Name: investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells
Uploaded: 2019-09-01T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Prof. MD Minden (prinsesse Margaret Cancer Centre, University Health Network, Toronto, Canada) for å gi OCI-AML3 cellelinje. Også forfatterne vil gjerne takke Core Utilities av Cancer Genomics og Pathobiology (The Chinese University of Hong Kong) for å gi fasiliteter og bistand til støtte for denne forskningen.

1. design av crRNA
<ol><li>Design to crRNAs, en 5 ' og de andre 3 ' av målet grobunn ved hjelp av en Web-basert CRISPR design verktøyet28,29,30,31. Kontroller at en PAM av NGG ligger rett nedstrøms for mål sekvensen for Cas9-gjenkjenning. Utformingen av de to crRNAs (crRNA-1 og crRNA-2) for sletting av RUNX1 lyddemper18 er vist i figur 1. Merk: En crRNA inneholder vanligvis en 20-mer protospacer som er komplementær til mål sekvensen.</li>
	<li>Sjekk tilstedeværelsen av enkle nukleotid polymorfismer (SNPs)/indels i målet og tilstøtende PAM sekvenser ved å skrive inn genomisk plasseringene av sekvensene i søkeboksen av en online Genova nettleser (f. eks, NCBI 1000 genomer eller UCSC Genova Browser). Merk: Vanlige SNPs/indeler har en mindre allel frekvens på minst 1% i befolkningen generelt.</li>
	<li>Send inn de valgte crRNA-sekvensene for syntese med en kommersiell leverandør. Også kjøpe tracrRNA for gRNA duplex formasjon.</li>
</ol>2. design av sletting screening primere
<ol><li>Design et par primere som flanken den tiltenkte sletting regionen. Sørg for at primere er minst 50 BP fra Cas9 kløft steder slik at PCR forsterkning er minimalt påvirket av indeler dannet på kløften steder.</li>
	<li>Sørg for at amplicon er mindre enn 1 200 BP (fortrinnsvis mindre enn 600 BP for bedre størrelses oppløsning). Også merke en av primere med et fluorescerende fargestoff (f. eks 6-carboxyfluorescein (6-FAM)) på 5 '-end for påvisning. Den primere som brukes for screening av RUNX1 lyddemper sletting18 er vist i figur 1.</li>
</ol>3. utarbeidelse av Cas9/gRNA RNP komplekser
<ol><li>Resuspend crRNAs og tracrRNA i 1x TE-buffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) til en endelig konsentrasjon på 200 μM.</li>
	<li>For hver crRNA, bland 2,2 μL av 200 μM crRNA, 2,2 μL av 200 μM tracrRNA og 5,6 μL av 1x TE buffer (totalt 10 μL) i et 0,2 mL rør for å oppnå en endelig dupleks konsentrasjon på 44 μM.</li>
	<li>Ruge ved 95 ° c for 5 min i en thermocycler. La rørene avkjøles til romtemperatur for gRNA kompleks dannelse.</li>
	<li>Fortynne 10,4 μL av 62 μM rekombinant Cas9-nuklease med 7,6 μL av 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) for å oppnå en endelig nuklease konsentrasjon på 36 μM. Merk: Dette beløpet er tilstrekkelig for utarbeidelse av to Cas9/gRNA komplekser.</li>
	<li>Bland like volumer (8,5 μL) av den fortynnede nuklease med hver av gRNA-duplexes Hentet fra trinn 3,3.</li>
	<li>Ruge ved romtemperatur i 20 min for å tillate RNP kompleks formasjon. Hold blandinger på isen til electroporation.</li>
</ol>4. electroporation av RNP komplekser i OCI-AML3 celler
<ol><li>Kultur OCI-AML3 celler i RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-deaktivert fosterets storfe serum (FBS), 1x GlutaMAX, 100 enheter/mL av penicillin og 100 μg/mL av Streptomycin (heretter referert til som komplett RPMI 1640 medium) ved 37 ° c med 5% CO2.</li>
	<li>Telle celler ved hjelp trypan blå farging. Sørg for at celle levedyktigheten på tidspunktet for electroporation er over 90%.</li>
	<li>Sentrifuger 2,5 x 106 celler i et 1,5 ml rør ved 500 x g i 5 min ved romtemperatur. Fjern supernatanten og vask cellene med 1 mL 1x PBS. Snurr ned cellene igjen og Fjern alle rester av supernatanten.</li>
	<li>Resuspend cellene i 163 μL av RPMI 1640 medium uten fenol rød.  Tilsett 16,7 μL av hvert RNP-kompleks (fra trinn 3,6) og 3,6 μL av 100 μM electroporation Enhancer til cellene (totalt volum = 200 μL). Bland forsiktig ved pipettering. Merk: Electroporation Enhancer er et bære-DNA for å forbedre redigerings effektiviteten.</li>
	<li>Overfør blandingen til en 0,2 cm-gap electroporation Cuvette uten bobler. Utfør electroporation med et electroporation system (modus: eksponentiell; Spenning =: 150 V; Kapasitans = 700 μF; Motstand = 50 Ω).</li>
	<li>Overfør cellene til en T-25 vevs kultur kolbe som inneholder 6 mL komplett RPMI 1640 medium og ruge ved 37 ° c med 5% CO2.</li>
</ol>5. screening og valg av Cell kloner med Biallelic slettinger
<ol><li>Fortynne cellene til 5 x 103/ml i komplett RPMI 1640 medium en dag etter electroporation. Tilsett 100 μL av den fortynnede celle fjæringen i hver brønn av 96-brønn vevs kultur plater og la cellene vokse i 7-14 dager.</li>
	<li>Pakk genomisk DNA fra cellene ved hjelp av en høy-gjennomstrømming rensing system.</li>
	<li>Tilsett 100 μL av plate binding og lyseringsbuffer til hver brønn på en 96-brønn avsugs plate. Tilsett 5 x 104 celler resuspendert i 10 μL av 1x PBS til buffer og bland dem ved pipettering.</li>
	<li>Ruge i romtemperatur i 30 minutter for å tillate binding av genomisk DNA til brønnene.</li>
	<li>Aspirer løsningen fra brønnene uten å skrape brønnen overflater. Vask brønnene med 120 μL av vaskebuffer.</li>
	<li>Luft tørker brønnene som inneholder det bundne DNA.</li>
	<li>Forbered 20 μL av PCR-blanding (2 μL av 10x høy Fidelity-buffer, 0,8 μL av 50 mM MgSO4, 0,4 μL av 10 mm dNTPs, 0,4 μL av 10 μM fam-merket Forward primer (trinn 2,2), 0,4 μL av 10 μm umerkede omvendt primer og 0,4 U av Taq DNA polymerase for hver prøve). Merk: Forbered en Master mix for å sikre at det legges til standardiserte mengder reagenser i hvert utvalg.</li>
	<li>Tilsett PCR-blandingen i hver brønn av avsugs platen og Kjør reaksjonene i en thermocycler (betingelser: Initial 94 ° c i 2 min, etterfulgt av 35 sykluser på 94 ° c i 15 s, 56 ° c for 30 s og 68 ° c i 1 min).</li>
	<li>Anslå mengden av produktene ved å måle konsentrasjonen i et valgt antall prøver ved hjelp av en fluorometer. Fortynne alle prøvene med nuklease-fri H2O til 0,5 ng/μL.</li>
	<li>Bland 1 μL av de fortynnede PCR-produktene med 8,5 μL av deionisert formamid og 0,5 μL av fluorescerende fargestoff merket størrelses standard i en 96-brønn plate som er kompatibel med den genetiske analysator. Merk: Forbered en Master Mix som inneholder deionisert formamid og størrelses standarden.</li>
	<li>Dekkplaten med en plate septa og denaturere prøvene ved 95 ° c i 3 minutter i en thermocycler. Ikke Lukk dekslet på maskinen.</li>
	<li>Utfør kapillær gel elektroforese for å skille de merkede PCR-produktene som tidligere beskrevet32.</li>
	<li>Etter elektroforese, åpne analyseprogramvaren for å analysere resultatene.</li>
	<li>Klikk nytt prosjekt , og velg mikrosatellittmarkør. Deretter klikker du OK.</li>
	<li>Klikk Legg til eksempler i Project , og velg resultat filene (inneholder FSA-filtypen). Klikk deretter Legg til i listen for å importere filene.</li>
	<li>I tabellen som viser de valgte resultat filene, velger du mikrosatellittmarkør standard i kolonnen analysemetode . Du kan også velge størrelse standarden som brukes i kolonnen størrelse standard . Klikk deretter på analyser -ikonet, Skriv inn eksperiment navnet og lagre eksperimentet.</li>
	<li>Klikk Vis plott for å vise resultatene og velge fragment analyse i plott-innstillingen.</li>
	<li>Velg de aktuelle fargede kanalene for analyse. Kontroller det oransje ikonet for å vise de merkede fragmentene i størrelses standarden for å vurdere kvaliteten på anrops størrelsen.</li>
	<li>Kontroller det blå ikonet for å vise de merkede PCR-produktene. Identifiser toppene som samsvarer med vill-type og mutant (dvs. bærer forventet slettinger) produkter. Beregn det muterte nivået i hver prøve ved å dele området under mutant toppen med summen av arealet under vill-type og mutant topper.</li>
	<li>Velg flere celleutvalg med høye nivåer av forventede slettinger for videre serielle fortynninger.</li>
	<li>Gjenta DNA-ekstraksjon, fluorescerende PCR og kapillær elektroforese trinn. Velg celle kloner med mutant nivåer > 95% som representerer biallelic slettinger for senere analyser.</li>
	<li>Kontroller identiteten til slettinger i de valgte kloner av sanger sekvensering.</li>
</ol>6. funksjonell analyser av lyddemper sletting av sann tids kvantitativ RT-PCR-analyse
<ol><li>Pakk total RNA fra utvalgte kloner og utfør komplementær DNA (cDNA)-syntese.</li>
	<li>Bland 1 mikrogram RNA med 1 μL 50 μM oligo (dT)20 primer og 1 ΜL 10 mm dNTP mix i et samlet volum på 10 ΜL. ruge ved 65 ° c i 5 min og plasser på isen i minst 1 min.</li>
	<li>Tilsett 10 μL av cDNA-syntese som inneholder 2 μL av 10x RT buffer, 4 μL av 25 mM MgCl2, 2 μl av 0,1 M DTT, 1 μL av RNase-hemmere (40 u/μL) og 1 μL av revers transkriptase (200 u/μL). Ruge ved 50 ° c for 50 min og deretter 85 ° c i 5 min i en thermocycler. Merk: Forbered en Master mix for omvendt transkripsjon.</li>
	<li>Chill prøvene på isen. Tilsett 1 μL av RNase H og ruge ved 37 ° c i 20 min. Oppbevar cDNA ved-20 ° c.</li>
	<li>Design primere og TaqMan sonder som spesifikt anerkjenner individuelle transkripsjon varianter generert fra alternative arrangører. Merk: Pre-designede transkripsjon-spesifikke primer/sonde sett er kommersielt tilgjengelig.</li>
	<li>Klon DNA-fragmenter som inneholder de spesifikke transkripsjon sekvenser til plasmider DNA. Forbered en 10-fold fortynning serien (106 til 10 eksemplarer) av rekombinant plasmider som standard kurver for transkripsjon kvantifisering.</li>
	<li>Forbered 20 μL av PCR-mix (0,5 μL av DNA-mal, 1 μL av 20x pre-designet TaqMan sonde/primer-analyse og 10 μL av 2x TaqMan PCR Master Mix) for hver prøve (både cDNA og plasmider standarder). Mål hver prøve i tre eksemplarer. Merk: Forbered en Master mix for sann tids PCR.</li>
	<li>Kjør reaksjonene i en PCR-maskin i sanntid (betingelser: innledende 50 ° c i 2 min og 95 ° c i 10 min, etterfulgt av 40 sykluser med 94 ° c i 15 s og 60 ° c i 1 min).</li>
	<li>Etter forsterkningen klikker du på analyser -ikonet i programvaren for å analysere dataene. Sjekk skråningen og korrelasjonskoeffisienten til standard kurvene for å evaluere effektiviteten og linearitet av reaksjonene. Kontroller at bakkene er mellom-3,1 og-3,6 og korrelasjonskoeffisienter er større enn 0,99.</li>
	<li>Normalisere kopi nummeret til mål transkripsjoner i hver prøve med et rengjørings gen (f.eks. GAPDH).</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Den CRISPR/Cas9 systemet har vært brukt i en rekke Genova redigering programmer som Gen knockout og knock-in studier35,36, transcriptional regulering37,38, genetisk engineering av ulike modell organismer39,40,41,42,43,44 og genterapi45,46. Her demonstrerer vi bruken av CRISPR/Cas9 for å undersøke de funksjonelle konsekvensene av å slette en intronic lyddemper på RUNX1 -genet. Leveransen av CRISPR komponenter i tilnærmingen vår var ikke avhengig av plasmider DNA, kloning av gRNA eller virus, men electroporation av forhåndsmonterte Cas9/gRNA RNP komplekser. Det har vist seg at bruk av eksogene DNA kan knyttes til uønsket integrering av utenlandske vektor sekvenser inn i verten Genova, økt toksisitet og lav effektivitet25,47,48, mens virus Transduction metoder er tidkrevende. I tillegg kan langvarig uttrykk for Cas9 fra plasmider DNA forsterke off-Target effekter48. Tvert imot, det direkte RNP-basert leveranse adgang er blitt etablerte idet det foretrakk metoden for den er rask og direkte med forbedret redigere bort effektiv, selektivitet og cellen levedyktighet. Faktisk, en rekke metoder som lipofection49,50, electroporation25,51, nanopartikler52, celle-gjennomtrengende peptider53, iTOP54 og TRIAMF 55 har blitt utviklet for effektiv CRISPR/Cas9 levering til ulike celletyper, samt dyre-og plantearter24,25,26,56,57 , 58 for alle , 59 for alle , 60 for alle , 61 for alle , 62 for alle , 63. siden ikke-koding DNA-sekvenser er hotspots av genetiske variasjoner64, sjekke tilstedeværelsen av vanlige SNPs/indeler i målet og nabolandet Pam sekvenser er spesielt relevant når du utformer gRNA som mål regulatoriske Elementer.
En flaskehals i CRISPR/Cas9 Genova redigering innebærer screening av ønsket mutant kloner i et stort antall prøver. Vi brukte fluorescerende PCR kombinert med kapillær gel elektroforese for screening som mål mutasjon er en liten genomisk sletting av ca 300 BP. Denne metoden er rask og følsom og kan utføres i en høy-gjennomstrømming mote. Denne metoden gir også nøyaktig estimering av mutant nivåer og slette størrelser samtidig. I tillegg støttes multiplex analyse av PCR-fragmenter merket med ulike fluorescerende fargestoffer. Vi har vært rutinemessig bruker denne teknikken til genotype små innsettinger/slettinger i myelogen svulster65,66. I vår erfaring, kan vi konsekvent oppdage fragment størrelser som er forskjellig fra 4 BP med høy presisjon og mutant byrde ned til ~ 3%. Imidlertid bør det bemerkes at denne metoden har et fragment størrelsesgrensen på 1 200 BP, og dermed er det ikke egnet for screening av store slettinger. Også basis erstatninger (som resulterer i uendret fragment størrelse) og potensielle hendelser utenfor mål i andre genomisk områder, kan ikke oppdages. For det latter, det kostbar hele Genova sekvensering er krevde å allsidig profil fleste uønsket endre inne målet klon. Å vedta vår nåværende tilnærming for etterforskning av store ikke-koding regulatoriske sekvenser (> 1000 BP), en detaljert sletting og mutagenese analyser av antatte transkripsjon faktor bindende nettsteder bruker in vitro reporter genanalyser kan utføres på forhånd for å avgrense den minimale funksjonelle regionen for CRISPR/Cas9 redigering18.
Som mange gener inneholder mer enn én arrangører3,4, er det viktig å være klar over eksistensen av alternative arrangører i målet genet geometriske som manipulerer regulatoriske elementer kan påvirke arrangørene differensielt. Dermed, transkripsjon varianter avledet fra ulike arrangører må måles individuelt for å evaluere eventuelle promoter-spesifikke tiltak. Bruk av TaqMan-sonde er foretrukket over SYBR Green på grunn av bedre spesifisitet og reproduserbarhet. Hvis den mer avanserte digitale PCR-systemet er tilgjengelig, transkripsjon kvantifisering kan utføres mer presist uten behov for standard kurve konstruksjon.
En viktig faktor i å utføre CRISPR/Cas9 eksperimenter i kreftcelle linjer er ploidy og målet genet kopi nummer i cellene brukes som nesten alle kreftcelle linjer havn genetiske endringer inkludert strukturelle og kopiere antall variasjoner. I vårt tilfelle har OCI-AML3 en hyperdiploid Karyotype med 45 til 50 kromosomer. I tillegg ble cellelinjen funnet å bære en normal RUNX1 kopi nummer som avslørt fra kreft Cell line Encyclopedia67 og fluorescens in situ hybridisering studier18. Når du målretter et gen med kopi nummer forsterkning, kan det hende leveringsmetoden må optimaliseres for å gi tilstrekkelige nivåer av CRISPR-komponentene for redigeringen. Dessuten kan flere kloner må bli vist for å identifisere den komplette Knockouts. Viktigere er det vist at målretting på forsterket genomisk regioner, spesielt de som skyldes strukturelle rearrangements, kan utløse gen-uavhengige antiproliferative responser i kreftceller, noe som fører til falske positive resultater i genet funksjonelle studier68,69,70. I denne forbindelse bør alternative tilnærminger som RNA-interferens (RNAi) knockdown og/eller cDNA-overuttrykte benyttes for å verifisere CRISPR-funnene. I tillegg bør flere cellelinjer brukes for å unngå feil tolkning av cellelinje spesifikke, men gen-uavhengige CRISPR redigerings effekter.
Den CRISPR/Cas9 systemet har revolusjonert grunnleggende og translational forskning ved å tilby en enkel og effektiv måte å Genova redigering. Her viser vi hvor enkelt det er å bruke CRISPR/Cas9 for å forstyrre en intronic lyddemper for transcriptional studier i en kreftcelle linje. Denne teknikken gjør det mulig for studiet av CREs på DNA-nivå og gir muligheter til å undersøke GROBUNN funksjoner i endogene sammenheng i stedet for den tradisjonelle heterologous reporter gener. Nylig har et CRISPR-basert RNA redigeringssystem også blitt identifisert71 og kan tjene som et nytt verktøy for å studere CREs ved å målrette RNA-er fra regulatoriske elementer. Ved å kombinere med kromosom konformasjon fangst teknikker, CRISPR/Cas9 vil sikkert hjelpe dechiffrere den engasjement av CREs i endrede Genova organisasjon og genuttrykk knyttet til ulike helseproblemer.

CIS-regulatoriske elementer (CREs) er ikke-koding DNA-sekvenser som inneholder bindende områder for transcriptional regulatorer for å kontrollere genuttrykk1,2. Disse elementene er vanligvis 100 til 1 000 base parene (BP) lang. Arrangører og enhancers er de to mest preget typer CREs. Arrangører er til stede i umiddelbar nærhet til transkripsjon starte nettsteder og utgjør den grunnleggende enhet av transkripsjon. Mange gener har mer enn én promoter og deres alternative bruk bidrar til transcriptome mangfold og vev spesifisitet3,4. På den annen side, enhancers aktivere transkripsjon og kan være plassert oppstrøms, nedstrøms eller innenfor introns av målet gener. Enhancers kan handle fra langt avstand (over en megabase) og uavhengig av orientering1,2. CREs har også lyddempere og isolatorer5,6. Den tidligere handlinger oppositely til enhancers å hemme genuttrykk ved binding til transcriptional repressors, mens sistnevnte partisjonene i Genova i diskret topologisk domener å isolere gener fra andre CREs fra nabokommunene domener. Disse elementene handler i samspill med hverandre gjennom kort-og/eller langtrekkende kromatin interaksjoner og er organisert i regulatoriske huber til direkte riktig spatiotemporal genuttrykk. Nylige fremskritt i høy gjennomstrømming sekvensering teknikker har akselerert identifisering og funksjonell merknad av mange CREs som har i stor grad tilrettelagt vår forståelse av transcriptional nettverk som dikterer avstamning-spesifikke genet uttrykk i forskjellige celle-og vevstyper7,8,9, 10,11,12.
Gitt de grunnleggende rollene til CREs i regulering transkripsjon, kan deres endringer føre til avvikende genuttrykk. Det har vist seg at CREs er ofte forstyrret av genetiske og epigenetic endringer i ulike typer av menneskelig kreft, og dermed bidra til tumor innvielse, progresjon og aggressivitet13,14. I tillegg, GROBUNN-bindende faktorer er ofte mutert og/eller misexpressed i ulike krefttyper, ytterligere fremhever betydningen av GROBUNN dereguleringen i oncogenesis15. CREs kan også påvirkes av strukturelle avvik, som illustrert av hyppige kromosom rearrangements av immunglobulin tunge (IgH) gen Enhancer som resulterer i unormal aktivering av nabo oncogenes i B-celle lymfomer16. Ved akutt myelogen leukemi (AML), omplassering av en enkelt Enhancer av kromosom 3Q rearrangements forårsaker samtidig GATA2 Downregulation og EVI1 aktivering, som kan potensielt være målrettet av spill hemming av Enhancer funksjoner 17. nylig har vi karakterisert en roman kromosom translokasjon som involverer forstyrrelsene av en RUNX1 intronic lyddemper som kan bidra til AML progresjon i en pediatrisk pasient18. Således, tyde den ikke-koding kreft Genova gir fruktbare veier for Elucidating sykdom patogenesen, biomarkør oppdagelse og terapeutiske intervensjoner, som til slutt forbedre pasientens utfall.
CRISPR/Cas9 nuklease Pathway, opprinnelig identifisert som et adaptive immunsystem i prokaryote celler, har blitt utnyttet som en rask og kostnadseffektiv måte for områdespesifikk genomisk redigering i levende celler og organismer19,20 ,21,22. CRISPR/Cas9-systemet omfatter to hovedkomponenter: gRNA og Streptococcus pyogenesCas9 nuklease. GRNA inneholder en bestemt sekvens kalt protospacer som gjenkjenner målområdet og dirigerer Cas9 for redigering. GRNA består av to deler: CRISPR RNA (crRNA), vanligvis en 20-mer nukleotid sekvens komplementær til mål-DNA, og en trans-aktivere crRNA (tracrRNA), som fungerer som et bindende stillas for nuklease. En protospacer tilstøtende motiv (PAM) (5 '-NGG) umiddelbart ved siden av målet området er nødvendig for Cas9 kløft og kløften området ligger 3 nukleotider oppstrøms av PAM. CRISPR/Cas9-mediert genredigering er vanligvis utføres av transfecting celler med en plasmider det koder Cas9 og det klon gRNA23. Imidlertid er denne tilnærmingen utfordrende for blodkreft celler, som ofte er vanskelig å transfect og krever langvarige virus-baserte Transduction metoder. En alternativ tilnærming er direkte cellulær levering av forhåndsmonterte Cas9/gRNA RNP komplekser24. En vanlig metode for RNP levering er electroporation, som genererer midlertidige porer i cellemembranen, og dermed tillater oppføring av RNP komplekser i cellene25,26. Fordelene med denne tilnærmingen inkluderer brukervennlighet, redusert off-Target effekter og stabilitet av RNP komplekser. Her beskriver vi en protokoll for å bruke RNP Leveringsmetode for å undersøke transcriptional rollen til en RUNX1 intronic lyddemper i OCI-AML3 leukemi cellelinje18, som ble etablert fra PERIFERT blod av en AML pasient diagnostisert med den fransk-amerikanske-britiske M4 under type27. Protokollen inkluderer design av crRNA, utarbeidelse av RNP komplekser, electroporation samt screening og påfølgende karakterisering av de ønskede kloner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">0.2 cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652086</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1&#215;TE buffer, pH7.5</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">10mM dNTP mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">3500 Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4405673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 System SDS Software</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td>Version 1.3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Bio-Rad Gene Pulser Xcell system</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">CS11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-1</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-2</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Electroporation Enhancer</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">10270098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fluorometer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneMapper Software 5</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4475073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneScan 600 LIZ Size Standard</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4408399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PBS, 10X Solution, pH7.4</td>
			<td style="width:208px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:176px;">75889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11304029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1081058</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium without phenol red</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1a TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs04186042_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1b/c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs00231079_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs01021966_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1072533</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TRIzol Reagent</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Unlabeled PCR reverse primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells

Hovedtyngden av den menneskelige Genova (~ 98%) består av ikke-koding sekvenser. CIS-regulatoriske elementer (CREs) er ikke-koding DNA-sekvenser som inneholder bindende områder for transcriptional regulatorer å modulere genuttrykk. Endringer av CREs har vært innblandet i ulike sykdommer, inkludert kreft. Mens arrangører og enhancers har vært den primære CREs for å studere gen regulering, svært lite er kjent om rollen til lyddemper, som er en annen type GROBUNN som formidler gen undertrykkelse. Opprinnelig identifisert som en adaptiv immunitet system i prokaryoter, CRISPR/Cas9 har blitt utnyttet til å være et kraftig verktøy for eukaryote Genova redigering. Her presenterer vi bruken av denne teknikken for å slette en intronic lyddemper i menneskets RUNX1 gen og undersøke virkningene på genuttrykk i OCI-AML3 Leukemic celler. Vår tilnærming er avhengig av electroporation-mediert levering av to forhåndsmonterte Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) komplekser for å lage to doble strand pauser (DSBs) som flanke lyddemper. Slettinger kan lett bli vist ved fragment analyse. Uttrykks analyser av ulike mRNAs som skrives ut fra alternative arrangører, bidrar til å evaluere arrangørens avhengige effekter. Denne strategien kan brukes til å studere andre CREs og er spesielt egnet for blodkreft celler, som ofte er vanskelig å transfect med plasmider-baserte metoder. Bruken av en plasmider-og virus fri strategi gir enkle og raske vurderinger av gen regulatoriske funksjoner.

Målet med dette eksperimentet er å slette en intronic lyddemper i RUNX1 genet og undersøke virkningene på RUNX1 TRANSKRIPSJON i OCI-AML3 celler. Lyddemperen ble identifisert av en Kombinatorisk molekylær tilnærming og funnet å inneholde en 209 BP kjerneelement18. For å muliggjøre mer nøyaktig evaluering av dette kjerneelementet i kontroll av RUNX1 uttrykk, ble CrRNAs (crRNA-1 og crRNA-2) utformet for å målrette tett mot denne regionen18 (figur 1). Den spådde Cas9 kløft områder brakt av crRNA-1 og crRNA-2 var 29 BP og 35 BP fra kjernen element, henholdsvis (figur 1). Det bør bemerkes at mens PAM områder av de to crRNAs bor på motsatte tråder, vil DSBs skje uavhengig av PAM sekvens plassering. Dermed er samtidig innføring av to Cas9/gRNA RNP komplekser guidet av crRNA-1 og crRNA-2 forventes å avgiftsdirektoratet lyddemper element fra RUNX1 geometrisk.
Til skjermen for ønsket sletting i et stort antall prøver, en 96-brønn format av genomisk DNA-ekstraksjon Kit ble brukt for høy gjennomstrømming rensing. Også, DNA bundet på brønnene av utvinnings platene kan utsettes for direkte forsterkning, og dermed minimere feil eller forurensning på grunn av gjentatte sample overføring. Den primere som brukes for screening av slettinger18 er vist i figur 1. Forventet størrelse av det ville-type PCR produktet er ca 500 BP. Siden den tiltenkte slettingen spenner 273 BP, er det muterte produktet forventes å være ca 230 BP. Dette størrelsesområdet muliggjør enkel og rask fragment analyse av kapillær gel-elektroforese. Totalt 160 første celle bassenger ble vist og 14 ble funnet å bære den forventede slettinger med mutant nivåer på minst 70%. Fem bassenger ble deretter valgt for ytterligere serie fortynninger å identifisere kloner bærende biallelic slettinger. Representative electropherograms fra celle kloner med ulike nivåer av muterte produkter er vist i figur 2A. Identiteten til slettinger ble verifisert av sanger sekvensering (figur 2B). Som forventet, indeler dannet av ikke-homologe ende bli reparasjon av DSBs33 ble observert ved spådde kløft steder i slettingen kloner. Disse resulterte i forsterkning av muterte produkter av varierende størrelse, som også kan oppdages av kapillær elektroforese (figur 2A).
RUNX1 -genet inneholder to arrangører, nemlig den som er den som er den proksimale P2, som er adskilt av en stor Intronets opprinnelse harboring lyddemper elementet34. Tre store mRNA transkripsjoner er produsert av disse arrangørene: RUNX1c av P1 og RUNX1a og RUNX1b av P234. Den nukleotid sekvensen av RUNX1c og RUNX1b er identiske bortsett fra det tidligere har en unik N-Terminus, som en bestemt TaqMan genuttrykket analysen kan utformes (Figur 3a). For å måle RUNX1b, en TaqMan analysen erkjenner både RUNX1b og RUNX1c ble brukt (Figur 3a). RUNX1b nivåer ble deretter bestemt ved å trekke totalt RUNX1b/RUNX1c fra RUNX1c. RUNX1a er en utpreget kortere isoformen på grunn av alternative skjøting og en bestemt TaqMan analysen er tilgjengelig for denne varianten (Figur 3a). Dermed aktiviteten av P1 og P2 arrangører kan bestemmes individuelt. Sann tids kvantitativ RT-PCR viste at sletting av lyddemper elementet betydelig upregulated uttrykks nivåene for både P1-og P2-avledede transkripsjoner (Figur 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig1.jpg"> Figur 1 : Strategi for å slette RUNX1 intronic lyddemper. Lyddemperen (rød eske) ligger i første Intronets opprinnelse av RUNX1 -genet som skiller de to arrangørene P1 og P2 (hg19-koordinatene vises). To crRNAs (crRNA-1 og crRNA-2) ble utformet for å innføre DSBs flankerer lyddemper elementet. Den spådde Cas9 kløft steder er indikert av vertikale røde linjer og PAM nettsteder (NGG) er i lilla. De to primere som brukes for screening av slettinger er representert med åpne piler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig2.jpg"> Figur 2 : Identifikasjon av slettingen kloner. (A) representative electropherograms av celle kloner som viser ulike nivåer av muterte PCR-produkter (MUT). Størrelsen på de muterte produkter varierer blant de kloner på grunn av indeler dannet på kløften steder. WT = vill-type. (B) verifisering av slettinger fra representative kloner av sanger sekvensering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig3.jpg"> Figur 3 : Funksjonelle konsekvenser av lyddemper sletting. (A) de tre store RUNX1 isoformene (RUNX1a, RUNX1b og RUNX1c) vises. Disse variantene inneholder samme runt DNA bindende domene, men forskjellige N-(oransje) eller C-Terminus (blå). Plasseringen av TaqMan sonde/primer parene indikeres av røde linjer. Tall indikerer aminosyren rester. (B) sann tids kvantitativ RT-PCR-analyse av RUNX1 P1-og P2-avledede transkripsjoner i celle populasjoner med (del) eller uten (WT) biallelic slettinger18. GAPDH ble brukt til normalisering. * og * * indikerer p < 0,05 og p < 0,01, henholdsvis av mann-Whitney test. Dette tallet er endret fra Cheng et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells at JoVE.com

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Direkte levering av forhåndsmonterte Cas9/guide RNA ribonucleoprotein komplekser er en rask og effektiv måte for Genova redigering i blodkreft celler. Her bruker vi denne tilnærmingen til å slette en RUNX1 intronic lyddemper og undersøke transcriptional svar i OCI-AML3 Leukemic celler.

Gransking av Transcriptional rolle en RUNX1 Intronic lyddemper av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akutt myelogen leukemi celler

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Cis-regulatoriske elementer som arrangører og enhancers er viktige determinanter av genuttrykk. Tradisjonelle tilnærminger for å studere disse elementene er arbeidskrevende og involverer ofte bruk av heterologiske reportergener. Her demonstrerer vi bruken av CRISPR for å undersøke transkripsjonsrollen til en RUNX1 intronic lyddemper i leukemicellelinjen.Protokollen er enkel å utføre og tillater raske vurderinger av genreguleringsfunksjoner i endogene gensammenheng. Hematopoetiske celler er ofte vanskelige å transfisere med en plasmidbaserte metoder. I denne protokollen bruker vi elektroporasjonen til å levere forhåndsmontert Cas9, veilede RNA, komplekser inn i cellene.Fordelene med denne tilnærmingen inkluderer bruk av forbedret redigeringseffektivitet og celle levedyktighet samt reduserte off-target effekter. Også den påfølgende bruken av fragmentanalyse muliggjør enkel og rask screening av de ønskede muterte klonene fra en stor mengde prøver. Å demonstrere prosedyren vil være Yuk-Lin Yung, tekniker for laboratoriet mitt.Begynn med å designe to CRISPR RNAer, en fem prime og den andre tre prime av målet cis-regulatorisk element, eller CRE. Kontroller at en PAM av NGG er plassert umiddelbart nedstrøms av målsekvensen for Cas9 anerkjennelse. For å danne gRNA-komplekset, kombinerer crispr RNA og tracer RNA i TE-bufferen i henhold til manuskriptretninger, for en endelig duplekskonsentrasjon på 44 mikromos.Inkuber blandingen ved 95 grader celsius i fem minutter og la den avkjøles til romtemperatur. Fortynn den rekombinante Cas9-kjernen med PBS for en endelig kjernekonsentrasjon på 36 mikromos. Bland deretter et likt volum av den fortynnede kjernen med hver av gRNA-dupleksene og inkuber dem i 20 minutter ved romtemperatur for å la RNP-komplekset dannes.Sentrifuge 2,5 millioner celler i et 1,5 milliliter rør ved 500 ganger g i fem minutter. Kast deretter de overnaturlige og re-suspendere cellene i 163 mikroliter av RPMI 1640 medium uten fenol rød. Tilsett 16,7 mikroliter av RNP-komplekset og 3,6 mikroliter på 100 mikromolarelektroporasjonsforsterker til cellene og overfør blandingen til en 0,2 centimeter-gap elektroporasjonscuvette, og ta vare på å ikke introdusere noen bobler.Elektroporate cellene og overføre dem til en T-25 vev kultur kolbe som inneholder 6 milliliter av komplett RPMI 1640 medium. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid. En dag etter elektroporasjon fortynner cellene til 5000 celler per milliliter i komplett RPMI 1640 medium.Og tilsett 100 mikroliter av cellesuspensjonen i hver brønn av en 96-brønns vevskulturplate. Kultur cellene i syv til 14 dager deretter trekke genomisk DNA ved hjelp av en høy gjennomstrømning rensing system. Tilsett 100 mikroliter platebinding og lysisbuffer til hver brønn av en 96-brønnet ekstraksjonsplate, etterfulgt av 50 000 celler som er suspendert på nytt i 10 mikroliter PBS.Bland brønninnholdet ved å pipetter opp og ned. Inkuber platen ved romtemperatur i 30 minutter slik at det genomiske DNA-et kan binde seg til brønnene. Deretter aspirerer du forsiktig løsningen fra brønnene og vasker dem med 120 mikroliter vaskebuffer.Luft tørke platen. Legg til 20 mikroliter PCR-miks til hver brønn og kjør PCR i henhold til manuskriptretninger. Når forsterkningen er fullført, estimere mengden av produktet ved å måle konsentrasjonen av et valgt antall prøver med et fluorometer.Fortynn alle prøver til 0,5 nanogram per mikroliter med kjernefritt vann. Bland en mikroliter av det fortynnede PCR-produktet med 8,5 mikroliter av deionisert formamid og 0,5 mikroliter fluorescerende fargestoffmerket størrelsesstandard i en 96-brønns plat kompatibel med den genetiske analysatoren. Dekk platen med en plate septa og denature prøvene på 95 grader Celsius i tre minutter i en termocycler.Utfør kapillær elektroforese for å skille de merkede PCR-produktene og analysere resultatene på analyseprogramvaren. Kontroller det oransje ikonet for å vise de merkede fragmentene og størrelsesstandarden for å vurdere kvaliteten på størrelseskallet. Deretter kontrollerer du det blå ikonet for å vise de merkede PCR-produktene.Identifiser toppene som tilsvarer ville og muterte produkter, og estimer mutantnivået i hver prøve ved å dele området under den muterte toppen med summen av området under de ville og muterte toppene. Velg flere cellepuljer med høye nivåer av forventede slettinger for ytterligere seriell fortynning. Gjenta DNA ekstraksjon, fluorescerende PCR, og kapillær elektroforese trinn og velg kloner med muterte nivåer større enn 95%for påfølgende analyse.Trekk ut total RNA fra de valgte klonene og utfør gratis DNA-syntese. Bland RNA med en poly-T primer og dNTPs i henhold til manuskriptretninger og inkuber ved 65 grader Celsius i fem minutter. Deretter plasserer du reaksjonen på is i minst ett minutt.Tilsett ti mikroliter med cDNA synteseblanding til reaksjonen. Deretter inkuber prøven ved 50 grader Celsius i 50 minutter og 85 grader Celsius i fem minutter i en termocycler. Etter cDNA-syntese, behandle prøvene med en mikroliter RNase H og inkubere dem ved 37 grader Celsius i 20 minutter.Design primere og TaqMan sonder spesielt for individuell transkripsjon varians generert fra alternative arrangører og klone DNA fragmenter som inneholder de spesifikke transkripsjon sekvenser i plasmid DNA. Lag en tidoblet fortynningsserie av rekombinante plasmider som standardkurver for transkripsjonskvantifisering. Forbered 20 mikroliter PCR-miks for hver prøve og kjør sanntids-PCR i henhold til manuskriptretninger.Analyser resultatene og normaliser kopinummeret for målutskriftene i hver prøve med et rengjøringsgen. Denne protokollen har blitt brukt til å slette RUNX1 intronic lyddemper og slettingen ble bekreftet med kapillær gel elektroforese. De forventede størrelsene på de ville og muterte PCR-produktene er henholdsvis ca. 500 basispar og 230 basispar.Størrelsen på muterte produkter kan variere mellom klonene på grunn av indels dannet på cleavage nettsteder. Sanger sekvensering ble brukt til å bekrefte identiteten til slettingene. RUNX1 genet inneholder to promotorer, P1 og P2 som produserte tre store mRNA transkripsjoner: RUNX1c av P1, og RUNX1a og RUNX1b av P2. Kvantitativ PCR i sanntid kan brukes til å bestemme hvordan slettingen av lyddemperelementet påvirker uttrykket for disse transkripsjonene.En god design av CRISPR RNAs er viktig for sin vurdering av eksperimentet. Kontroller at CRSIPR RNA er pakket tett til det tiltenkte sletteområdet. Sørg også for at du også enn en PAM-sekvens er plassert nedstrøms av målsekvensen for Cas9-gjenkjenning.Bortsett fra å studere CREer, kan denne strategien brukes til genplasseringsstudier og fungerer som et alternativ til RNA-interferens for å undersøke genfunksjoner. Ved å kombinere med kromosomkonformasjonsfangstteknikker vil CRISPR sikkert bidra til å tyde involveringene til CREer i den endrede genomorganisasjonen og genuttrykket knyttet til ulike helseproblemer som kreft.

Research

JoVE Journal

Genetics

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Utvalgsavhengig og uavhengig generasjon av CRISPR / Cas9-medierte Gene Knockouts i mammale celler

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En Standard metode for å undersøke stedet genetisk virkning som en funksjon av punkt mutasjon reparasjon katalysert av CRISPR/Cas9 og SsODN i menneskeceller

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediert målrettet integrering i Vivo med en homologi-mediert slutten begynte-basert strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokoll for produksjon av Integrase dårlig Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-mediert Gene Knockout i dele celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produksjon og identifikasjon av CRISPR/Cas9-generert Gene Knockouts i modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En rask og lettvint rørledning for generering Genomic punkt mutanter i C. elegans bruker CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein merking i menneskelig indusert Pluripotent stilk celler med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediert presis Genredigering av tube electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Vi presenterer en Gene knockout direkte inn i Amastigote Stage av Trypanosoma cruzi bruker CRISPR/Cas9 system

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...