Name: generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af AHA forsker Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award for klinisk og Translationel forskning karriereudvikling KL2TR001435 (F.S.); NIH r00 HL116645 og AHA 18TPA34170460 (C.K.).

Forsøgene med at bruge voksne rotte kardiomyocytter i dette studie blev udført med godkendt institutionel dyrepleje og brug Komité (IACUC) protokoller af Icahn School of Medicine på Mount Sinai. De voksne rotte kardiomyocytter blev isoleret fra Sprague Dawley rat Hearts af den Langendorff-baserede metode som tidligere beskrevet16.
1. forberedelse af medierne
<ol><li>Forbered hiPSC-medier.<ol>
<li>Supplere og den basale medium til stuetemperatur (RT). Sørg for, at...

<ol>
	<li>Karakikes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+human+phospholamban+R14del+mutation+associated+with+cardiomyopathy+using+targeted+nucleases+and+combination+therapy.">Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy.</a> Nature Communications. 6, 6955 (2015).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+pluripotent+stem+cells+recapitulate+electrophysiological+characteristics+of+an+overlap+syndrome+of+cardiac+sodium+channel+disease.">Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease.</a> Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+ryanodine+receptor+2+dysfunction+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+generated+from+CPVTD307H+patients+are+arrhythmogenic+in+response+to+beta-adrenergic+stimulation.">Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery.">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).</li><li>Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+stem+cells+and+cardiovascular+drug+discovery.">Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery.</a> Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).</li><li>Youssef, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Promise+and+Challenge+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Applications.">The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).</li><li>Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cues+for+the+maturation+of+metabolic,+electrophysiological+and+calcium+handling+properties+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Gorski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Cardiomyocyte+Contractility+and+Calcium+Handling+In+Vitro.">Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation.">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Patterson, A. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+fetal+heart+development.">Hypoxia and fetal heart development.</a> Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+hypoxia+and+bioreactor+hydrodynamics+boosts+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+towards+cardiomyocytes.">Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Improving+the+Maturity+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).</li><li>Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).</li><li>Hwang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+calcium+handling+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+by+multiple+laboratories.">Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).</li><li>Scuderi, G. J., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+Engineered+Maturation+of+Cardiomyocytes.">Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).</li><li>Jung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+evolution+of+functional+vs.+remodeling+signaling+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+and+induced+maturation+with+biomechanical+stimulation.">Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).</li></ol>

Kritiske trin for brug af humant iPSC-CMs som eksperimentelle modeller er: 1) genererer høj kvalitet cardiomyocytter (CMs), der kan sikre en ensartet ydeevne og reproducerbare resultater; 2) at lade cellerne modne i kulturen i mindst 90 dage til tilstrækkelig vurdering af deres fænotype; 3) udføre elektrofysiologiske undersøgelser, fx calcium (ca2 +) forbigående målinger, at give en fysiologisk relevant funktionel karakterisering af humant IPSC-CMS. Vi udviklede en monolayer-baseret differentierings met...

Human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter (IPSC-CMS) er en attraktiv Human-baserede platform til at modellere en lang række hjertesygdomme in vitro1,2,3,4,5,6,7,8. Desuden, IPSC-CMS kan anvendes til forudsigelse af patientens respons på nye eller eksisterende lægemidler, at screene hit forbindelser, og udvikle nye personlige stoffer9,10. På trods af betydelige fremskridt skal der dog tages hensyn til flere begrænsninger og udfordringer ved brug af iPSC-CMs11. Derfor, metoder til at forbedre kardiale differentiering protokoller, for at forbedre IPSC-CMS effektivitet og modning, og til at generere specifikke kardiomyocyte undertyper (ventrikulær, atrial, og nodal) er blevet intenst undersøgt og allerede ført til talrige kulturstrategier til at overvinde disse forhindringer12,13,14,15.
Uanset disse protokollernes soliditet er en stor bekymring for brugen af iPSC-CMs reproducerbarhed af lange og komplekse procedurer for at opnå høj kvalitet kardiomyocytter, der kan sikre den samme ydeevne og reproducerbare resultater. Reproducerbarhed er kritisk, ikke kun når man sammenligner cellelinjer med forskellige genetiske baggrunde, men også når man gentager cellulære og molekylære sammenligninger af samme cellelinje. Celle variabilitet, såsom well-to-Well forskelle i iPSCs tæthed, kan påvirke hjerte differentiering, genererer et lavt udbytte og dårlig kvalitet kardiomyocytter. Disse celler kan stadig bruges til at udføre eksperimenter, der ikke kræver en ren population af CMs (f. eks. ved udførelse af ca2 + forbigående målinger). Faktisk, når de udfører elektrofysiologisk analyse, ikke-CMs vil ikke slå, hverken spontant eller under elektrisk stimulation, så det vil være let at udelukke dem fra analysen. Men på grund af den dårlige kvalitet kan iPSC-CMs vise ændrede elektrofysiologiske egenskaber (f. eks. uregelmæssig ca2 + forbigående, lav ca2 + amplitude), som ikke skyldes deres genetiske makeup. Derfor, især når du bruger iPSC-CMs til at modellere hjertesygdomme, er det vigtigt ikke at forveksle resultater fra en dårlig kvalitet CM med sygdommen fænotype. Der kræves omhyggelige screenings-og udelukkelses processer, inden elektrofysiologiske undersøgelser fortsættes.
Denne metode omfatter optimerede protokoller til at generere høj renhed og høj kvalitet kardiomyocytter og til at vurdere deres funktion ved at udføre ca2 + forbigående målinger ved hjælp af et calcium-og kontraktilitet erhvervelse og analyse system. Denne teknik er en enkel, men kraftfuld, måde at skelne mellem høj effektivitet og lav effektivitet iPSC-CM præparater og give en mere fysiologisk relevant karakterisering af humane iPSC-CMs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27(-) insulin Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic inline heater</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>IL-H-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-qualified matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSC media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33493-01</td>
			<td>StemFlex Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>EC-B25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>ISW-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10906-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>124-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magensium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Glass Cover Slips</td>
			<td>Lab Scientific</td>
			<td>7807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BSS-355w</td>
			<td>Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization

Human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter (iPSC-CMs) give en værdifuld menneskelig kilde til at studere den grundlæggende videnskab om calcium (ca2 +) håndtering og signalering veje samt høj-gennemløb Drug screening og toksicitet assays. Heri giver vi en detaljeret beskrivelse af de metoder, der anvendes til at generere iPSC-CMs af høj kvalitet, der konsekvent kan gengive molekylære og funktionelle egenskaber på tværs af forskellige cellelinjer. Desuden beskrives en metode til pålideligt at vurdere deres funktionelle karakterisering gennem evaluering af ca2 + håndterings egenskaber. Lav ilt (O2) betingelser, laktat udvælgelse, og langvarig tid i kulturen producerer høj renhed og høj kvalitet ventrikulær-lignende kardiomyocytter. Svarende til isolerede voksne rotte kardiomyocytter (ARCMs), 3-måneders-gamle iPSC-CMs udviser højere ca2 + amplitude, hurtigere hastighed på ca2 + reuptake (forfald-Tau), og en positiv lusitropic respons på β-adrenerge stimulation sammenlignet med dag 30 IPSC-CMS. Strategien er teknisk enkel, omkostningseffektiv og reproducerbar. Det giver en robust platform til at modellere hjertesygdomme og til storstilet Drug screening for at målrette ca2 + håndtering proteiner.

Den protokol, der er beskrevet i figur 1A , genererede meget rene kardiomyocytter, som fik en ventrikel/voksen lignende fænotype med tid i kulturen. Som vurderet af immunofluorescens farvning for atrieflimren og ventrikulær myosin regulerende lyskæde 2 isoformer (henholdsvis MLC2A og MLC2V), de fleste af cellerne genereret af denne protokol var MLC2A-positive på dag 30 efter induktion af hjerte differentiering, mens MLC2V blev udtrykt i meget lavere mængder på samme ti...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Her beskriver og validerer vi en metode til konsekvent at generere robuste menneskeskabte pluripotente stamcelle afledte kardiomyocytter og karakterisere deres funktion. Disse teknikker kan hjælpe med at udvikle mekanistisk indsigt i signalering veje, give en platform for storstilet Drug screening, og pålideligt model hjertesygdomme.

Generation af ventrikulær-lignende HiPSC-afledte Kardiomyocytter og høj kvalitet celle præparater til calcium håndtering karakterisering

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

Reproducerbarhed er stor bekymring, når inducere stamceller-afledte kardiomyocytter. Ved hjælp af disse metoder, høj renhed og høj kvalitet kardiomyocytter kan genereres fra iPS til deres anvendelse i funktionelle undersøgelser. Den største fordel ved denne teknik er, at der er en enkel, pålidelig, omkostningseffektiv og ekstremt kraftfuld metode til at opnå renset, høj kvalitet præparater af iPSC-afledte kardiomyocytter.Ved cellepasning skylles cellerne med en milliliter PBS uden calcium og magnesium i syv til 10 minutter, før PBS udskiftes med en milliliter afleveringsmedium. Ved hjælp af en celleløfter, forsigtigt skrabe cellerne fra bunden af brøndene, og bruge sterile to milliliter glas pipette til mekanisk adskille de fritliggende celler. Når cellerne er løftet ind i små klynger som synlige under mikroskopet tilføje passerer medium til at opdele cellerne på en en til seks forhold.Dernæst aspirere den menneskelige embryonale stamcelle kvalificeret matrix fra de seks brønd plade. Derefter tilsættes en milliliter afleveringsmedium og en milliliter af dissocierede celler til hver brønd, og lad cellerne vokse, indtil de når 70 til 80%sammenløb, før du starter en hjertedifferentiering. Mindst 30 minutter før dissociating iPSC-CMs, tør individuelle glasdæksel glider med 70% ethanol, og placere dækslet glider i individuelle brønde af en steril seks godt plade.Når dækslet glider er tørret, tilsættes en 250 til 300 mikroliter af menneskelige embryonale stamceller kvalificeret matrix løsning direkte på midten af hver dæksel slip, og placere de seks godt plade i væv kultur hætte. At adskille metabolisk udvalgte iPSC-CM tilføje en milliliter sterile 0,25%trypsin med EDTA til hver brønd i en fem minutters inkubation ved 35 grader celsius, og bruge en 1000 mikroliter pipette til mekanisk dissociate cellerne, indtil en enkelt celle suspension er opnået. Træk cellerne i sterilt 15 milliliter konisk rør, og vask hver brønd med to milliliter RPMI 20 medium pr brønd.Derefter tilsættes vasker til røret og pellet cellerne ved centrifugering. Cellerne opsplites igen i et tilstrækkeligt mediumvolumen til at opnå tre gange 10 til de femte celler pr. 250 mikroliter af cellerkoncentrationen. Brug en pipettespids på 1000 milliliter til at adskille cellerne, indtil opløsningen ser ud til at være homogen.Derefter aspirere 250 mikroliter af celler i en 1000 mikrolit pipette spids, og langsomt dispensere hele mængden af opløsning på en menneskelig embryonal stamcelle kvalificeret matrix kodet dække slip. Når alle cellerne er seedet, skal pladen forsigtigt hældes i cellekulturkubatoren natten over. Forsigtigt tilføje to milliliter D7 medium til hver brønd næste morgen.Når de valgte iPSC-CMs nå mindst tre måneder gamle behandle cellerne med to mikroliter af Fura-2 AM i 10 minutter ved 37 grader Celsius, og magt på calcium analysesystem. Start ArcLamp og tilslut rørene fra pumpen til de relevante indløb og stikkontakter og den elektroniske ledning fra stimulatoren til kammeret. Anstæn skal kammeret på systemet.Fyld ProFusion rør, der løber gennem den flydende inlined varmelegeme med 37 grader Celsius varmet Tyroder løsning, og justere kameraet og indramning blænde dimensioner for at minimere baggrunden område. Fastgør glasdækslet, der er sået med iPSC-CMs ind i kammeret, og tilsæt forsigtigt 500 mikroliter af Tyrods opløsning direkte oven på dækslet. Begynd profusing kammeret med Tyrode løsning på en 1,5 milliliter per minut sats, og bruge en elektrisk stimulator til at tempoet iPC-CMs med 1 Hertz felt stimulation på 10 volt hvert fjerde millisekunder i tre til fem minutter.Når alt farvestoffet er blevet vasket ud af kammeret justere visning vinduet til øverste venstre region af dækslet slip, og begynde optagelsen. Efter indsamling af en ensartet strøm på fem til 10 toppe klik pause for midlertidigt at stoppe optagelsen og flytte mikroskop fase til et tilstødende område for den modsatte ende af dækslet slip, før du genoptager optagelsen. Efter scanning calcium forgængelighed på tværs af hele dækslet slip på samme måde over en periode på 10 minutter analysere data med en passende florescence sporanalyse software i henhold til producentens anvisninger.Denne protokol genererer meget ren kardiomyocytter, der erhverver en ventrikel, voksen-lignende fænotype i kultur over tid. Som vurderet ved immunfluorescerende farvning for atrie- og ventrikulær MLC2-isoformer er størstedelen af de celler, der genereres ved denne protokol, atrieflimren MLC2-isoform positiv på dag 30 efter induktion af hjertedifferentiering. Mens ventrikulære MLC2 isoformer udtrykkes i mange tal på samme tidspunkt.Efterhånden som kulturtiden stiger, observeres et komplet skift til MLC2-isoformerne. Disse data blev også bekræftet ved flow cytometrisk kvantificering af procentdelen af atrie- og ventrikulær MLC2-markør, der udtrykker celler. Calcium amplituden øges betydeligt i iPSC-CM'erne på dag 90, svarende til den, der observeres for voksne rotter.Det er vigtigt at bemærke, at forurenende ikke-hjerteceller kan påvirke den funktionelle modning af den menneskelige iPSC-CMs under differentiering. Yderligere, når optage calcium transienter i iPSC-CMs er det nødvendigt at give cellerne til at stabilisere ved 37 grader Celsius under konstant stimulation i mindst 200 sekunder, og at begrænse optagelserne til et bestemt tidsvindue for at sikre reproducerbare resultater. Husk at bekræfte, at iPSCs udviser en homogen morfologi og at lade cellerne vokse til 70 til 80% sammenløb, før der indledes en hjertedifferentiering.Ren kvalitet i umodne iPS-afledte kardiomyocytter kan vise ændrede funktionelle egenskaber, som ikke afspejler den virkelige fænotype, men kan misforstås som den syge fænotype. Derfor, opnå ren og høj kvalitet cardiomyocytes er vigtigt at give konsekvent og reproducerbare resultater.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolering og funktionel karakterisering af human Ventrikulær kardiomyocytter fra Fresh Kirurgiske Prøver

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Håndtering af bomuld Rat i Undersøgelser for præklinisk evaluering af onkolytiske Vira

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Højt gennemløb Karakterisering af voksne stamceller udviklet til levering af terapeutiske faktorer for Neurobeskyttende Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

En guide til generering og brug hiPSC Afledte NPC&#39;ere for Studiet af neurologiske sygdomme

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Karakterisering efter en ny Disaggregering Metode til Skin Micro-udtagne transplantater Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Isolering og karakterisering af et hoved og hals pladecellekræft delpopulation have stamcelle Karakteristik

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

fremstilling og<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterisering af Magnetized miR-modificerede endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Vurdering af Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve og intracellulære diastolisk Calcium fjernelse i isolerede ventrikulær Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...