Name: investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells
Uploaded: 2019-09-01T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells at JoVE.com

Författarna skulle vilja tacka prof. MD Minden (Princess Margaret cancer Centre, University Health Network, Toronto, Kanada) för att tillhandahålla OCI-AML3 cellinjer. Dessutom skulle författarna vill tacka kärnan allmännyttiga cancer genomik och Pathobiology (Kinas universitet i Hongkong) för att tillhandahålla de faciliteter och stöd till stöd för denna forskning.

1. utformning av crRNA
<ol><li>Designa två crrnas, en 5 ' och den andra 3 ' av mål-CRE med hjälp av ett webbaserat CRISPR designverktyg28,29,30,31. Se till att en PAM av NGG ligger omedelbart nedströms i målsekvensen för Cas9 erkännande. Utformningen av de två crRNAs (crRNA-1 och crRNA-2) för strykningen av RUNX1 ljuddämpare18 visas i figur 1. Anmärkning: Ett crRNA innehåller vanligtvis en 20-mer protospacer som kompletterar målsekvensen.</li>
	<li>Kontrollera närvaron av enstaka nukleotid polymorfismer (SNPs)/indels i målet och angränsande pam sekvenser genom att ange genomiska platser av sekvenser i sökrutan på en online arvsmassa webbläsare (t. ex., ncbi 1000 genom eller ucsc Genome Browser). Anmärkning: Vanliga SNP/indels har en mindre Allelefrekvens på minst 1% i den allmänna populationen.</li>
	<li>Skicka in de valda crRNA-sekvenserna för syntes med en kommersiell leverantör. Också, köpa tracrRNA för gRNA duplex formation.</li>
</ol>2. utformning av Screeningprimers för radering
<ol><li>Designa ett par primers som flankerar den avsedda borttagnings regionen. Se till att primers är minst 50 BP från Cas9 klyvning platser så att PCR amplifiering påverkas minimalt av indels bildas på klyvning platser.</li>
	<li>Se till att amplikon är mindre än 1 200 BP (helst mindre än 600 BP för bättre storlek upplösning). Också, etikett en av primers med en fluorescerande färg (t. ex., 6-karboxyfluorescein (6-FAM)) vid 5 '-slut för detektion. De primers som används för screening av RUNX1 ljuddämpare deletion18 visas i figur 1.</li>
</ol>3. beredning av Cas9/gRNA RNP-komplex
<ol><li>Omsuspendera crRNAs och tracrRNA i 1x TE-buffert (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) till en slutlig koncentration av 200 μM.</li>
	<li>För varje crRNA, blanda 2,2 μL av 200 μM crRNA, 2,2 μL av 200 μM tracrRNA och 5,6 μL 1x TE buffert (totalt 10 μL) i en 0,2 mL tub för att få en slutlig duplex koncentration av 44 μM.</li>
	<li>Inkubera vid 95 ° c i 5 minuter i en ThermoCycler. Låt rören svalna till rumstemperatur för gRNA Complex formation.</li>
	<li>Späd 10,4 μL av 62 μM rekombinant Cas9 Nuclease med 7,6 μL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att erhålla en slutlig nukleaskoncentration på 36 μM. Anmärkning: Detta belopp är tillräckligt för beredning av två Cas9/gRNA komplex.</li>
	<li>Blanda lika volymer (8,5 μL) av de utspädda nukleaserna med var och en av de gRNA duplex som erhållits från steg 3,3.</li>
	<li>Inkubera i rumstemperatur i 20 minuter för att tillåta RNP-komplexbildning. Håll blandningar på is tills elektroporation.</li>
</ol>4. elektroporering av RNP-komplexen till OCI-AML3-celler
<ol><li>Kultur OCI-AML3 celler i RPMI 1640 medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 1x GlutaMAX, 100 enheter/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin (hädanefter kallat fullständigt RPMI 1640 medium) vid 37 ° c med 5% CO2.</li>
	<li>Räkna celler med trypan Blåfärgning. Se till att cellernas lönsamhet vid tiden för elektroporation är över 90%.</li>
	<li>Centrifugera 2,5 x 106 celler i en 1,5 ml tub vid 500 x g i 5 min vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och tvätta cellerna med 1 mL 1x PBS. Snurra ner cellerna igen och ta bort alla kvarvarande supernatanten.</li>
	<li>Omsuspendera cellerna i 163 μL RPMI 1640-medium utan fenolrött.  Tillsätt 16,7 μL av varje RNP-komplex (från steg 3,6) och 3,6 μL av 100 μM Elektroporationshöjande till cellerna (total volym = 200 μL). Blanda försiktigt genom pipettering. Anmärkning: Den Electroporation Enhancer är en bärare DNA för att förbättra redigering effektivitet.</li>
	<li>Överför blandningen till en 0,2 cm-gap elektroporation kyvetten utan bubblor. Utför elektroporation med ett elektroporeringssystem (läge: exponentiell; Spänning =: 150 V; Kapacitans = 700 μF; Resistans = 50 Ω).</li>
	<li>Överför cellerna till en T-25 vävnadskultur kolv innehållande 6 mL komplett RPMI 1640 medium och inkubera vid 37 ° c med 5% CO2.</li>
</ol>5. screening och val av Cellkloner med biallelic borttagningar
<ol><li>Späd cellerna till 5 x 103/ml i komplett rpmi 1640 medium en dag efter elektroporation. Tillsätt 100 μL av den utspädda cellsuspensionen i varje brunn av 96-väl vävnad kultur plattor och låta cellerna att växa för 7-14 dagar.</li>
	<li>Extrahera genomiskt DNA från cellerna med hjälp av ett högflöde reningssystem.</li>
	<li>Tillsätt 100 μL plattbindning och lyseringsbuffert till varje brunn på en 96-brunn extraktionsplatta. Tillsätt 5 x 104 celler som återsuspenderas i 10 μl 1x PBS till bufferten och blanda dem med pipettering.</li>
	<li>Inkubera i rumstemperatur i 30 minuter för att möjliggöra bindning av genomiskt DNA till brunnarna.</li>
	<li>Aspirera lösningen från brunnarna utan att skrapa på brunnen ytbehandlar. Tvätta brunnarna med 120 μL tvättbuffert.</li>
	<li>Lufttorka brunnarna som innehåller det bundna DNA-</li>
	<li>Förbered 20 μL PCR-blandning (2 μL 10X High Fidelity-buffert, 0,8 μL av 50 mM MgSO4, 0,4 μl 10 mm dNTPs, 0,4 μl av 10 μm fam-märkt framåtprimer (steg 2,2), 0,4 μl av 10 μm omärkt omvänd primer och 0,4 U av Taq DNA-polymeras för varje prov). Anmärkning: Förbered en Master Mix för att säkerställa tillsats av standardiserade mängder reagens i varje prov.</li>
	<li>Tillsätt PCR-mixen till varje brunn av extraktionsplattan och kör reaktionerna i en termocycler (villkorar: initialt 94 ° c för 2 minuter, följt av 35 cyklar av 94 ° c för 15 s, 56 ° c för 30 s och 68 ° c för 1 minuter).</li>
	<li>Uppskatta mängden av produkterna genom att mäta deras koncentrationer i ett utvalt antal prover med hjälp av en fluorometer. Späd ut alla prover med nukleasfri H2O till 0,5 ng/μl.</li>
	<li>Blanda 1 μL av de utspädda PCR-produkterna med 8,5 μL avjoniserat formamid och 0,5 μL av fluorescerande Dye-märkt storleks standard i en 96-bra tallrik som är kompatibel med den genetiska analysatorn. Anmärkning: Förbered en Mastermix som innehåller avjoniserad formamid och storleks standard.</li>
	<li>Täck plattan med en tallrik septa och denaturera proverna vid 95 ° c i 3 min i en ThermoCycler. Stäng inte locket på maskinen.</li>
	<li>Utför kapillärgelelektrofores för att separera de märkta PCR-produkterna som beskrivits tidigare32.</li>
	<li>Efter elektrofores, öppna analysprogramvara för att analysera resultaten.</li>
	<li>Klicka på nytt projekt och välj mikrosatellit. Klicka sedan på OK.</li>
	<li>Klicka på Lägg till exempel i Project och välj resultatfilerna (innehåller tillägget. FSA). Klicka sedan på Lägg till i listan för att importera filerna.</li>
	<li>Välj Mikrosatellitstandard i kolumnen analysmetod i tabellen som visar de valda resultatfilerna. Välj också den storleks standard som används i kolumnen storleks standard . Klicka sedan på ikonen analysera , ange experimentets namn och spara experimentet.</li>
	<li>Klicka på Visa tomter för att visa resultaten och välj fragmentanalys i plottinställningen.</li>
	<li>Välj lämpliga färgade kanaler för analys. Kontrollera den orangefärgade ikonen för att visa de märkta fragmenten i storleks standarden för att bedöma kvaliteten på samtal.</li>
	<li>Kontrollera den blå ikonen för att visa de märkta PCR-produkterna. Identifiera de toppar som motsvarar Wild-Type och Mutant (dvs. med förväntade borttagningar) produkter. Beräkna mutantnivån i varje prov genom att dividera arean under den muterade toppen med summan av området under Wild-Type-och Mutant-topparna.</li>
	<li>Välj flera cellpooler med höga nivåer av förväntade borttagningar för ytterligare seriella utspädningar.</li>
	<li>Upprepa DNA-extraktion, fluorescerande PCR och kapillärelektrofores steg. Välj cell kloner med Mutant nivåer > 95% representerar biallelic borttagningar för efterföljande analyser.</li>
	<li>Kontrollera identiteten för borttagningarna i de valda klonerna med Sanger-sekvensering.</li>
</ol>6. funktionella analyser av ljuddämparen som tas bort genom real tids kvantitativ RT-PCR-analys
<ol><li>Extrahera totalt RNA från de valda klonerna och utföra komplementär DNA (cDNA) syntes.</li>
	<li>Blanda 1 μg RNA med 1 μL 50 μM oligo (dT)20 primer och 1 μl 10 mm dNTP-blandning i en total volym på 10 μl. Inkubera vid 65 ° c i 5 min och Lägg sedan på is i minst 1 min.</li>
	<li>Tillsätt 10 μL cDNA-syntes blandning innehållande 2 μL 10X RT-buffert, 4 μL 25 mM MgCl2, 2 μl 0,1 M DTT, 1 μl RNase-hämmare (40 u/μl) och 1 μl omvänt transkriptas (200 U/μl). Inkubera vid 50 ° c för 50 min och sedan 85 ° c i 5 min i en termocycler. Anmärkning: Förbered en Master Mix för omvänd Transkription.</li>
	<li>Chill proverna på isen. Tillsätt 1 μL av RNase H och inkubera vid 37 ° c i 20 min. Förvara cDNA vid-20 ° c.</li>
	<li>Design primers och TaqMan sonder som specifikt känner igen enskilda transkription varianter genereras från alternativa projektansvariga. Anmärkning: Pre-designade transkription-specifika primer/sond-apparater är kommersiellt tillgängliga.</li>
	<li>Klona DNA-fragment som innehåller de specifika transkriptionssekvenserna till plasmid DNA. Bered en 10-faldig spädningsserie (106 till 10 kopior) av de rekombinanta plasmiderna som standardkurvor för kvantifiering av transkriptionen.</li>
	<li>Förbered 20 μL PCR-blandning (0,5 μL DNA-mall, 1 μL 20x färdigdesignad TaqMan-sond/primer-analys och 10 μL 2x TaqMan PCR Master Mix) för varje prov (både cDNA-och plasmid-standarder). Mät varje prov i tre exemplar. Anmärkning: Förbered en Mastermix för realtids PCR.</li>
	<li>Kör reaktionerna i en realtids PCR-maskin (villkor: initial 50 ° c för 2 min och 95 ° c i 10 min, följt av 40 cykler på 94 ° c i 15 s och 60 ° c i 1 min).</li>
	<li>Efter amplifieringen klickar du på ikonen analysera i programvaran för att analysera data. Kontrollera lutningen och korrelationskoefficienten för standard kurvorna för att utvärdera reaktioners effektivitet och linearitet. Se till att backarna är mellan-3,1 och-3,6 och korrelationskoefficienterna är större än 0,99.</li>
	<li>Normalisera kopierings numret för mål avskrifter i varje prov med en städ-gen (t. ex. GAPDH).</li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

CRISPR/Cas9-systemet har använts i ett brett spektrum av gen redigeringsprogram såsom genknockout och Knock-in-studier35,36, transkriptionell reglering37,38, genteknik av olika modellorganismerna39,40,41,42,43,44 och genterapi45,46. Här demonstrerar vi användningen av CRISPR/Cas9 för att undersöka de funktionella konsekvenserna av att ta bort en intronic ljuddämpare på RUNX1 genen. Leveransen av CRISPR komponenter i vår strategi inte förlita sig på plasmid DNA, kloning av gRNA eller virus men elektroporation av förmonterade Cas9/gRNA RNP komplex. Det har visats att användning av EXOGEN DNA kan associeras med oönskad integration av främmande vektorsekvenser i värdens arvsmassa, ökad toxicitet och låg verkningsgrad25,47,48, medan virustransduktionmetoder är tidskrävande. Dessutom, långvarig uttryck av Cas9 från plasmid DNA kan öka off-mål effekter48. Tvärtom, den direkta RNP-baserade leveransmetoden har etablerats som den bästa metoden eftersom det är snabbt och enkelt med förbättrad redigering effektivitet, selektivitet och cellernas lönsamhet. Faktum är att en mängd olika metoder såsom lipofection49,50, elektroporation25,51, nanopartiklar52, cell-penetrerande peptider53, itop54 och triamf 55 har utvecklats för effektiv CRISPR/Cas9 leverans till olika celltyper samt djur-och växtarter24,25,26,56,57 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63. eftersom icke-kodning av DNA-sekvenser är hotspots för genetiska variationer64, kontrollera närvaron av gemensamma SNPs/indels i målet och angränsande pam sekvenser är särskilt relevant när man utformar grna som mål reglerande Element.
En flaskhals i CRISPR/Cas9 genom redigering innebär screening av önskade muterade kloner i ett stort antal prover. Vi anställda fluorescerande PCR tillsammans med kapillär gel elektrofores för screening som mål mutation är en liten genomisk radering av cirka 300 BP. Denna metod är snabb och känslig och kan utföras i en hög genomströmning mode. Dessutom tillåter denna metod korrekt uppskattning av muterade nivåer och borttagnings storlekar samtidigt. Dessutom stöds multiplex-analys av PCR-fragment som märkts med olika fluorescerande färgämnen. Vi har rutinmässigt använder denna teknik för att genotyp små införanden/borttagningar i myeloida neoplasmer65,66. Enligt vår erfarenhet kan vi konsekvent upptäcka fragment storlekar som skiljer sig med 4 BP med hög precision och Mutant börda ner till ~ 3%. Det bör dock noteras att denna metod har en fragmentstorlek gräns på 1 200 BP, och därmed är det inte lämpligt för screening av stora borttagningar. Dessutom kan inte bas ersättningar (resulterande i oförändrad fragmenstorlek) och potentiella händelser utanför mål i andra genomiska regioner upptäckas. För den senare, den kostsamma hela Genomsekvensering krävs för att utförligt profilera globala oönskade förändringar i mål klonerna. För att anta vår nuvarande strategi för utredning av stora icke-kodning regulatoriska sekvenser (> 1000 BP), en detaljerad radering och mutagenes analyser av förmodade transkriptionsfaktor bindningsställen med in vitro -reporter genanalyser kan utföras i förväg för att avgränsa den minimala funktionella regionen för CRISPR/Cas9 redigering18.
Eftersom många gener innehåller mer än en initiativtagare3,4, är det viktigt att vara medveten om förekomsten av alternativa initiativtagare i mål genen Locus som manipulerande reglerande faktorer kan påverka initiativtagarna Differentiellt. Transkriptionsvarianter som härleds från olika projektansvariga måste därför mätas individuellt för att utvärdera eventuella projektspecifika svar. Användning av TaqMan sond-baserade analyser är att föredra framför SYBR Green på grund av bättre specificitet och reproducerbarhet. Om det mer avancerade digitala PCR-systemet finns tillgängligt, kan transkriptionskvantifieringen utföras mer exakt utan behov av standardkurva konstruktion.
En viktig faktor i att utföra CRISPR/Cas9 experiment i cancer cellinjer är ploidi och mål gen kopia nummer i de celler som används som praktiskt taget alla cancer cellinjer Harbor genetiska förändringar inklusive strukturella och kopiera nummer variationer. I vårt fall, OCI-AML3 har en hyperdiploid karyotyp med 45 till 50 kromosomer. Dessutom konstaterades cellinjer att bära en normal RUNX1 kopia nummer som avslöjas från cancer cellinjer Encyclopedia67 och fluorescens in situ hybridisering studier18. När du riktar en gen med kopia antal Gain, leveransmetoden kan behöva optimeras för att ge tillräckliga nivåer av CRISPR komponenter för redigering. Dessutom kan fler kloner behöva screenas för att identifiera hela Knockouts. Framför allt har det visats att inriktning på förstärkta genomiska regioner, särskilt de som orsakas av strukturella omordningar, kan utlösa gen oberoende antiproliferativa reaktioner i cancerceller, vilket leder till falskt positiva resultat i gen funktionella studier68,69,70. I detta avseende bör alternativa metoder som RNA-interferens (RNAi) knockdown och/eller cDNA-överuttryck användas för att kontrollera CRISPR-fynden. Dessutom bör flera cellinjer användas för att undvika feltolkningar av celllinjespecifika men gen oberoende CRISPR-redigeringseffekter.
CRISPR/Cas9-systemet har revolutionerat grundläggande och translationell forskning genom att tillhandahålla ett enkelt och effektivt sätt att genomredigera. Här visar vi hur lätt det är att använda CRISPR/Cas9 för att störa en intronic ljuddämpare för transkriptionella studier i en cancer cells linje. Denna teknik möjliggör studiet av CREs på DNA-nivå och erbjuder möjligheter att undersöka CRE funktioner i endogena sammanhang snarare än den traditionella heterologa reporter gener. Nyligen har en CRISPR-baserade RNA-redigeringssystem också identifierats71 och kan fungera som ett nytt verktyg för att studera CREs genom att rikta RNA transkriberas från de reglerande elementen. Genom att kombinera med kromosom konformation fånga tekniker, CRISPR/Cas9 kommer säkerligen att hjälpa dechiffrera inblandning av CREs i förändrad arvsmassa organisation och genuttryck kopplade till olika hälsoproblem.

CIS-regulatoriska element (CREs) är icke-KODANDE DNA-sekvenser som innehåller bindningsställen för transkriptionella regulatorer för att kontrollera genuttryck1,2. Dessa element är vanligtvis 100 till 1 000 baspar (BP) lång. Initiativtagare och förstärkare är de två mest karakteriserade typer av CREs. Initiativtagarna är närvarande i nära anslutning till avskrift startplatser och utgör den grundläggande enheten för transkription. Många gener har mer än en promotor och deras alternativa användning bidrar till transkriptome mångfald och vävnad specificitet3,4. Å andra sidan, förstärkare aktivera transkription och kan lokaliseras uppströms, nedströms eller inom introner av målgener. Enhancers kan agera från långt avstånd (över en megabas) och oberoende av orientering1,2. CREs inkluderar även ljuddämpare och isolatorer5,6. Den förstnämnda agerar motsatt till förstärkare för att hämma genuttryck genom bindning till transkriptionella repressorer, medan den senare partitioner arvsmassan till diskreta topologiskt domäner att isolera gener från andra CREs från angränsande domäner. Dessa element fungerar i samförstånd med varandra genom kort-och/eller långväga kromatin interaktioner och är organiserade i regulatoriska nav för att direkt korrekt spatiotemporal genuttryck. Senaste framstegen i hög genomströmning sekvenserings tekniker har påskyndat identifiering och funktionell anteckning av många CREs som avsevärt har underlättat vår förståelse av transkriptionella nätverk som dikterar härstamnings-specifik gen uttryck i olika cell-och vävnadstyper7,8,9,10,11,12.
Med tanke på de grundläggande rollerna för CREs i regleringen av transkription, kan deras förändringar leda till avvikande genuttryck. Det har visats att CREs ofta störs av genetiska och epigenetiska förändringar i olika typer av mänskliga cancerformer, vilket bidrar till tumör initiering, progression och aggressivitet13,14. Dessutom är CRE-bindande faktorer ofta muterade och/eller misexpressed i olika cancertyper, ytterligare belysa betydelsen av CRE avreglering i Onkogenes15. CREs kan också påverkas av strukturella avvikelser, som exemplifieras av frekventa kromosomala omställningar av immunglobulin tunga (IgH) gen förstärkare som resulterar i onormal aktivering av angränsande onkogener i B-cells lymfkörtelcancer16. Vid akut myeloisk leukemi (AML), omplacering av en enda förstärkare av kromosom 3Q omordningar orsakar samtidig GATA2 nedreglering och EVI1 aktivering, som kan potentiellt riktas genom att satsa hämning av förstärkare funktioner 17. nyligen, vi kännetecknas en roman kromosom flyttning med störning av en RUNX1 intronic ljuddämpare som kan bidra till AML progression i en pediatrisk patient18. Således, dechiffrera icke-kodning cancer arvsmassa ger givande vägar för att belysa sjukdomens patogenes, biomarkör upptäckt och terapeutiska interventioner, som i slutändan förbättra patientens resultat.
Den CRISPR/Cas9 Nuclease väg, ursprungligen identifierats som ett adaptivt immunsystem i prokaryotiska celler, har utnyttjats som ett snabbt och kostnadseffektivt sätt för platsspecifik genomisk redigering i levande celler och organismer19,20 ,21,22. Den CRISPR/Cas9 systemet omfattar två huvudsakliga komponenter: den gRNA och Streptococcus pyogenes-derived Cas9 Nuclease. GRNA innehåller en specifik sekvens som kallas protospacer som känner igen målregionen och dirigerar Cas9 för redigering. Den gRNA består av två delar: CRISPR RNA (crRNA), typiskt en 20-mer nukleotid sekvens komplement till målet DNA, och en trans-aktiverande crRNA (tracrRNA), som fungerar som en bindande ställningen för Nuclease. Ett protospacer angränsande motiv (PAM) (5 '-NGG) omedelbart intill målplatsen krävs för Cas9 klyvning och klyvning platsen ligger 3 nukleotider uppströms PAM. CRISPR/Cas9-medierad genredigering utförs vanligen av transfecting celler med en Plasmid som kodar Cas9 och klonade gRNA23. Emellertid, detta tillvägagångssätt är utmanande för hematopoietiska celler, som ofta är svåra att transfect och kräver långa virusbaserade transduktionmetoder. En alternativ metod är direkt cellulära leverans av förmonterade Cas9/gRNA RNP komplex24. En vanlig metod för RNP leveransen är elektroporation, som genererar tillfälliga porer i cellmembranet, vilket möjliggör inträde av RNP-komplexen i cellerna25,26. Fördelarna med detta tillvägagångssätt är användarvänlighet, minskade off-Target effekter och stabiliteten i RNP komplexen. Här beskriver vi ett protokoll för att använda RNP leveransmetod för att undersöka den transkriptionella roll som en RUNX1 intronic ljuddämpare i OCI-AML3 leukemi cell linje18, som fastställdes från perifert blod av en AML-patient diagnostiserades med den fransk-amerikanska-brittiska M4 subtyp27. Protokollet omfattar utformningen av crRNA, beredning av RNP-komplex, elektroporation samt screening och efterföljande karakterisering av de önskade klonerna.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">0.2 cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652086</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1&#215;TE buffer, pH7.5</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">10mM dNTP mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">3500 Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4405673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 System SDS Software</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td>Version 1.3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Bio-Rad Gene Pulser Xcell system</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">CS11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-1</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-2</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Electroporation Enhancer</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">10270098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fluorometer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneMapper Software 5</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4475073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneScan 600 LIZ Size Standard</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4408399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PBS, 10X Solution, pH7.4</td>
			<td style="width:208px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:176px;">75889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11304029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1081058</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium without phenol red</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1a TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs04186042_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1b/c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs00231079_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs01021966_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1072533</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TRIzol Reagent</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Unlabeled PCR reverse primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells

Huvuddelen av människans arvsmassa (~ 98%) består av icke-kodningssekvenser. CIS-regulatoriska element (CREs) är icke-kodning DNA-sekvenser som innehåller bindande platser för transkriptionella tillsynsmyndigheter att modulera genuttryck. Förändringar av CREs har varit inblandade i olika sjukdomar inklusive cancer. Medan initiativtagare och förstärkare har varit den primära CREs för att studera genreglering, mycket lite är känt om den roll som ljuddämpare, som är en annan typ av CRE som förmedlar gen förtryck. CRISPR/Cas9, som ursprungligen identifierades som ett adaptivt immunitetssystem i prokaryoter, har utnyttjats för att vara ett kraftfullt verktyg för eukaryotisk genomredigering. Här presenterar vi användningen av denna teknik för att ta bort en intronic ljuddämpare i human RUNX1 Gene och undersöka effekterna på genuttryck i OCI-AML3 leukemi celler. Vårt förhållningssätt förlitar sig på Electroporation-medierad leverans av två förmonterade Cas9/guide RNA (grna) ribonukleoprotein (RNP) komplex för att skapa två dubbel-strand raster (DSBs) som flanera ljuddämparen. Borttagningar kan lätt kontrolleras genom fragmentanalys. Uttrycks analyser av olika mRNA som transkriberas från alternativa promotorer hjälper till att utvärdera Promotorns beroende effekter. Denna strategi kan användas för att studera andra CREs och är särskilt lämplig för hematopoietiska celler, som ofta är svåra att transfect med plasmid-baserade metoder. Användningen av en Plasmid-och virusfri strategi möjliggör enkla och snabba bedömningar av gen reglerande funktioner.

Syftet med detta experiment är att ta bort en intronic ljuddämpare i RUNX1 genen och undersöka effekterna på RUNX1 transkription i OCI-AML3 celler. Ljuddämparen identifierades med en kombinatorisk molekylär metod och konstaterades innehålla en 209 BP kärnelement18. För att möjliggöra en mer exakt utvärdering av detta kärnelement i kontrollen av RUNX1 uttryck utformades crRNAs (crrna-1 och crrna-2) för att rikta in sig nära denna region18 (figur 1). Den förutspådde Cas9 klyvning platser som väckts av crRNA-1 och crRNA-2 var 29 BP och 35 BP från kärn elementet, respektive (figur 1). Det bör noteras att medan PAM platser av de två crRNAs bor på motsatta strängar, DSBs kommer att ske oberoende av PAM sekvens plats. Sålunda, samtidig införandet av två Cas9/grna RNP komplex styrs av crrna-1 och crrna-2 förväntas att accis den ljuddämpare elementet från RUNX1 Locus.
Till skärm för de önskade borttagningarna i ett stort antal prover, en 96-väl format av genomisk DNA Extraction Kit användes för hög genomströmning rening. Också, DNA bunden på brunnarna av extraktionsplattorna kan utsättas för direkt förstärkning, vilket minimerar fel eller kontaminering på grund av upprepad provöverföring. De primers som används för screening av borttagningarna18 visas i figur 1. Den förväntade storleken på Wild-Type PCR-produkten är ca 500 BP. Eftersom den avsedda borttagningen spänner över 273 BP, den muterade produkten förväntas vara cirka 230 BP. Denna storleksklass möjliggör enkel och snabb fragmentanalys av kapillärgel elektrofores. Sammanlagt 160 initiala cellpooler screenades och 14 konstaterades bära de förväntade borttagningarna med muterade nivåer på minst 70%. Fem pooler valdes sedan för ytterligare seriella utspädningar för att identifiera kloner som bär biallelic borttagningar. Representativa elektrofoniogram från cellkloner med olika nivåer av muterade produkter visas i figur 2A. Identiteten på borttagningarna kontrollerades av sanger-sekvensering (figur 2B). Som förväntat, indels bildas av icke-homolog sammanfogning reparation av DSBs33 observerades vid den förutspådda klyvning platser i strykningen kloner. Dessa resulterade i förstärkning av muterade produkter av varierande storlek, vilka också kunde upptäckas genom kapillärelektrofores (figur 2a).
Den RUNX1 genen innehåller två initiativtagare nämligen distala P1 och proximala P2, som skiljs åt av en stor intron härbärgen ljuddämpare elementet34. Tre stora mRNA-utskrifter produceras av dessa initiativtagare: RUNX1c av P1 och RUNX1a och RUNX1b av P234. Den nukleotidsekvens av RUNX1c och RUNX1b är identiska utom den förstnämnda har en unik N-Terminus, från vilken en specifik TaqMan gen uttrycks analys kan utformas (figur 3a). För att mäta RUNX1banvändes en TaqMan-analys som erkände både RUNX1b och RUNX1c (figur 3a). RUNX1b nivåer bestämdes då genom att subtrahera total RUNX1b/RUNX1c från RUNX1c. RUNX1a är en distinkt kortare isoform på grund av alternativa skarvning och en specifik TaqMan-analys finns tillgänglig för denna variant (figur 3a). Aktiviteten hos projektansvariga P1 och P2 kan således bestämmas individuellt. Kvantitativa RT-PCR i real tid visade att strykningen av ljuddämparen avsevärt uppställde uttrycksnivåerna för både P1-och P2-härledda utskrifter (figur 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig1.jpg"> Figur 1 : Strategi för att ta bort RUNX1 intronic ljuddämpare. Ljuddämparen (röd ruta) är placerad i den första intron av RUNX1 -genen som separerar de två projektansvariga P1 och P2 (hg19 koordinater visas). Två crRNAs (crRNA-1 och crRNA-2) utformades för att introducera DSBs som flör ljuddämparen elementet. Den förutspådda Cas9 klyvning platser indikeras av vertikala röda linjer och PAM platser (NGG) är i lila. De två primers som används för gallring av borttagningar representeras av öppna pilar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig2.jpg"> Figur 2 : Identifiering av borttagandet kloner. A) representativa elektrofoniogram av cellkloner som uppvisar olika nivåer av MUTERADE PCR-produkter (MUT). Storleken på muterade produkter varierar mellan klonerna på grund av indels bildas på klyvning platser. WT = Wild-Type. Bkontroll av borttagningar från representativa kloner med Sanger-sekvensering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig3.jpg"> Figur 3 : Funktionella följder av ljuddämparen radering. A) de tre stora RUNX1 isoformerna (RUNX1a, RUNX1b och RUNX1c) visas. Dessa varianter innehåller samma runt DNA-bindnings domän men olika N-(orange) eller C-terminus (blå). Placeringen av TaqMan sond/primer par indikeras av röda linjer. Siffror indikerar aminosyran rester. B) kvantitativ RT-PCR-analys i real tid av RUNX1 P1-och P2-härledda utskrifter i cellpopulationer med (del) eller utan (WT) biallelic-borttagningar18. GAPDH användes för normalisering. * och * * ange p < 0,05 och p &Lt; 0,01 respektive av Mann-Whitney-provet. Denna siffra har modifierats från Cheng et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells at JoVE.com

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Direktleverans av förmonterade Cas9/guide RNA ribonukleoprotein komplex är ett snabbt och effektivt sätt för genomredigering i hematopoietiska celler. Här använder vi denna metod för att ta bort en RUNX1 intronic ljuddämpare och undersöka transkriptionella svaren i OCI-AML3 leukemi celler.

Utredning av den transkriptionella roll som en RUNX1 Intronic ljuddämpare av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akut myeloisk leukemi celler

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Cis-reglerande element som initiativtagare och förstärkare är viktiga bestämningsfaktorer för genuttryck. Traditionella metoder för att studera dessa element är mödosamma och innebär ofta användning av heterologa reportergener. Här visar vi användningen av CRISPR för att undersöka transkriptionella roll en RUNX1 intronic ljuddämpare i leukemi cellinje.Protokollet är enkelt att utföra och tillåter snabba bedömningar av genreglerande funktioner i det endogena gensammanhanget. Hematopoetiska celler är ofta svåra att transfekt med en plasmid baserade metoder. I detta protokoll använder vi elektroporationen för att leverera förmonterade Cas9, guide RNA, komplex in i cellerna.Fördelarna med detta tillvägagångssätt inkluderar användning av förbättrad redigering effektivitet och cellens bärkraft samt minskade off-target effekter. Även den efterföljande användningen av fragmentanalys möjliggör enkel och snabb screening av de önskade mutantklon från en stor mängd prover. Demonstrerar proceduren blir Yuk-Lin Yung, tekniker för mitt laboratorium.Börja med att designa två CRISPR RNAs, en femprime och de andra tre främsta av mål cis-reglerande element, eller CRE. Se till att en PAM av NGG ligger omedelbart nedströms av målsekvensen för Cas9-igenkänning. För att bilda gRNA-komplexet, kombinera CRISPR RNA och spår-RNA i TE-buffert enligt manuskriptriktningar, för en slutlig duplexkoncentration på 44 mikromolar.Inkubera blandningen vid 95 grader celsius i fem minuter och låt den svalna till rumstemperatur. Späd den rekombinanta Cas9-nukleasen med PBS för en slutlig nukleaskoncentration på 36 mikromolar. Blanda sedan en lika stor volym av den utspädda nukleasen med var och en av gRNA-duplexerna och inkubera dem i 20 minuter vid rumstemperatur så att RNP-komplexet kan bildas.Centrifugera 2,5 miljoner celler i ett 1,5 milliliter rör vid 500 gånger g i fem minuter. Sedan kassera supernatant och åter upphäva cellerna i 163 mikroliter av RPMI 1640 medium utan fenolröd. Tillsätt 16,7 mikroliter av RNP-komplexet och 3,6 mikroliter av 100 mikromolarelektroporationsförstärkare till cellerna och överför blandningen till en 0,2 centimeters gapelektroporationsv cuvette, var noga med att inte introducera några bubblor.Elektroporat cellerna och överföra dem till en T-25 vävnadsodlingskolv som innehåller 6 milliliter komplett RPMI 1640 medium. Inkubera cellerna i 37 grader Celsius med 5%koldioxid. En dag efter elektroporation, späd cellerna till 5000 celler per milliliter i komplett RPMI 1640 medium.Och tillsätt 100 mikroliter av cellen suspension i varje brunn av en 96-väl vävnad kultur tallrik. Odla cellerna i sju till 14 dagar och extrahera sedan genomiskt DNA med hjälp av ett reningssystem med hög genomströmning. Tillsätt 100 mikroliter av plåtbindning och lysbuffert till varje brunn av en 96-välde extraktionsplatta, följt av 50, 000 celler åter upphängda i 10 mikroliter av PBS.Blanda brunnsinnehållet genom att pipettera upp och ner. Inkubera plattan i rumstemperatur i 30 minuter för att låta det genomiska DNA:t binda till brunnarna. Sedan försiktigt aspirera lösningen från brunnarna och tvätta dem med 120 mikroliter av tvättbuffert.Lufttorka plattan. Lägg till 20 mikroliter av PCR mix till varje brunn och kör PCR enligt manuskriptet riktningar. När förstärkningen är klar, uppskatta produktens mängd genom att mäta koncentrationen av ett utvalt antal prover med en fluorometer.Späd alla prover till 0,5 nanogram per mikroliter med nukleasfritt vatten. Blanda en mikroliter av den utspädda PCR-produkten med 8,5 mikroliter av avjoniserad formamid och 0,5 mikroliter av fluorescerande färgämnesmärkta storleksstandard i en 96-brunns plat kompatibel med den genetiska analysatorn. Täck plattan med en plattsepa och denaturera proverna i 95 grader Celsius i tre minuter i en termocyklare.Utför kapillärelektrofores för att separera de märkta PCR-produkterna och analysera resultaten på analysprogramvaran. Kontrollera den orange ikonen för att visa de märkta fragmenten och storleksstandarden för att bedöma kvaliteten på storleksanrop. Kontrollera sedan den blå ikonen för att visa de märkta PCR-produkterna.Identifiera de toppar som motsvarar produkter av vildtyp och mutantprodukter och uppskatta mutantnivån i varje prov genom att dela upp området under mutanttoppen med summan av området under wild-type och mutanttopparna. Markera flera cellpooler med höga nivåer av de förväntade borttagningarna för ytterligare serieutspädningar. Upprepa DNA-extraktionen, fluorescerande PCR- och kapillärelektroforesstegen och välj kloner med mutantnivåer som är större än 95 %för efterföljande analys.Extrahera totalt RNA från de utvalda klonerna och utför gratis DNA-syntes. Blanda RNA med en poly-T primer och dNTPs enligt manuskriptriktningar och inkubera vid 65 grader Celsius i fem minuter. Placera sedan reaktionen på is i minst en minut.Lägg till tio mikroliter av cDNA syntes mix till reaktionen. Sedan inkubera provet vid 50 grader Celsius i 50 minuter och 85 grader Celsius i fem minuter i en termocyklare. Efter cDNA-syntesen behandlar du proverna med en mikroliter av RNase H och inkuberar dem i 37 grader Celsius i 20 minuter.Designprimrar och TaqMan-sonder speciellt för individuell avskriftsvarians som genereras från alternativa initiativtagare och klona DNA-fragmenten som innehåller de specifika avskriftssekvenserna till plasmid-DNA. Gör en tiofaldig utspädningsserie av de rekombinanta plasmiderna som standardkurvor för transkriptionskvantifiering. Förbered 20 mikroliter av PCR mix för varje prov och kör realtid PCR enligt manuskriptet riktningar.Analysera resultaten och normalisera kopians nummer av målavskrifterna i varje prov med en hushållningsgen. Detta protokoll har framgångsrikt använts för att radera RUNX1 intronic ljuddämpare och borttagningen bekräftades med kapillär gel elektrofores. De förväntade storlekarna på de vilda pcr-produkterna och mutanta PCR-produkter är ca 500 baspar respektive 230 baspar.Storleken på de muterade produkterna kan variera mellan klonerna på grund av indels bildas vid klyvning platser. Sanger sekvensering användes för att bekräfta identiteten på borttagningarna. RUNX1-genen innehåller två initiativtagare, P1 och P2 som producerade tre stora mRNA-avskrifter:RUNX1c av P1, och RUNX1a och RUNX1b av P2. Realtid kvantitativa PCR kan användas för att avgöra hur borttagningen av ljuddämpare elementet påverkar uttryck för dessa avskrifter.En bra design av CRISPR RNAs är viktigt för dess bedömning av experimentet. Se till att CRSIPR-RNA är förpackat nära den avsedda borttagningsregionen. Säkerställ också än en PAM-sekvens ligger nedströms av målsekvensen för Cas9-igenkänning.Förutom att studera CRE kan denna strategi användas för genplatsstudier och fungerar som ett alternativ till RNA-interferens för att undersöka genfunktioner. Genom att kombinera med kromosom konformation capture tekniker CRISPR kommer säkert att hjälpa dechiffrera medverkan av CREs i den förändrade genomet organisation och genuttryck kopplade till olika hälsoproblem som cancer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Urval-beroende och oberoende generering av CRISPR / Cas9-medierade genknockouts i däggdjursceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetod att undersöka Hotellets mutagenicitet som en funktion av punktmutation reparation katalyseras av CRISPR/Cas9 och SsODN i mänskliga celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medierad riktade Integration In Vivo som använder en homologi-medierad slutet att gå-baserad strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ett protokoll för produktionen av integras-brist Lentiviral vektorer för CRISPR/Cas9-medierad gen Knockout i delande celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion och identifiering av CRISPR/Cas9-genererade gen Knockouts i det modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En snabb och lättköpt Pipeline för generera genomisk punkt mutanter i C. elegans med CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogen Protein taggning i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-medierad exakt gen redigering av Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Införa en gen knockout direkt i Amastigote skede av Trypanosoma cruzi med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...