Name: generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

وقد دعم هذا البحث من قبل العلماء AHA منحه التنمية 17SDG33700093 (F.S.); جائزه الباحثين في جبل سيناء KL2 للتطوير الوظيفي للبحوث السريرية والانتقالية KL2TR001435 (F.S.) ؛ المعاهد القومية للصحة R00 HL116645 و AHA 18TPA34170460 (سي كي).

أجريت التجارب باستخدام عضلي الفئران الكبار في هذه الدراسة مع المعتمدة المؤسسات الرعاية الحيوانية والاستخدام البروتوكولات (IACUC) من المدرسة Icahn للطب في جبل سيناء. عزلت ال [جرذ عضلي] بالغه كان من [سبرغ] [ددلي] جرذ قلوب بالأسلوب [لنغندوف] يؤسس بما ان سابقا يوصف16.
1-اعداد...

<ol>
	<li>Karakikes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+human+phospholamban+R14del+mutation+associated+with+cardiomyopathy+using+targeted+nucleases+and+combination+therapy.">Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy.</a> Nature Communications. 6, 6955 (2015).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+pluripotent+stem+cells+recapitulate+electrophysiological+characteristics+of+an+overlap+syndrome+of+cardiac+sodium+channel+disease.">Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease.</a> Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+ryanodine+receptor+2+dysfunction+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+generated+from+CPVTD307H+patients+are+arrhythmogenic+in+response+to+beta-adrenergic+stimulation.">Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery.">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).</li><li>Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+stem+cells+and+cardiovascular+drug+discovery.">Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery.</a> Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).</li><li>Youssef, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Promise+and+Challenge+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Applications.">The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).</li><li>Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cues+for+the+maturation+of+metabolic,+electrophysiological+and+calcium+handling+properties+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Gorski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Cardiomyocyte+Contractility+and+Calcium+Handling+In+Vitro.">Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation.">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Patterson, A. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+fetal+heart+development.">Hypoxia and fetal heart development.</a> Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+hypoxia+and+bioreactor+hydrodynamics+boosts+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+towards+cardiomyocytes.">Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Improving+the+Maturity+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).</li><li>Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).</li><li>Hwang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+calcium+handling+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+by+multiple+laboratories.">Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).</li><li>Scuderi, G. J., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+Engineered+Maturation+of+Cardiomyocytes.">Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).</li><li>Jung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+evolution+of+functional+vs.+remodeling+signaling+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+and+induced+maturation+with+biomechanical+stimulation.">Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).</li></ol>

الخطوات الحاسمة لاستخدام الإنسان iPSC-CMs كنماذج تجريبية هي: 1) توليد عضلي عاليه الجودة (CMs) التي يمكن ان تضمن الأداء المتسق ونتائج استنساخه ؛ 2) السماح للخلايا لتنضج في الثقافة لمده لا تقل عن 90 يوما لتقييم ما يكفي من النمط الظاهري ؛ 3) أداء الدراسات الكهربية ، علي سبيل المثال الكالسيوم (Ca2 +) ...

الإنسان المستحث مستحث الخلايا الجذعية المشتقة عضلي (ipsc-CMs) هي منصة الإنسان جذابة لنمذجة مجموعه كبيره ومتنوعة من امراض القلب في المختبر1،2،3،4،5،6،7،8. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدام ipsc-CMs للتنبؤ بردود المريض علي الادويه الجديدة أو القائمة ، لفحص مركبات الضرب ، وتطوير ادويه شخصيه جديده9،10. ومع ذلك ، وعلي الرغم من التقدم الكبير ، هناك حاجه إلى النظر في العديد من القيود والتحديات عند استخدام iPSC-CMs11. التالي ، طرق لتحسين بروتوكولات التمايز القلبي ، لتعزيز كفاءه ipsc-CMs والنضج ، وتوليد أنواع فرعيه عضله محدده (البطين ، الأذيني ، والعقدي) قد درست بشكل مكثف وأديت بالفعل إلى العديد من استراتيجيات الثقافة للتغلب علي هذه العقبات12،13،14،15.
وعلي الرغم من متانة هذه البروتوكولات ، فان أحد الشواغل الرئيسية لاستخدام الاتفاقية هو استنساخ الإجراءات الطويلة والمعقدة للحصول علي عضلي عاليه الجودة يمكن ان تضمن نفس الأداء والنتائج القابلة للتكرار. استنساخ أمر بالغ الاهميه ليس فقط عند مقارنه خطوط الخلايا مع الخلفيات الوراثية المختلفة ، ولكن أيضا عند تكرار المقارنات الخلوية والجزيئية لنفس خط الخلية. وقد يؤثر تباين الخلايا ، مثل الاختلافات الجيدة في كثافة iPSCs ، علي التمايز القلبي ، وتوليد غله منخفضه وعضلي رديئه النوعية. ويمكن استخدام هذه الخلايا لا يزال لتنفيذ التجارب التي لا تتطلب السكان نقيه من CMs (علي سبيل المثال ، عند تنفيذ Ca2 + القياسات عابر). في الواقع ، عند اجراء تحليل إلكتروفيزيولوجي ، فان غير CMs لن تهزم ، لا تلقائيا ولا تحت التحفيز الكهربائي ، لذلك سيكون من السهل استبعادها من التحليل. ومع ذلك ، بسبب نوعيه رديئه ، iPSC-CMs يمكن ان تظهر الخصائص الكهربية المتغيرة (علي سبيل المثال ، غير النظامية Ca2 + عابر ، منخفضه ca2 + السعه) التي ليست بسبب ماكياج الوراثية. ولذلك ، وخاصه عند استخدام iPSC-CMs لنموذج امراض القلب ، فمن المهم عدم الخلط بين النتائج من سم رديئه الجودة مع النمط الظاهري للمرض. تتطلب عمليات الفحص الدقيق والاستبعاد قبل الانتقال إلى الدراسات الكهربية الفسيولوجية.
وتتضمن هذه الطريقة بروتوكولات محسنه لتوليد عضلي عاليه النقاء وعاليه الجودة ولتقييم وظيفتها عن طريق اجراء قياسات Ca2 + عابره باستخدام نظام اكتساب الكالسيوم والانقباض والتحليل. هذه التقنية هي وسيله بسيطه ، ولكنها قويه ، للتمييز بين الكفاءة العالية والكفاءة المنخفضة iPSC-CM الاستعدادات وتوفير توصيف أكثر اهميه من الناحية الفسيولوجية للإنسان iPSC-CMs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27(-) insulin Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic inline heater</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>IL-H-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-qualified matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSC media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33493-01</td>
			<td>StemFlex Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>EC-B25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>ISW-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10906-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>124-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magensium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Glass Cover Slips</td>
			<td>Lab Scientific</td>
			<td>7807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BSS-355w</td>
			<td>Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization

وتوفر العضلي المشتقة من الخلايا الجذعية مستحث البشرية (iPSC-CMs) مصدرا بشريا قيما لدراسة العلوم الاساسيه لمعالجه الكالسيوم (Ca2 +) ومسارات الإشارات ، فضلا عن فحص العقاقير عاليه الانتاجيه واختبارات السمية. هنا ، نقدم وصفا مفصلا للمنهجيات المستخدمة لتوليد عاليه الجودة iPSC-CMs التي يمكن ان تتكاثر باستمرار الخصائص الجزيئية والوظيفية عبر خطوط الخلايا المختلفة. بالاضافه إلى ذلك ، يتم وصف أسلوب لتقييم التوصيف الوظيفي بشكل موثوق به من خلال تقييم خصائص التعامل مع Ca2 + . انخفاض الأكسجين (O2) الشروط ، واختيار اللاكتات ، والوقت لفترات طويلة في الثقافة تنتج عاليه النقاء وعاليه الجودة البطين مثل عضلي. مماثله لعضلي الفئران البالغين المعزولة (ARCMs) ، 3 أشهر من العمر iPSC-CMs يحمل اعلي Ca2 + السعه ، ومعدل أسرع من ca2 + امتصاص (تسوس تاو) ، واستجابه lusitropic ايجابيه لتحفيز β-الكظر مقارنه مع اليوم 30 ipsc-CMs. والاستراتيجية بسيطه من الناحية التقنية وفعاله من حيث التكلفة وقابله للتكرار. ويوفر منصة قويه لنموذج امراض القلب وللكشف عن المخدرات علي نطاق واسع لاستهداف Ca2 + التعامل مع البروتينات.

البروتوكول الموصوف في الشكل 1(ا ) ولد عضلي نقيه للغاية التي تكتسب النمط الظاهري البطين/البالغين مثل مع الوقت في الثقافة. كما تقييمها تلطيخ المناعي للأذيني والبطين ميوسين التنظيمية سلسله الضوء 2 اشكال الاسويه (MLC2A و MLC2V ، علي التوالي) ، وكانت غالبيه الخلايا المتولدة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

هنا نقوم بوصف والتحقق من صحة طريقه لتوليد باستمرار قويه الإنسان المستحثة مستحث الخلايا الجذعية المشتقة عضلي وتميز وظيفتها. هذه التقنيات قد تساعد في تطوير البصيرة الميكانيكية في مسارات الإشارات ، وتوفير منصة للكشف عن المخدرات علي نطاق واسع ، ونموذج موثوق امراض القلب.

توليد العضلي المستمدة من HiPSC مثل البطين والاستعدادات خليه عاليه الجودة لتوصيف مناوله الكالسيوم

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

القابلية للتكرار هي مصدر قلق كبير عند تحفيز خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية. باستخدام هذه الطرق، يمكن توليد نقاء عالية وعالية الجودة cardiomyocytes من iPS لاستخدامها في الدراسات الوظيفية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن بسيطة وموثوقة وفعالة من حيث التكلفة ، وطريقة قوية للغاية للحصول على تنقية ، وإعدادات عالية الجودة من القلب المشتقة من iPSC.بالنسبة لتمرين الخلايا ، شطف الخلايا بميليلتر واحد من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة سبع إلى 10 دقائق قبل استبدال PBS بميليلتر واحد من وسيط التمرير. باستخدام رافع الخلية، كشط بلطف الخلايا من الجزء السفلي من الآبار، واستخدام ماصة الزجاج ملليلتر المعقمة لفك الخلايا المنفصلة ميكانيكيا. عندما رفعت الخلايا إلى مجموعات صغيرة كما مرئية تحت المجهر إضافة متوسطة تمرير لتقسيم الخلايا في نسبة واحد إلى ستة.بعد ذلك، pirate الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المؤهلة مصفوفة من لوحة ستة بئر. ثم إضافة ملليلتر واحد من متوسط التمرير ومليلتر واحد من الخلايا المنفصلة إلى كل بئر ، والسماح للخلايا تنمو حتى تصل إلى 70 إلى 80 ٪ التقاء قبل البدء في تمايز القلب. على الأقل 30 دقيقة قبل فصل iPSC-CMs، مسح زلات الغطاء الزجاجي الفردية مع 70٪الإيثانول، ووضع الغطاء ينزلق في آبار فردية من لوحة ستة بئر معقمة.عندما تجفيفت زلات الغطاء، إضافة 250 إلى 300 ميكرولترات من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية حل المصفوفة المؤهلة مباشرة على مركز كل زلة الغطاء، ووضع لوحة ستة جيدا في غطاء الأنسجة ثقافة. لفكّر iPSC-CM المحدد أيضًا بإضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ تبربسين مع EDTA إلى كل بئر لمدة خمس دقائق حضانة عند 35 درجة مئوية، واستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لفك الخلايا ميكانيكيًا حتى يتحقق تعليق خلية واحدة. سحب الخلايا في أنبوب مخروطي مخروطي 15 ملليلتر معقمة، وغسل كل جيدا مع مليلترين من RPMI 20 المتوسطة في بئر.ثم تضاف يغسل إلى أنبوب بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. resuspend الخلايا في حجم كاف من المتوسطة لتحقيق ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 250 ميكرولترات من تركيز الخلايا. استخدام 1000 ملليلتر ماصة تلميح لتفكك الخلايا حتى الحل يبدو أن متجانسة.ثم pirate 250 ميكرولترات من الخلايا في 1000 ميكرولتر ماصات تلميح، وببطء الاستغناء عن حجم كامل من الحل على واحد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المؤهلة مصفوفة زلة الغطاء المرمز. عندما تم زرع جميع الخلايا ، ضع اللوحة بعناية في حاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. إضافة بلطف مليلترين من D7 المتوسطة إلى كل بئر في صباح اليوم التالي.عندما حدد iPSC-CMs تصل إلى ما لا يقل عن ثلاثة أشهر من العمر علاج الخلايا مع اثنين من ميكرولترات من فورا-2 ص لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية، والطاقة على نظام تحليل الكالسيوم. بدء ArcLamp وربط الأنابيب من المضخة إلى المداخل المناسبة ومنافذ والأسلاك الإلكترونية من محفز إلى الغرفة. ضع الغرفة على النظام.املأ أنبوب ProFusion الذي يمر عبر سخان سائل مع محلول تيرود 37 درجة مئوية، وضبط أبعاد فتحة الكاميرا وتأطيرها لتقليل مساحة الخلفية. قم بـربط الغطاء الزجاجي بذرة مع iPSC-CMs في الغرفة ، وأضف بلطف 500 ميكرولترات من حل Tyrode مباشرة فوق زلة الغطاء. ابدأ في استخدام الغرفة مع محلول Tyrode بمعدل 1.5 ملليلتر في الدقيقة ، واستخدم محفزًا كهربائيًا لوتيرة iPC-CMs مع تحفيز حقل 1 Hertz بمعدل 10 فولت كل أربع مللي ثانية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.عندما تم غسلها كل من صبغة من الغرفة ضبط نافذة العرض إلى المنطقة اليسرى العليا من زلة الغطاء، والبدء في التسجيل. بعد جمع تيار ثابت من خمس إلى 10 قمم انقر وقفة لوقف التسجيل مؤقتا ونقل مرحلة المجهر إلى منطقة مجاورة للنهاية المقابلة للغطاء قبل استئناف التسجيل. بعد مسح الترانبينس الكالسيوم عبر زلة الغطاء بأكمله بنفس الطريقة على مدى فترة 10 دقائق تحليل البيانات مع برنامج تحليل تتبع الفلوريس مناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.يولد هذا البروتوكول القلبية النقية للغاية التي تكتسب بطيني ، مثل نمط ظاهري بالغ في الثقافة مع مرور الوقت. كما تم تقييمها بواسطة تلوين الفلورسنت المناعية لثائر MLC2 الأذينية والبطينية، فإن غالبية الخلايا الناتجة عن هذا البروتوكول هي أذيني MLC2 isoform في اليوم 30 بعد تحريض تمايز القلب. بينما يتم التعبير عن الشكلين متساويي MLC2 البطيني في كثير من الأرقام في نفس النقطة الزمنية.كما يزيد الوقت في الثقافة، يتم ملاحظة التحول الكامل إلى isoforms MLC2. وقد تأكدت هذه البيانات أيضاً من خلال القياس الكمي للتدفق من النسبة المئوية لثنمتر MLC2 الأذيني والبطيني. زيادة سعة الكالسيوم بشكل كبير في iPSC-CMs في اليوم 90، على غرار تلك التي لوحظت لCMs الفئران الكبار.من المهم ملاحظة أن تلويث الخلايا غير القلبية قد يؤثر على النضج الوظيفي لـ iPSC-CMs البشري أثناء التمايز. علاوة على ذلك ، عندما يسجل العابرون الكالسيوم في iPSC - CMs من الضروري السماح للخلايا بالثبات عند 37 درجة مئوية تحت التحفيز المستمر لمدة 200 ثانية على الأقل ، وتقييد التسجيلات في نافذة زمنية محددة لضمان النتائج القابلة للتكرار. تذكر أن تؤكد أن iPSCs يحمل مورفولوجيا متجانسة والسماح للخلايا لتنمو إلى 70 إلى 80٪ التقاء قبل بدء التمايز القلب.قد تظهر الجودة النقية في القلب المشتق من iPS غير الناضجة الخصائص الوظيفية المتغيرة ، والتي لا تعكس النمط الظاهري الحقيقي ، ولكن يمكن إساءة تفسيرها على أنها النمط الظاهري المريض. ولذلك، الحصول على نقية وعالية الجودة cardiomyocytes المهم لتوفير نتائج متسقة وقابلة للتكرار.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

التعامل مع الفأر القطن في الدراسات لتقييم ما قبل السريرية من حال الورم الفيروسات

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

عالية الإنتاجية توصيف الخلايا الجذعية البالغة المهندسة لتسليم العوامل العلاجية لاستراتيجيات اعصاب

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

دليل لتوليد واستخدام hiPSC الشخصيات المستمدة لدراسة الأمراض العصبية

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

توصيف الأنسجة بعد طريقة جديدة تصنيفها فيما يتعلق الجلد الصغرى الطعوم الجيل

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

عزل وتوصيف من الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا حيوانية وجود الجذعية خصائص الخلية

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

إعداد و<em&gt; في المختبر</em&gt; توصيف ممغنط مير تعديل الخلايا البطانية

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

تقييم الشبكة شبكية الكالسيوم إزالة الكالسيوم االنبساطي الاحتياطي وداخل الخلايا في Cardiomyocytes البطين المعزولة

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...