Name: investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells
Uploaded: 2019-09-01T15:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells at JoVE.com

Yazarlar Prof Md Minden (Prenses Margaret Kanser Merkezi, Üniversite Sağlık Ağı, Toronto, Kanada) OCI-AML3 hücre hattı sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, yazarlar Bu araştırmayı desteklemek için tesisleri ve yardım sağlamak için Kanser Genomik ve Patobiyoloji (Hong Kong Çin Üniversitesi) Çekirdek Utilities teşekkür etmek istiyorum.

1. crRNA tasarımı
<ol><li>Tasarım iki crRNA, bir 5' ve diğer 3 'hedef CRE bir webtabanlı CRISPR tasarım aracı 28 kullanarak,29,30,31. Cas9 tanıma için hedef sıranın hemen aşağısında ngg pam'in bulunduğundan emin olun. RUNX1 susturucu 18'in silinmesi için iki crRNA'nın (crRNA-1 ve crRNA-2) tasarımı Şekil1'de gösterilmiştir. NOT: CrRNA genellikle hedef sırasını tamamlayıcı olan 20-mer protospacer içerir.</li>
	<li>Tek nükleotit polimorfizmlerinin (SNP'ler)/hedef ve bitişik PAM dizilerinde, dizilerin genomik konumlarını çevrimiçi bir genom tarayıcısının (örneğin, NCBI 1000 Genomlar veya UCSC GenomE Browser) arama kutusuna girerek varlığını kontrol edin. NOT: Yaygın SNP'ler/indeller genel popülasyonda en az %1'lik küçük bir alel frekansına sahiptir.</li>
	<li>Seçilen crRNA dizilerini ticari bir satıcıyla senteziçin gönderin. Ayrıca, gRNA dubleks oluşumu için tracrRNA satın alın.</li>
</ol>2. Silme Tarama Astarlarının Tasarımı
<ol><li>Amaçlanan silme bölgesini çevreleyen bir çift astar tasarla. PcR amplifikasyonunun dekolte bölgelerinde oluşan indellerden en az etkilenmesi için astarların Cas9 dekolte sitelerinden en az 50 bp olduğundan emin olun.</li>
	<li>Amplicon daha küçük olduğundan emin olun 1,200 bp (tercihen daha iyi boyut çözünürlük için 600 bp daha küçük). Ayrıca, bir floresan boya ile astar birini etiket (örneğin, 6-karboksifluorescein (6-FAM)) algılama için 5'-ucunda. RUNX1 susturucu silme 18'in taranması için kullanılan astarlar Şekil1'de gösterilmiştir.</li>
</ol>3. Cas9/gRNA RNP Komplekslerinin Hazırlanması
<ol><li>CRRNA'ları ve tracrRNA'yı 1x TE tamponunda (10 mM Tris, 0.1 m EDTA, pH 7.5) 200 μM'lik son konsantrasyona geri alın.</li>
	<li>Her crRNA için, 200 μM crRNA'nın 2,2 μL'sini, 200 μM tracrRNA'nın 2,2 μL'sini ve 0,2 mL'lik bir tüpte 5,6 μL'lik 1x TE tamponu (toplam 10°L) karışımı 44 μM'lik son dubleks konsantrasyonu elde edin.</li>
	<li>95 °C'de 5 dk'lık bir termocycler inküteratın. Tüplerin gRNA kompleksi oluşumu için oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Seyreltik 10.4 μL 62 μM rekombinant Cas9 nükleaz ile 7.6 μL 1x fosfat-tamponlu salin (PBS) ile son nükleaz konsantrasyonu elde etmek için 36 μM. NOT: Bu miktar iki Cas9/gRNA kompleksinin hazırlanması için yeterlidir.</li>
	<li>3.3 adımdan elde edilen gRNA dublekslerinin her biriyle seyreltilmiş çekirdeğin eşit hacimlerini (8,5 μL) karıştırın.</li>
	<li>RNP karmaşık oluşumunu sağlamak için 20 dk oda sıcaklığında kuluçka. Elektroporasyon kadar buz üzerinde karışımları tutun.</li>
</ol>4. RNP Komplekslerinin OCI-AML3 Hücrelerine Elektroporasyonu
<ol><li>RPMI 1640 orta kültür OCI-AML3 hücreleri ile takviye 10% ısı-inaktive fetal sığır serum (FBS), 1x GlutaMAX, 100 adet / mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin (bundan sonra tam RPMI 1640 orta olarak anılacaktır) ile 37 ° CO2.</li>
	<li>Trypan mavi boyama kullanarak hücreleri sayın. Elektroporasyon sırasında hücre canlılığının %90'ın üzerinde olduğundan emin olun.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dk 500 x g'da 1,5 mL'lik bir tüpte 2,5 x 106 hücre. Supernatant çıkarın ve 1 x PBS 1 mL ile hücreleri yıkayın. Hücreleri tekrar aşağı çevirin ve kalan tüm supernatant kaldırın.</li>
	<li>163 μL RPMI 1640 orta fenol kırmızısı olmadan hücreleri yeniden askıya alın.  Hücrelere her RNP kompleksinden (adım 3.6'dan) 16.7 μL ve 100 μM Elektroporasyon Arttırıcı'dan 3.6 l ekleyin (toplam hacim = 200°L). Pipetleme yaparak hafifçe karıştırın. NOT: Elektroporasyon Arttırıcı düzenleme verimliliğini artırmak için bir taşıyıcı DNA'dır.</li>
	<li>Karışımı herhangi bir kabarcık olmadan 0,2 cm boşluklu elektroporasyon cuvette aktarın. Elektroporasyon sistemi (Mod: üstel; Gerilim =: 150 V; Kapasitans = 700 μF; Direnç = 50 Ω).</li>
	<li>Hücreleri 6 mL tam RPMI 1640 orta ve inkübat içeren bir T-25 doku kültürü şişesine aktarın ve %5 CO2ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>5. Biallelik Deletonlu Hücre Klonlarının Taranması ve Seçimi
<ol><li>Hücreleri 5 x 103/mL'ye kadar seyreltin ve elektroporasyondan bir gün sonra komple RPMI 1640 ortamına yerleştirin. 96-iyi doku kültür plakaları her kuyuiçine seyreltilmiş hücre süspansiyon 100 μL ekleyin ve hücrelerin 7-14 gün boyunca büyümeye izin.</li>
	<li>Yüksek iş lenme li bir arıtma sistemi kullanarak hücrelerden genomik DNA ayıklayın.</li>
	<li>96 kuyulu bir ekstraksiyon plakasının her kuyusu için 100 μL plaka bağlama ve lisis tamponu ekleyin. Tampona 10 μL 1x PBS'de 5 x 104 hücre nin yeniden asılı hale getirin ve pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>Genomik DNA'nın kuyulara bağlanmasını sağlamak için 30 dk oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuyu yüzeylerini kazımadan kuyulardan çözeltiyi aspire edin. Kuyuları 120°L yıkama tamponu ile yıkayın.</li>
	<li>Bağlı DNA içeren kuyuları hava kurutun.</li>
	<li>20 μL PCR karışımı (2 μL 10x Yüksek Fidelity tampon, 0.8 μL 50 mM MgSO4, 0.4 μL 10 mM dNTPs, 0.4 μL 10 μM FAM etiketli ileri astar (adım 2.2), 0.4 μL 10 μL etiketsiz ters astar ve 0.4 UUTas her polimer numunesi için hazırlayın. NOT: Her numunede standartlaştırılmış reaktif miktarlarının eklenmesini sağlamak için bir ana karışım hazırlayın.</li>
	<li>PcR karışımını çıkarma plakasının her kuyuya ekleyin ve reaksiyonları bir termocycler içinde çalıştırın (Koşullar: 2 dk için ilk 94 °C, ardından 15 s için 94 °C 35 döngü, 30 s s ve 68 °C 1 dk için 68 °C).</li>
	<li>Florometre kullanarak seçilen sayıda numunedeki konsantrasyonlarını ölçerek ürünlerin miktarını tahmin edin. Tüm numuneleri nükleaz içermeyen H2O ile 0,5 ng/μL arasında seyreltin.</li>
	<li>Seyreltilmiş PCR ürünlerinin 1 μL'sini 8,5 l deiyonize formamid ve 0,5 l floresan boya etiketli boyut standardını genetik analizörle uyumlu 96 kuyuluk bir plakada karıştırın. NOT: Deiyonize formamid ve boyut standardı içeren bir ana karışım hazırlayın.</li>
	<li>Plakayı bir plaka septa ile kaplayın ve numuneleri 95 °C'de 3 dk'lık bir termocycler dedena. Makinenin kapağını kapatmayın.</li>
	<li>Daha önce açıklandığı gibi etiketli PCR ürünleri ayırmak için kılcal jel elektroforezi gerçekleştirin32.</li>
	<li>Elektroforezden sonra sonuçları analiz etmek için analiz yazılımını açın.</li>
	<li>Yeni Proje'yi tıklatın ve Microsatellite'useçin. Sonra Tamam'ı tıklatın.</li>
	<li>Projeye Örnek Ekle'yi tıklatın ve sonuç dosyalarını seçin (.fsa uzantısını içerir). Ardından dosyaları almak için listeye Ekle'yi tıklatın.</li>
	<li>Seçili sonuç dosyalarını gösteren tabloda, Çözümleme Yöntemi sütununda Microsatellite Default'ı seçin. Ayrıca, Boyut Standart sütununda kullanılan boyut standardını seçin. Ardından Analiz simgesine tıklayın, deneme adını girin ve denemeyi kaydedin.</li>
	<li>Sonuçları görüntülemek için Çizimleri Görüntüle'yi tıklatın ve çizim ayarında Parça Çözümlemesi'ni seçin. </li>
	<li>Analiz için uygun renkli kanalları seçin. Arama nın kalitesini değerlendirmek için boyut standardında etiketlenmiş parçaları görüntülemek için turuncu simgeyi işaretleyin.</li>
	<li>Etiketli PCR ürünlerini görüntülemek için mavi simgeyi işaretleyin. Yabani tip ve mutant (yani beklenen silmeleri taşıyan) ürünlere karşılık gelen zirveleri tanımlayın. Her örnekteki mutant seviyesini, mutant tepenin altındaki alanı vahşi tip ve mutant zirvelerin altındaki alanın toplamına bölerek tahmin edin.</li>
	<li>Daha fazla seri seyreltme için beklenen silme yüksek düzeyde birden fazla hücre havuzları seçin.</li>
	<li>DNA ekstraksiyonu, floresan PCR ve kapiller elektroforez adımlarını tekrarlayın. Sonraki analizler için biallelik silmeleri temsil eden mutant düzeyleri >%95 olan hücre klonlarını seçin.</li>
	<li>Sanger sıralama ile seçili klonlar daki silmelerin kimliğini doğrulayın.</li>
</ol>6. Gerçek Zamanlı Kantitatif RT-PCR Analizi ile Susturucu Deleasyonunun Fonksiyonel Analizleri
<ol><li>Seçilen klonlardan toplam RNA ayıklayın ve tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezini gerçekleştirin.</li>
	<li>1 μG RNA ile 1 μL 50 μM oligo(dT)20 astar ve 1 00 mM dNTP karışımını toplam 10 μL'lik bir hacimde karıştırın. 65 °C'de 5 dakika boyunca inkübün ve en az 1 dakika buz üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>2 μL 10x RT tampon, 4 μL 25 mM MgCl2, 0,1 M DTT 2 0,1 M DTT, 1 μL RNase inhibitörü (40 U/μL) ve 1 μL ters transkriptaz (200 U/μL) içeren 10 μL cDNA sentez karışımı ekleyin. 50 °C'de 50 dk, termocycler'da 5 dk için 85 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: Ters transkripsiyon için bir ana karışımı hazırlayın.</li>
	<li>Örnekleri buzda soğutun. 1 μL RNase H ekleyin ve 20 dk için 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Özellikle alternatif organizatörlerden oluşturulan bireysel transkript türevlerini tanıyan tasarım astarları ve TaqMan probları. NOT: Önceden tasarlanmış transkriptözel astar/prob setleri ticari olarak mevcuttur.</li>
	<li>Plazmid DNA'sına belirli transkript dizilerini içeren klon DNA parçaları. Transkript niceleme için standart eğriler olarak rekombinant plazmidlerin 10 kat seyreltme serisini (106 ila 10 kopya) hazırlayın.</li>
	<li>Her numune için 20 μL PCR karışımı (0,5 μL DNA şablonu, 1 μL 20x önceden tasarlanmış TaqMan prob/astar testi ve 10 μL 2x TaqMan PCR Master Mix) hazırlayın (hem cDNA hem de plazmid standartları). Her örneği ölçün. NOT: Gerçek zamanlı PCR için bir ana karışım hazırlayın.</li>
	<li>Reaksiyonları gerçek zamanlı bir PCR makinesinde çalıştırın (Koşullar: 2 dk için ilk 50 °C ve 10 dakika için 95 °C, ardından 15 s s ve 60 °C için 1 dk için 94 °C 40 döngüler).</li>
	<li>Amplifikasyondan sonra, verileri analiz etmek için yazılımdaki Analiz simgesini tıklatın. Reaksiyonların verimliliğini ve doğrusallığını değerlendirmek için standart eğrilerin eğimini ve korelasyon katsayısını kontrol edin. Eğimlerin -3,1 ile -3,6 arasında ve korelasyon katsayılarının 0,99'dan büyük olduğundan emin olun.</li>
	<li>Her örnekteki hedef transkriptlerin kopya numarasını bir temizlik geni (örneğin GAPDH)ile normalleştirin.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

CRISPR/Cas9 sistemi gen nakavt ve knock-in çalışmaları 35,36, transkripsiyonel düzenleme37,38, çeşitli genetik mühendisliği gibi genom düzenleme uygulamaları geniş bir yelpazede kullanılmıştır model organizmalar39,40,41,42,43,44 ve gen tedavisi45,46. Burada, RUNX1 geniüzerinde bir intronic susturucu silmenin işlevsel sonuçlarını araştırmak için CRISPR/Cas9 kullanımını gösteriyoruz. Yaklaşımımızda CRISPR bileşenlerinin teslimi plazmid DNA'sına, gRNA veya virüs klonlamaya değil, önceden monte edilmiş Cas9/gRNA RNP komplekslerinin elektroporasyonuna dayanmadı. Bu eksojen DNA kullanımı konak genomiçine yabancı vektör dizilerinin istenmeyen entegrasyonu ile ilişkili olabileceği gösterilmiştir, artan toksisite ve düşük verimlilik25,47,48, oysa virüs transdüksiyon yöntemleri zaman alıcıdır. Buna ek olarak, plazmid DNA'dan Cas9 uzun süreli ifade off-hedef etkileri artırabilirsiniz48. Tam tersine, geliştirilmiş düzenleme verimliliği, seçicilik ve hücre canlılığı ile hızlı ve basit olduğu için doğrudan RNP tabanlı teslimat yaklaşımı tercih edilen yöntem olarak oluşturulmuştur. Gerçekten de, lipofection49,50, elektroporasyon25,51, nano tanecikleri52, hücre penetran peptidler53, iTOP54 ve TRIAMF gibi yöntemlerçeşitli 55 çeşitli hücre tipleri yanı sıra hayvan ve bitki türleri24,25,26,56,57 içine verimli CRISPR / Cas9 teslim için geliştirilmiştir , 58.000 , 59,59 , 60,60 , 61.000 , 62.000 , 63. Kodlamayan DNA dizileri genetik varyasyonların etkin noktaları olduğundan64, hedefte ve komşu PAM dizilerinde ortak SNP/indellerin varlığını kontrol etmek, düzenleyici mevzuatı hedefleyen gRNA tasarlanırken özellikle önemlidir Öğe.
CRISPR/Cas9 genom düzenlemesindeki bir darboğaz, çok sayıda numunede istenilen mutant klonların tarandırılmasıdır. Hedef mutasyon yaklaşık 300 bp'lik küçük bir genomik deletion olduğu için tarama için floresan PCR ile birlikte kılcal jel elektroforezi kullanıldı. Bu yöntem hızlı ve duyarlıdır ve yüksek iş elde edilebilir bir şekilde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, bu yöntem aynı anda mutant düzeyleri ve silme boyutları doğru tahmin sağlar. Buna ek olarak, farklı floresan boyalarla etiketlenmiş PCR parçalarının çok katlı analizi desteklenir. Biz rutin miyeloid neoplazmlar65,66küçük eklemeler / silme genotip için bu tekniği kullanarak edilmiştir. Deneyimlerimize göre, yüksek hassasiyetve mutant yükü %3'e kadar olan 4 bp'ye kadar fark edilen parça boyutlarını sürekli olarak tespit edebiliriz. Ancak, bu yöntemin parça boyutu sınırı nın 1.200 bp olduğu ve bu nedenle büyük silmelerin taranması için uygun olmadığı unutulmamalıdır. Ayrıca, baz ikameleri (değişmeyen parça boyutuyla sonuçlanan) ve diğer genomik bölgelerdeki potansiyel hedef dışı olaylar tespit edilemez. İkincisi için, pahalı tüm genom sıralaması kapsamlı hedef klonlar küresel istenmeyen değişiklikleri profilini gereklidir. Kodlamayan büyük düzenleyici dizilerin (>1.000 bp) araştırılması için mevcut yaklaşımımızı benimsemek için, in vitro muhabir gen tahlilleri kullanılarak putatif transkripsiyon faktörü bağlama sitelerinin ayrıntılı bir deletion ve mutagenez analizleri yapılabilir CRISPR/Cas9 düzenleme18için minimal fonksiyonel bölge sini önceden kalibre etmek.
Birçok gen birden fazla organizatör3,4içerdiğinden, düzenleyici unsurları manipüle etmek organizatörleri farklı yönde etkileyebileceğinden, hedef gen lokusundaki alternatif organizatörlerin varlığının farkında olmak önemlidir. Bu nedenle, farklı organizatörlerden türetilen transkript türevleri, herhangi bir organizatöre özgü yanıtları değerlendirmek için ayrı ayrı ölçülebilir. TaqMan prob tabanlı tahlillerin kullanımı daha iyi özgüllük ve tekrarlanabilirlik nedeniyle SYBR Green'e tercih edilir. Daha gelişmiş dijital PCR sistemi varsa, transkript nicelleştirme standart eğri yapısına ihtiyaç duymadan daha hassas bir şekilde gerçekleştirilebilir.
Kanser hücre hatlarında CRISPR/Cas9 deneylerinin gerçekleştirilmesinde göz önünde bulundurulması gereken önemli bir husus, hemen hemen tüm kanser hücre hatlarıyapısal ve kopya numarası varyasyonları da dahil olmak üzere genetik değişiklikler barındıran hücrelerdeki ploidi ve hedef gen kopya numarasıdır. Bizim olgumuzda OCI-AML3'te 45-50 kromozomlu hiperdiploid karyotip vardır. Ayrıca, hücre hattı kanser hücresi hattı Ansiklopedisi67 ve floresan yerinde hibridizasyon çalışmaları18ortaya normal bir RUNX1 kopya numarası taşımak bulundu . Kopya numarası kazanımı olan bir geni hedefalırken, düzenleme için CRISPR bileşenlerinin yeterli düzeyde olmasını sağlamak için dağıtım yönteminin optimize edilmesi gerekebilir. Ayrıca, daha fazla klonların tam nakavt tanımlamak için taranması gerekebilir. Daha da önemlisi, güçlendirilmiş genomik bölgeleri hedeflemenin, özellikle yapısal yeniden düzenlemelerin neden olduğu bölgeleri hedeflemenin, kanser hücrelerinde gen-bağımsız antiproliferatif yanıtları tetiklediği ve gende yanlış pozitif sonuçlara yol açtığı gösterilmiştir. fonksiyonel çalışmalar68,69,70. Bu bağlamda CRISPR bulgularını doğrulamak için RNA girişim (RNAi) nakavt ve/veya cDNA aşırı ekspresyonu gibi alternatif yaklaşımlar kullanılmalıdır. Ayrıca, hücre çizgisine özgü ancak genden bağımsız CRISPR düzenleme efektlerinin yanlış yorumlanmasını önlemek için birden fazla hücre hattı kullanılmalıdır.
CRISPR/Cas9 sistemi, genom düzenlemesi için basit ve verimli bir araç sağlayarak temel ve çevirisel araştırmalarda devrim yarattı. Burada bir kanser hücresi hattında transkripsiyonel çalışmalar için bir intronic susturucu bozmak için CRISPR / Cas9 kullanmanın kolaylığını göstermektedir. Bu teknik, CRE'lerin DNA düzeyinde incelenmesine olanak sağlar ve geleneksel heterolog muhabir genleri yerine ENdojen bağlamda CRE fonksiyonlarını inceleme fırsatı sunar. Son zamanlarda, CRISPR tabanlı Bir RNA düzenleme sistemi de tespit edilmiştir71 ve düzenleyici unsurlardan transkripsiyonu RNA hedefleyerek CREs çalışmak için yeni bir araç olarak hizmet verebilir. Kromozom konformasyon yakalama teknikleri ile birleştirerek, CRISPR/Cas9, çeşitli sağlık sorunlarıyla bağlantılı değiştirilmiş genom organizasyonu ve gen ekspresyonundaki CRE'lerin rollerinin deşifre edilmesine kesinlikle yardımcı olacaktır.

Cis-düzenleyici unsurlar (CREs) gen ekspresyonukontroletmek için transkripsiyonal düzenleyiciler için bağlayıcı siteleri içeren olmayan DNA dizileri vardır1 ,2. Bu öğeler genellikle 100 ila 1.000 baz çifti (bp) uzunluğundadır. Organizatörler ve arttırıcılar CREs iki en karakterize türleridir. Organizatörler transkripsiyon başlangıç sitelerine yakın olarak bulunurlar ve transkripsiyonun temel birimini oluştururlar. Birçok genbirden fazla organizatörü var ve alternatif kullanım transkriptom çeşitliliği ve doku özgüllüğükatkıda 3,4. Öte yandan, arttırıcılar transkripsiyon etkinleştirmek ve yukarı, aşağı veya hedef genlerin introns içinde bulunabilir. Arttırıcılar uzak mesafeden hareket edebilir (bir megabaz üzerinden) ve oryantasyon bağımsız1,2. CREs da susturucular ve yalıtkanlar5,6içerir. Eski transkripsiyonel repressors bağlanarak gen ekspresyonunu inhibe etmek için karşıt hareket, ikinci bölümler komşu etki diğer CREs genleri izole etmek için ayrık topolojik etki içine genom bölümleri ise. Bu unsurlar kısa ve/veya uzun menzilli kromatin etkileşimleri yoluyla birbirleriyle uyum içinde hareket eder ve uygun spatiotemporal gen ekspresyonunu yönlendirmek için düzenleyici merkezler halinde düzenlenir. Yüksek iş sahibi sıralama tekniklerinde son gelişmeler, soya özgü geni dikte eden transkripsiyonel ağları anlamamızı büyük ölçüde kolaylaştıran birçok CR'nin tanımlanmasını ve işlevsel ekaçıklamalarını hızlandırdı. farklı hücre ve doku tiplerinde ifade7,8,9,10,11,12.
Kri'lerin transkripsiyonun düzenlenmesindeki temel rolleri göz önüne alındığında, bunların değişimleri anormal gen ekspresyonuna yol açabilir. Bu CREs sık sık insan kanserlerinin farklı türde genetik ve epigenetik değişiklikler tarafından bozulmuş olduğu gösterilmiştir, bu nedenle tümör inisiyasyonu katkıda, ilerleme ve saldırganlık13,14. Buna ek olarak, CRE bağlayıcı faktörler genellikle mutasyona uğramış ve / veya çeşitli kanser türlerinde yanlış ifade, daha fazla oncogenesis CRE deregülasyon önemini vurgulayarak15. CREs da yapısal sapmalar etkilenebilir, immünglobulin ağır sık kromozomal rearrangements tarafından örneklenen (IgH) gen arttırıcı B-hücreli lenfomalarda komşu onkogenlerin anormal aktivasyonu ile sonuçlanan16. Akut miyeloid lösemide (AML), kromozom 3q rearanjör tarafından tek bir arttırıcının yeniden konumlandırılması, arttırıcı fonksiyonların BET inhibisyonu ile potansiyel olarak hedeflenebilecek eşlik eden GATA2 downregülasyonu ve EVI1 aktivasyonuna neden olur. 17- Son zamanlarda, biz bir pediatrik hastada AML ilerlemesine katkıda bulunabilecek bir RUNX1 intronic susturucu pertürbasyonu içeren yeni bir kromozomtranslokasyonu karakterize18. Böylece, kodlamayan kanser genomunu deşifre etmek, hastalık patogenezi, biyomarker keşfi ve terapötik müdahalelerin aydınlatılamaması için verimli yollar sağlar ve bu da sonuçta hasta sonuçlarını iyileştirir.
CRISPR/Cas9 nükleaz yolu, başlangıçta prokaryotik hücrelerde adaptif bir bağışıklık sistemi olarak tanımlanan, canlı hücrelerde ve organizmalarda siteye özgü genomik düzenleme için hızlı ve uygun maliyetli bir araç olarak kullanılmıştır19,20 ,21,22. CRISPR/Cas9 sistemi iki ana bileşenden oluşur: gRNA ve Streptococcuspyogenes-türetilmiş Cas9 nükleaz. GRNA, hedef bölgeyi tanıyan ve düzenleme için Cas9'u yönlendiren protospacer adı verilen belirli bir dizi içerir. GRNA iki bölümden oluşur: CRISPR RNA (crRNA), genellikle hedef DNA'nın tamamlayıcısı 20-mer nükleotit dizisi ve nükleaz için bağlayıcı bir iskele görevi gören trans-aktive edici crRNA (tracrRNA). Cas9 dekoltesi için hedef bölgeye hemen bitişik bir protospacer bitişik motifi (PAM) (5'-NGG) gereklidir ve dekolte bölgesi PAM'in 3 nükleotitinin yukarısında yer alır. CRISPR/Cas9 aracılı gen düzenlemesi genellikle transfecting hücreleri tarafından gerçekleştirilir Cas9 ve klonlanmış gRNA23kodlayan bir plazmid ile . Ancak, bu yaklaşım hematopoetik hücreler için zordur, hangi genellikle transfect zordur ve uzun virüs tabanlı transdüksiyon yöntemleri gerektirir. Alternatif bir yaklaşım önceden monte Cas9/gRNA RNP kompleksleri doğrudan hücresel teslim24. RNP iletimi için ortak bir yöntem elektroporasyon, hücre zarında geçici gözenekleri oluşturur, böylece hücrelere RNP komplekslerinin girişini sağlayan25,26. Bu yaklaşımın avantajları arasında kullanım kolaylığı, hedef dışı etkilerin azaltılması ve RNP komplekslerinin kararlılığı yer almaktadır. Burada, Bir AML hastasının periferik kanından kurulan OCI-AML3 lösemi hücre hattı 18'deki RUNX1 intronic susturucunun transkripsiyonel rolünü araştırmak için RNP dağıtım yöntemini kullanma protokolünü tanımlıyoruz. Fransız-Amerikan-İngiliz M4 alt tip27tanısı . Protokol, crRNA tasarımı, RNP komplekslerinin hazırlanması, elektroporasyon, istenilen klonların taranması ve sonraki karakterizasyonu içerir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">0.2 cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652086</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1&#215;TE buffer, pH7.5</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">10mM dNTP mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18427013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">3500 Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4405673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">7300 System SDS Software</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td>Version 1.3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Bio-Rad Gene Pulser Xcell system</td>
			<td style="width:208px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:176px;">1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">CS11205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-1</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">crRNA-2</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Electroporation Enhancer</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">10270098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fluorometer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneMapper Software 5</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4475073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GeneScan 600 LIZ Size Standard</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4408399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PBS, 10X Solution, pH7.4</td>
			<td style="width:208px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:176px;">75889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11304029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1081058</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640 medium without phenol red</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">11835030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1a TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs04186042_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1b/c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs00231079_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RUNX1c TaqMan gene expression assays</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4331182</td>
			<td>Hs01021966_m1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:176px;">1072533</td>
			<td>Components of the Cas9/gRNA complex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TRIzol Reagent</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Unlabeled PCR reverse primer</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">None</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of the transcriptional role of a runx1 intronic silencer by crispr/cas9 ribonucleoprotein in acute myeloid leukemia cells

İnsan genomunun büyük bir kısmı (%~98) kodlamayan dizilerden oluşur. Cis-düzenleyici elementler (CREs) gen ekspresyonunu modüle etmek için transkripsiyondüzenleyiciler için bağlayıcı siteler içeren kodlamayan DNA dizileridir. CRE'lerde değişiklikler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklara karışmıştır. Organizatörler ve arttırıcılar gen regülasyonu nun incelenmesinde birincil KR'ler olmakla birlikte, gen baskısına aracılık eden başka bir CRE türü olan susturucunun rolü hakkında çok az şey bilinmektedir. Başlangıçta prokaryotlarda adaptif bağışıklık sistemi olarak tanımlanan CRISPR/Cas9 ökaryotik genom düzenleme için güçlü bir araç olarak kullanılmıştır. Burada, insan RUNX1 genindeki bir intronic susturucuyu silmek ve OCI-AML3 lökemik hücrelerde gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için bu tekniğin kullanımını sıyoruz. Yaklaşımımız, susturucuyu çevreleyen iki çift iplikli mola (DSB) oluşturmak için iki adet önceden monte edilmiş Cas9/guide RNA (gRNA) ribonükleoprotein (RNP) kompleksinin elektroporasyon aracılı teslimatına dayanır. Silmeler parça analizi ile kolayca taranabilir. Alternatif organizatörlerden aktarılan farklı mRNA'ların ekspresyon analizleri, organizatöre bağlı etkilerin değerlendirilmesini yardımcı olur. Bu strateji diğer CRE'leri incelemek için kullanılabilir ve özellikle plazmid tabanlı yöntemlerle transfect zor hematopoetik hücreler için uygundur. Plazmid ve virüssüz bir stratejinin kullanılması, gen düzenleyici fonksiyonların basit ve hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.

Bu deneyin amacı RUNX1 genindeki bir intronic susturucuyu silmek ve OCI-AML3 hücrelerindeki RUNX1 transkripsiyonunun etkilerini incelemektir. Susturucu bir kombinatoryal moleküler yaklaşım ile tespit edildi ve bir209 bp çekirdek elemanı 18 içerdiği bulundu. RUNX1 ekspresyonunu kontrol etmede bu temel elemanın daha doğru değerlendirilmesi için crRNA(crRNA-1 ve crRNA-2) bu bölgeye yakın hedef olacak şekilde tasarlanmıştır18 (Şekil1). CrRNA-1 ve crRNA-2 tarafından getirilen öngörülen Cas9 dekolte sit leri sırasıyla çekirdek elemandan 29 bp ve 35 bp idi (Şekil 1). Unutulmamalıdır ki, iki crRNA'nın PAM siteleri zıt iplikçiklerde yaşarken, DSB'ler PAM sıra konumundan bağımsız olarak oluşacaktır. Böylece crRNA-1 ve crRNA-2 rehberliğinde iki Cas9/gRNA RNP kompleksinin birlikte piyasaya sürülmesinin RUNX1 locusundaki susturucu elemanını çıkarması beklenmektedir.
Çok sayıda numunede istenilen silmeleri taramak için yüksek iş lenme saflaştırma için 96 kuyuluk genomik DNA çıkarma kiti kullanılmıştır. Ayrıca, ekstraksiyon plakalarının kuyularına bağlı DNA doğrudan amplifikasyona maruz kalarak tekrarlanan numune transferi nedeniyle hataları veya kontaminasyonu en aza indirir. Silme lerin taranması için kullanılan astarlar18 Şekil1'de gösterilmiştir. Yabani tip PCR ürün beklenen boyutu yaklaşık 500 bp. Amaçlanan silme 273 bp'ye yaydığı için mutant ürünün yaklaşık 230 bp olması beklenmektedir. Bu boyut aralığı kılcal jel elektroforez ile basit ve hızlı parça analizi sağlar. Toplam 160 ilk hücre havuzu tarandı ve 14 mutant düzeyleri en az% 70 ile beklenen silme taşımak için bulundu. Daha sonra biallelik silme ler taşıyan klonları tanımlamak için daha fazla seri seyreltme için beş havuz seçildi. Farklı mutant ürünleri olan hücre klonlarından gelen temsili elektropogramlar Şekil 2A'da gösterilmiştir. Silmelerin kimliği Sanger dizilimi ile doğrulandı (Şekil 2B). Beklendiği gibi, delesyon klonlarında öngörülen dekolte alanlarında DSB 33'ün homolog olmayan son birleştirme onarımı ile oluşan indeller gözlendi. Bunlar, kılcal elektroforez (Şekil2A) ile de tespit edilebilen farklı boyutlardaki mutant ürünlerin amplifikasyonuile sonuçlanmıştır .
RUNX1 geni iki promotörler yani distal P1 ve proksimal P2 içerir, susturucu elemanı barındıran büyük bir intron ile ayrılır34. Üç büyük mRNA transkript bu organizatörler tarafından üretilmektedir: P1 ve RUNX1a ve RUNX1b P234tarafından RUNX1c . RUNX1c ve RUNX1b nükleotit dizisi, eskisinin benzersiz bir N-terminusu olması dışında aynıdır, belirli bir TaqMan gen ekspresyonu testi tasarlanabilir (Şekil3A). RUNX1bölçmek için, hem RUNX1b hem de RUNX1c'yi tanıyan bir TaqMan tonu kullanılmıştır (Şekil 3A). RUNX1b düzeyleri daha sonra RUNX1ctoplam RUNX1b/RUNX1c çıkarArak belirlendi. RUNX1a alternatif birleştirme nedeniyle belirgin derecede kısa bir isoformdur ve bu varyant için belirli bir TaqMan tözkullanılabilir (Şekil3A). Böylece, P1 ve P2 organizatörlerin in aktivitesi ayrı ayrı belirlenebilir. Gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR, susturucu elemanının silinmesinin hem P1 hem de P2 türetilmiş transkriptlerin ifade düzeylerini önemli ölçüde yükseltdiğini göstermiştir (Şekil3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig1.jpg"> Şekil 1 : RUNX1 intronic susturucuyu silme stratejisi. Susturucu (kırmızı kutu) iki promotörlerP1 ve P2 ayıran RUNX1 geninin ilk intron bulunur (hg19 koordinatları gösterilir). İki crRNA (crRNA-1 ve crRNA-2) susturucu elemanını çevreleyen DSB'leri tanıtmak için tasarlanmıştır. Öngörülen Cas9 dekolte siteleri dikey kırmızı çizgilerle gösterilir ve PAM siteleri (NGG) mor renktedir. Silmelerin taranması için kullanılan iki astar açık oklarla temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig2.jpg"> Şekil 2 : Silme klonlarının tanımlanması. (A) Mutant PCR ürünlerinin (MUT) farklı düzeylerde gösteren hücre klonları temsilcisi elektropherogramlar. Mutant ürünlerin boyutu dekolte sitelerinde oluşan indels nedeniyle klonlar arasında değişir. WT = vahşi tip. (B) Sanger sıralama ile temsili klonlardan silme lerin doğrulanması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60130/60130fig3.jpg"> Şekil 3 : Susturucu silmenin işlevsel sonuçları. (A) Üç büyük RUNX1 isoforms (RUNX1a, RUNX1b ve RUNX1c) gösterilir. Bu varyantlar aynı Runt DNA bağlayıcı etki alanı ama farklı N- (turuncu) veya C-terminus (mavi) içerir. TaqMan sondası/astar çiftlerinin yeri kırmızı çizgilerle gösterilir. Sayılar amino asit kalıntılarını gösteriyor. (B) (DEL) veya (WT) biallelic deletions18ile hücre popülasyonlarında RUNX1 P1 ve P2 kaynaklı transkriptgerçek zamanlı kantitatif RT-PCR analizi . GAPDH normalleştirme için kullanıldı. * ve **, Mann-Whitney testiile sırasıyla P < 0,05 ve P < 0,01'i gösterir. Bu rakam Cheng ve ark.18'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60130/60130fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells at JoVE.com

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Önceden monte edilmiş Cas9/guide RNA ribonükleoprotein komplekslerinin doğrudan teslimi hematopoetik hücrelerde genom düzenleme için hızlı ve etkili bir araçtır. Burada, bir RUNX1 intronic susturucu silmek ve OCI-AML3 lökemik hücrelerde transkripsiyonel yanıtları incelemek için bu yaklaşımı kullanır.

Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Ribonükleoprotein ile RUNX1 Intronic Susturucunun Transkripsiyonel Rolünün İncelendirin

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Organizatörler ve arttırıcılar gibi Cis-düzenleyici unsurlar gen ekspresyonunun temel belirleyicileridir. Bu unsurları incelemek için geleneksel yaklaşımlar zahmetli ve genellikle heterolog muhabir genlerin kullanımını içerir. Burada lösemi hücre hattında bir RUNX1 intronic susturucu transkripsiyonel rolünü incelemek için CRISPR kullanımını göstermektedir.Protokolün gerçekleştirilen süreceği ve endojen gen kapsamında gen düşürülmelerinin hızla değerlendirileceğine olanak sağlıyor. Hematopoetik hücreler genellikle plazmid bazlı yöntemlerle transfect zordur. Bu protokolde, elektroporasyonu önceden monte edilmiş Cas9'u, kılavuz RNA'yı hücrelere karmaşıklık ları sağlamak için kullanıyoruz.Bu yaklaşımın avantajları arasında gelişmiş düzenleme verimliliği ve hücre canlılığının yanı sıra hedef dışı etkilerin azaltılması yer almaktadır. Ayrıca, parça analizi nin sonraki kullanımı, istenilen mutant klonların çok miktarda numuneden basit ve hızlı bir şekilde taranmasını sağlar. Prosedürü gösteren Yuk-Lin Yung, laboratuvarımiçin teknisyen olacak.İki CRISPR RNA, bir beş asal ve hedef cis-düzenleyici unsur veya CRE diğer üç asal tasarlayarak başlayın. Cas9 tanıma için hedef sıranın hemen aşağısında ngg pam'in bulunduğundan emin olun. gRNA kompleksini oluşturmak için, 44 mikromolar son dubleks konsantrasyonu için, el yazması yönlere göre TE tampon crispr RNA ve tracer RNA birleştirin.Karışımı 95 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. 36 mikromolar son nükleaz konsantrasyonu için PBS ile rekombinant Cas9 nükleaz seyreltin. Daha sonra seyreltilmiş çekirdeğin eşit hacmini gRNA dublekslerinin her biriyle karıştırın ve RNP kompleksinin oluşmasını sağlamak için oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.Santrifüj 2.5 milyon hücre 1.5 mililitrelik bir tüp beş dakika için 500 kez g. Daha sonra supernatant atın ve fenol kırmızı olmadan RPMI 1640 orta 163 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. RNP kompleksinin 16,7 mikrolitresini ve hücrelere 100 mikromolar elektroporasyon arttırıcısının 3,6 mikrolitresini ekleyin ve karışımı 0,2 santimetrelik bir elektroporasyon kütüğüne aktarın, herhangi bir kabarcık sokmamaya özen takın.Hücreleri elektroporate ve tam RPMI 1640 orta 6 mililitre içeren bir T-25 doku kültürü şişesi ne aktarın. Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Elektroporasyondan bir gün sonra, hücreleri mililitre başına 5000 hücreye seyreltin tam RPMI 1640 orta.Ve 96 kuyulu doku kültürü plakasının her kuyunun içine 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Kültür hücreleri yedi ila 14 gün sonra yüksek iş lenme arıtma sistemi kullanarak genomik DNA ayıklamak. 96 kuyulu ekstraksiyon plakasının her kuyusuna 100 mikrolitre plaka bağlama ve lisis tamponu ekleyin ve ardından 10 mikrolitre PBS'de 50.000 hücre yeniden askıya alınır.Yukarı ve aşağı borulama tarafından kuyu içeriğini karıştırın. Genomik DNA'nın kuyulara bağlanmasıiçin tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra kuyulardan çözeltiyi dikkatlice aspire edin ve 120 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın.Hava plakayı kurutun. Her kuyuya 20 mikrolitre PCR karışımı ekleyin ve el yazması talimatlara göre PCR çalıştırın. Amplifikasyon tamamlandıktan sonra, seçilen sayıda numunenin bir florometre ile konsantrasyonunu ölçerek ürünün miktarını tahmin edin.Tüm numuneleri mikrolitre başına 0,5 nanograma çekirdeksiz su ile seyreltin. Seyreltilmiş PCR ürününün bir mikrolitresini 8,5 mikrolitre deiyonize formamid ve 0,5 mikrolitre floresan boya etiketli boyut standardı ile genetik analizörle uyumlu 96 kuyuluk bir plat ile karıştırın. Plakayı bir tabak septa ile kaplayın ve numuneleri bir termocycler'da üç dakika boyunca 95 derecede denatüre edin.Etiketli PCR ürünlerini ayırmak ve analiz yazılımındaki sonuçları analiz etmek için kılcal elektroforez gerçekleştirin. Etiketli parçaları ve boyut belirleme nin kalitesini değerlendirmek için boyut standardını görüntülemek için turuncu simgeyi işaretleyin. Ardından, etiketli PCR ürünlerini görüntülemek için mavi simgeyi işaretleyin.Yabani tip ve mutant ürünlere karşılık gelen zirveleri belirleyin ve her örnekteki mutant seviyesini, mutant tepenin altındaki alanı vahşi tip ve mutant zirvelerin altındaki alanın toplamına bölerek tahmin edin. Daha fazla seri seyreltme için beklenen silme yüksek düzeyde birden fazla hücre havuzları seçin. DNA ekstraksiyonu, floresan PCR ve kapiller elektroforez adımlarını tekrarlayın ve sonraki analizler için mutant seviyeleri %95'ten fazla olan klonları seçin.Seçilen klonlardan toplam RNA ayıklayın ve ücretsiz DNA sentezi yapın. RNA'yı el yazması yönlere göre bir poly-T astarı ve dNTP'lerle karıştırın ve 65 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra reaksiyonu en az bir dakika buzun üzerine yerleştirin.Reaksiyona 10 mikrolitre cDNA sentezi karışımı ekleyin. Daha sonra numuneyi 50 derecede 50 dakika, 85 santigrat derece de bir termocycler'da beş dakika kuluçkaya yatırın. CDNA sentezinden sonra, numuneleri bir mikrolitre RNase H ile tedavi edin ve 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.Tasarım astarları ve TaqMan probları özellikle alternatif organizatörlerden oluşturulan bireysel transkript varyansı için ve plazmid DNA içine belirli transkript dizilerini içeren DNA parçalarını klonlamak. Transkript niceleme için standart eğriler olarak rekombinant plazmidlerin on kat seyreltme serisini yapın. Her örnek için 20 mikrolitre PCR karışımı hazırlayın ve el yazması talimatlara göre gerçek zamanlı PCR çalıştırın.Sonuçları analiz edin ve her örnekteki hedef transkriptlerin kopya numarasını bir temizlik geni ile normalleştirin. Bu protokol RUNX1 intronic susturucuyu silmek için başarıyla kullanılmıştır ve deletion kılcal jel elektroforezi ile doğrulanmıştır. Yabani tip ve mutant PCR ürünlerinin beklenen boyutları sırasıyla yaklaşık 500 baz çifti ve 230 baz çifti vardır.Dekolte bölgelerinde oluşan indels nedeniyle mutant ürünlerin boyutu klonlar arasında değişebilir. Silmelerin kimliğini doğrulamak için sanger sıralaması kullanıldı. RUNX1 geni iki promotör içerir, P1 ve P2 üç büyük mRNA transkript üretti: P1 tarafından RUNX1c, ve RunX1a ve RUNX1b P2 tarafından. Susturucu öğesinin silinmesinin bu transkriptlerin ifadesini nasıl etkilediğini belirlemek için gerçek zamanlı nicel PCR kullanılabilir.CRISPR RNA'ların iyi bir tasarımı, deneyin değerlendirilmesi açısından önemlidir. CRSIPR RNA'nın amaçlanan silme bölgesine yakın şekilde paketlendiğinden emin olun. Ayrıca, Cas9 tanıma için hedef dizinin aşağısında bir PAM dizisinin bulunduğundan emin olun.CrE'leri incelemenin yanı sıra, bu strateji gen konum çalışmaları için kullanılabilir ve gen fonksiyonlarını incelemek için RNA girişimine alternatif olarak hizmet vermektedir. Kromozom konformasyon yakalama teknikleri ile birleştirerek CRISPR kesinlikle değiştirilmiş genom organizasyonu ve kanser gibi çeşitli sağlık sorunları ile bağlantılı gen ekspresyonu CREs tutulumlarını deşifre yardımcı olacaktır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...