आगे धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए biallelic विलोपन असर क्लोन की पहचान करने के लिए चुना गया. उत्परिवर्ती उत्पादों के विभिन्न स्तरों के साथ सेल क्लोन से प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफेरोग्राम चित्र 2एमें दिखाए गए हैं। विलोपन की पहचान Sanger अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया गया था (चित्र 2बी) . जैसा कि उम्मीद थी, डीएसबी33 की मरम्मत में शामिल होने के गैर-समजात अंत द्वारा गठित indels हटाने क्लोन में अनुमानित दरार स्थलों पर मनाया गया. इसके परिणामस्वरूप अलग-अलग आकारों के उत्परिवर्ती उत्पादों का प्रवर्धन हुआ, जिसका पता केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा भी लगाया जा सकता है (चित्र 2क)।
RUNX1 जीन में दो प्रवर्तक होते हैं, नामत दूरस्थ च1 तथा समसमी च2, जो साइलेंसर तत्व34को आश्रय देने वाले एक बडे़ अंतर्न द्वारा पृथक होते हैं। तीन प्रमुख MRNA प्रतिलिपि इन प्रमोटरों द्वारा उत्पादित कर रहे हैं: RUNX1c द्वारा P1 और RUNX1a और RUNX1b द्वारा P234. RUNX1c और RUNX1b के न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम पूर्व को छोड़कर समान हैं एक अद्वितीय एन-टर्मिनस है, जिसमें से एक विशिष्ट TakMan जीन अभिव्यक्ति परख डिजाइन किया जा सकता है (चित्र 3ए) . RUNX1bको मापने के लिए , RUNX1b और RUNX1c दोनों को पहचानने वाला एक TakMan परख का उपयोग किया गया था (चित्र 3ए) . RUNX1b स्तर तो RUNX1cसे कुल RUNX1b/RUNX1c घटाकर निर्धारित किया गया. RUNX1a वैकल्पिक splicing के कारण एक स्पष्ट रूप से कम समरूप है और एक विशिष्ट TakMan परख इस संस्करण के लिए उपलब्ध है (चित्र 3ए). अतः च्1 तथा च्2 प्रवर्तकों की क्रियाकलाप का निर्धारण व्यक्तिगत रूप से किया जा सकता है। वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी-पीसीआर से पता चला है कि साइलेंसर तत्व को हटाने से पी 1- और पी 2 व्युत्पन्न प्रतिलिपिओं दोनों के अभिव्यक्ति स्तर ों को काफी ऊपर रखा गया है (चित्र 3ठ)।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig1.jpg"> चित्र 1 : रणनीति RUNX1 intronic साइलेंसर को नष्ट करने के लिए। साइलेंसर (लाल बॉक्स) RUNX1 जीन के पहले intron में स्थित है दो प्रमोटरों P1 और P2 को अलग (hg19 निर्देशांक दिखाए जाते हैं). दो CRRNAs (CRRNA-1 और CRRNA-2) को साइलेंसर तत्व के बगल में डीएसबी को पेश करने के लिए डिजाइन किया गया था। भविष्यवाणी Cas9 दरार साइटों ऊर्ध्वाधर लाल लाइनों द्वारा संकेत कर रहे हैं और पीएएम साइटों (NGG) बैंगनी में हैं. विलोपन की स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया दो प्राइमर खुले तीर द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig2.jpg"> चित्र 2 : विलोपन क्लोन की पहचान. (ए) उत्परिवर्ती पीसीआर उत्पादों (एमयूटी) के विभिन्न स्तरों को दर्शाने वाले सेल क्लोनों के प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफेरोग्राम। उत्परिवर्ती उत्पादों का आकार क्लोन के बीच बदलता है क्योंकि दरार साइटों पर गठित indels के. WT - जंगली प्रकार. (ख) संगर अनुक्रमण द्वारा प्रतिनिधि क्लोनों से विलोपन का सत्यापन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig3.jpg"> चित्र 3 : साइलेंसर विलोपन के कार्यात्मक परिणाम. (क) तीन प्रमुख RUNX1 समरूप (RUNX1a, RUNX1b और RUNX1c) दिखाए जाते हैं। इन विभिन्न रूपों में एक ही Runt डीएनए बाइंडिंग डोमेन लेकिन अलग N- (नारंगी) या सी-टर्मिनस (नीला) होते हैं। TakMan जांच / प्राइमर जोड़े के स्थान लाल लाइनों द्वारा संकेत दिया है. संख्याएं एमिनो अम्ल अवशेषों को इंगित करती हैं। (B) वास्तविक समय मात्रात्मक RT-PCR विश्लेषण RUNX1 P1- और P2 के साथ सेल आबादी में प्रतिलिपि (DEL) या बिना (WT) biallelic विलोपन18. GAPDH सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया था. * और * मान-व्हिटनी परीक्षण द्वारा क्रमशः पी एंड एलटी; 0.05 और पी एंड एलटी; 0.01 को इंगित करते हैं। यह आंकड़ा चेंग एट अल से संशोधित किया गया है18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

पूर्व-संयोजित Cas9/guide RNA ribonucleoप्रोटीन परिसरों की प्रत्यक्ष वितरण hematopoietic कोशिकाओं में जीनोम संपादन के लिए एक तेज और कुशल साधन है। यहाँ, हम इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए एक RUNX1 intronic साइलेंसर को नष्ट करने और OCI-AML3 ल्यूकेमिक कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाओं की जांच.

तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं में CRISPR/Cas9 Ribonucleoप्रोटीन द्वारा एक RUNX1 Intronic साइलेंसर की ट्रांसक्रिप्शनल भूमिका की जांच

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

सीआईआई-प्रमोटर और री बढ़ाने जैसे नियामक तत्व जीन अभिव्यक्ति के प्रमुख निर्धारक हैं। इन तत्वों का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण श्रमसाध्य हैं और अक्सर विषम रिपोर्टर जीन का उपयोग शामिल होते हैं। यहां हम ल्यूकेमिया सेल लाइन में एक RUNX1 intronic साइलेंसर की प्रतिलेखन भूमिका की जांच करने के लिए CRISPR के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं।प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए सरल है और अंतर्जात जीन संदर्भ में जीन नियामक कार्यों के तेजी से आकलन की अनुमति देता है । हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं को अक्सर प्लाज्मिड आधारित तरीकों से स्थानांतरित करना मुश्किल होता है। इस प्रोटोकॉल में, हम कोशिकाओं में पूर्वविस्थापित Cas9, गाइड आरएनए, परिसरों को वितरित करने के लिए इलेक्ट्रोपाउशन का उपयोग करते हैं।इस दृष्टिकोण के फायदों में बेहतर संपादन दक्षता और सेल व्यवहार्यता के साथ-साथ कम ऑफ-टारगेट प्रभावों का उपयोग शामिल है। इसके अलावा, टुकड़ा विश्लेषण के बाद का उपयोग नमूनों की एक बड़ी राशि से वांछित उत्परिवर्ती क्लोन की सरल और तेजी से स्क्रीनिंग सक्षम बनाता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन युक-लिन युंग, मेरी प्रयोगशाला के लिए तकनीशियन होगा।दो CRISPR RNAs, एक पांच प्रधानमंत्री और लक्ष्य सीआईएस-नियामक तत्व, या सीआरई के अन्य तीन प्रधानमंत्री डिजाइन करके शुरू करें । सुनिश्चित करें कि NGG का एक पाम Cas9 मान्यता के लिए लक्ष्य अनुक्रम के तुरंत डाउनस्ट्रीम स्थित है। जीआरएनए परिसर बनाने के लिए, 44 माइक्रोमोलर के अंतिम डुप्लेक्स एकाग्रता के लिए, पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार ते बफर में CRISPR आरएनए और ट्रेसर आरएनए को मिलाएं।मिश्रण को पांच मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और इसे कमरे के तापमान तक ठंडा होने दें। 36 माइक्रोमोलर की अंतिम नाभिक एकाग्रता के लिए पीबीएस के साथ रिकॉम्बिनेंट Cas9 नाभिक को पतला करें। फिर प्रत्येक जीआरएएनए डुप्लेक्स के साथ पतला नाभिक की बराबर मात्रा मिलाएं और उन्हें कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ताकि आरएनपी परिसर को बनाने की अनुमति मिल सके।सेंट्रलाइज 2.5 मिलियन कोशिकाओं को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पांच मिनट के लिए 500 गुना ग्राम पर। फिर सुपरनेट को त्यागें और बिना फिनॉल लाल रंग के आरपीएमआई 1640 माध्यम के 163 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। आरएनपी परिसर के 16.7 माइक्रोलीटर और 100 माइक्रोमोलर इलेक्ट्रोपेशन बढ़ाने वाले 3.6 माइक्रोलीटर कोशिकाओं में जोड़ें और मिश्रण को 0.2 सेंटीमीटर-गैप इलेक्ट्रोपॉजेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें, किसी भी बुलबुले को पेश न करने का ध्यान रखते हुए।कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेट करें और उन्हें टी-25 टिश्यू कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें 6 मिलीलीटर पूर्ण आरपीएमआई 1640 माध्यम होते हैं। कोशिकाओं को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इलेक्ट्रोपाउशन के एक दिन बाद, कोशिकाओं को पूर्ण आरपीएमआई 1640 माध्यम में प्रति मिलीलीटर 5000 कोशिकाओं को पतला करें।और एक ९६-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के १०० माइक्रोलीटर जोड़ें । सात से 14 दिनों के लिए कोशिकाओं संस्कृति तो एक उच्च थ्रूपुट शुद्धिकरण प्रणाली का उपयोग कर जीनोमिक डीएनए निकालने । 96-वेल एक्सट्रैक्ट्रैक्टिंग प्लेट के प्रत्येक कुएं में प्लेट बाइंडिंग और लाइसिस बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, इसके बाद पीबीएस के 10 माइक्रोलीटर में 50, 000 कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया है।ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से सामग्री मिलाएं। जीनोमिक डीएनए को कुओं से बांधने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर थाली को 30 मिनट तक इनक्यूबेट करें । फिर ध्यान से कुओं से समाधान को एस्पिरेट करें और उन्हें वॉश बफर के 120 माइक्रोलीटर से धोएं।हवा प्लेट सूखी। प्रत्येक कुएं में पीसीआर मिक्स के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें और पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार पीसीआर चलाएं। एक बार प्रवर्धन पूरा हो जाने के बाद, फ्लोरोमीटर के साथ नमूनों की चयनित संख्या की एकाग्रता को मापकर उत्पाद की मात्रा का अनुमान लगाएं।नाभिक मुक्त पानी के साथ माइक्रोलीटर प्रति 0.5 नैनोग्राम के लिए सभी नमूनों को पतला। पतला पीसीआर उत्पाद के एक माइक्रोलीटर को डियोनाइज्ड फॉर्मामाइड के 8.5 माइक्रोलीटर और जेनेटिक एनालाइजर के साथ 96-वेल प्लेट संगत में फ्लोरोसेंट डाई-लेबल आकार मानक के 0.5 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं। प्लेट को प्लेट सेप्टा से ढककर एक थर्मोसाइकिलर में तीन मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को विकृत करें।लेबल किए गए पीसीआर उत्पादों को अलग करने और विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर परिणामों का विश्लेषण करने के लिए केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस करें। आकार कॉलिंग की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए लेबल किए गए टुकड़ों और आकार मानक को देखने के लिए नारंगी आइकन की जांच करें। फिर, लेबल किए गए पीसीआर उत्पादों को देखने के लिए नीले आइकन की जांच करें।जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उत्पादों के अनुरूप चोटियों की पहचान करें और जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती चोटियों के तहत क्षेत्र के योग से उत्परिवर्ती चोटी के नीचे क्षेत्र को विभाजित करके प्रत्येक नमूने में उत्परिवर्ती स्तर का अनुमान लगाएं। आगे धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए अपेक्षित विलोपन के उच्च स्तर के साथ कई सेल पूल का चयन करें। डीएनए निष्कर्षण, फ्लोरोसेंट पीसीआर, और केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस चरणों को दोहराएं और बाद के विश्लेषण के लिए 95% से अधिक उत्परिवर्ती स्तरों के साथ क्लोन का चयन करें।चयनित क्लोन से कुल आरएनए निकालें और मानार्थ डीएनए संश्लेषण करते हैं। पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार पॉली-टी प्राइमर और डीएनटीपीएस के साथ आरएनए को मिलाएं और पांच मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । फिर, कम से कम एक मिनट के लिए बर्फ पर प्रतिक्रिया रखें।प्रतिक्रिया में सीडीएनए संश्लेषण मिश्रण के दस माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर एक थर्मोसाइकिलर में पांच मिनट के लिए 50 मिनट और 85 डिग्री सेल्सियस के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट। सीडीएनए संश्लेषण के बाद, नमूनों का इलाज RNase H के एक माइक्रोलीटर के साथ करें और उन्हें 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।डिजाइन प्राइमर और TaqMan वैकल्पिक प्रमोटरों से उत्पन्न व्यक्तिगत प्रतिलिपि विचरण के लिए विशेष रूप से जांच और प्लाज्मिड डीएनए में विशिष्ट प्रतिलिपि दृश्यों युक्त डीएनए टुकड़े क्लोन । ट्रांसक्रिप्ट क्वांटिफिकेशन के लिए मानक घटता के रूप में पुनर्संयोजन प्लाज्मिड की दस गुना कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला बनाएं। प्रत्येक नमूने के लिए पीसीआर मिक्स के 20 माइक्रोलीटर तैयार करें और पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार वास्तविक समय पीसीआर चलाएं।परिणामों का विश्लेषण करें और हाउसकीपिंग जीन के साथ प्रत्येक नमूने में लक्ष्य प्रतिलिपियों की प्रतिलिपि संख्या को सामान्य करें। इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग RUNX1 intronic साइलेंसर को हटाने के लिए किया गया है और हटाने की पुष्टि केशिका जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के साथ की गई थी। जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती पीसीआर उत्पादों के अपेक्षित आकार क्रमशः लगभग 500 आधार जोड़े और 230 आधार जोड़े हैं।उत्परिवर्ती उत्पादों का आकार दरार साइटों पर बनने वाले इनडेल के कारण क्लोन के बीच भिन्न हो सकता है। विलोपन की पहचान की पुष्टि करने के लिए सेंगर अनुक्रमण का उपयोग किया गया था। RUNX1 जीन में दो प्रमोटर, पी 1 और पी 2 शामिल हैं, जिन्होंने तीन प्रमुख एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट का उत्पादन किया: P1 द्वारा RUNX1c, और P2 द्वारा RUNX1a और RUNX1b । वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि साइलेंसर तत्व का विलोपन इन प्रतिलिपियों की अभिव्यक्ति को कैसे प्रभावित करता है।प्रयोग के आकलन के लिए CRISPR RNAs का एक अच्छा डिजाइन महत्वपूर्ण है। सुनिश्चित करें कि सीआरएसआईपीआर आरएनए को इच्छित विलोपन क्षेत्र के साथ बारीकी से पैक किया जाए। इसके अलावा, एक पाम अनुक्रम से सुनिश्चित करें Cas9 मांयता के लिए लक्ष्य अनुक्रम के नीचे स्थित है ।सीआरई का अध्ययन करने के अलावा, इस रणनीति का उपयोग जीन स्थान अध्ययन के लिए किया जा सकता है और जीन कार्यों की जांच करने के लिए आरएनए हस्तक्षेप के विकल्प के रूप में कार्य करता है। गुणसूत्र संरचना कैप्चर तकनीकों के संयोजन से CRISPR निश्चित रूप से परिवर्तित जीनोम संगठन और जीन अभिव्यक्ति में सीआरई की भागीदारी को कैंसर जैसी विभिन्न स्वास्थ्य समस्याओं से जुड़े समझने में मदद करेगा।

Research

JoVE Journal

Genetics

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता वाली जीन नॉकआउट्स के चयन-आश्रित और स्वतंत्र जनरेशन

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

एक मानक पद्धति पर जांच करने के लिए साइट Mutagenicity के एक समारोह के रूप में बिंदु उत्परिवर्तन मरंमत Catalyzed द्वारा CRISPR/Cas9 और SsODN मानव कोशिकाओं में

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-मध्यस्थता एक समरूपता-मध्यस्थ अंत में शामिल होने की रणनीति का उपयोग कर Vivo में लक्षित एकीकरण

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

CRISPR/Cas9 के लिए Integrase-कमी Lentiviral वैक्टर के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल-विभाजन कोशिकाओं में मध्यस्थता जीन नॉकआउट

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

मॉडल प्रणाली ढाणियो rerio में कुशल उत्पादन और CRISPR/Cas9 जनित जीन नॉकआउट की पहचान

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Murine और मानव टेम जनक कोशिकाओं के अत्यधिक कुशल जीन व्यवधान CRISPR द्वारा Cas9/

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

C. एलिगेंस में जीनोमिक पॉइंट म्यूटेंट पैदा करने के लिए एक रैपिड और सतही पाइपलाइन का उपयोग CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

अंतर्जात प्रोटीन टैगिंग में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoप्रोटीन-मध्यस्थ सटीक जीन संपादन द्वारा ट्यूब इलेक्ट्रोपोरेशन

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

एक जीन नॉकआउट का परिचय सीधे Trypanosoma cruzi के Amastigote चरण में CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...