Name: generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי המענק AHA מדען פיתוח מענק 17SDG33700093 (F.S.); פרס מKL2 של הר סיני לחקר המחקר הקליני והטרנסג KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 ו AHA 18TPA34170460 (סי סי).

הניסויים בעזרת קרדיוקרדיציטים מבוגרים במחקר זה נערכו עם מאושר טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש (IACUC) פרוטוקולים של בית הספר Icahn לרפואה בהר סיני. הקרדיוציטים הבוגרים היו מבודדים מהלבבות העכברים של ספראג באמצעות השיטה המבוססת על לאנגדורף כמתואר בעבר16.
1. הכנת...

<ol>
	<li>Karakikes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+human+phospholamban+R14del+mutation+associated+with+cardiomyopathy+using+targeted+nucleases+and+combination+therapy.">Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy.</a> Nature Communications. 6, 6955 (2015).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+pluripotent+stem+cells+recapitulate+electrophysiological+characteristics+of+an+overlap+syndrome+of+cardiac+sodium+channel+disease.">Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease.</a> Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+ryanodine+receptor+2+dysfunction+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+generated+from+CPVTD307H+patients+are+arrhythmogenic+in+response+to+beta-adrenergic+stimulation.">Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery.">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).</li><li>Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+stem+cells+and+cardiovascular+drug+discovery.">Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery.</a> Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).</li><li>Youssef, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Promise+and+Challenge+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Applications.">The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).</li><li>Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cues+for+the+maturation+of+metabolic,+electrophysiological+and+calcium+handling+properties+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Gorski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Cardiomyocyte+Contractility+and+Calcium+Handling+In+Vitro.">Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation.">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Patterson, A. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+fetal+heart+development.">Hypoxia and fetal heart development.</a> Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+hypoxia+and+bioreactor+hydrodynamics+boosts+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+towards+cardiomyocytes.">Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Improving+the+Maturity+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).</li><li>Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).</li><li>Hwang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+calcium+handling+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+by+multiple+laboratories.">Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).</li><li>Scuderi, G. J., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+Engineered+Maturation+of+Cardiomyocytes.">Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).</li><li>Jung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+evolution+of+functional+vs.+remodeling+signaling+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+and+induced+maturation+with+biomechanical+stimulation.">Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).</li></ol>

שלבים קריטיים לשימוש ב-iPSC-CMs האנושי כמודלים ניסיוניים הם: 1) היוצרים הקרדיוציטים באיכות גבוהה (CMs) שיכולים להבטיח את הביצועים העקביים ואת התוצאות הנוזניות; 2) המאפשר לתאים להבשיל בתרבות לפחות 90 ימים כדי להעריך כראוי את פנוטיפ שלהם; 3) ביצוע מחקרים אלקטרולוגיים, למשל סידן (Ca2 +) מדידות ארעי...

תא גזע הנגרמת על ידי האדם המושרה-הגוף הנגזר (ipsc-CMs) הם פלטפורמה מבוססת אדם אטרקטיבי למודל מגוון גדול של מחלות לב מבחנה1,2,3,4,5,6,7,8. יתר על כן, ipsc-CMs יכול לשמש לחיזוי של תגובות המטופל לתרופות הרומן או הקיים, כדי למסך תרכובות פגע, ולפתח תרופות אישיות חדשה בהתאמה אישית9,10. עם זאת, למרות ההתקדמות המשמעותית, יש לשקול מספר מגבלות ואתגרים בעת שימוש ב-iPSC-CMs11. כתוצאה מכך, שיטות לשיפור פרוטוקולי בידול הלב, כדי לשפר את היעילות ipsc-CMs והתבגרות, וכלה לייצר מיני קרדיולוגית מסוימים (חדרית, פרפור, ו nodal) כבר למדו והובילו לאסטרטגיות רבות בתרבות כדי להתגבר על מכשולים אלה12,13,14,15.
על אף החוסן של פרוטוקולים אלה, הדאגה העיקרית לשימוש iPSC-CMs היא מהווה את האפשרות של הליכים ארוכים ומורכבים כדי להשיג קרדיוומיציטים באיכות גבוהה שיכול להבטיח ביצועים זהה ותוצאות לאורך זמן. הנוזפות היא קריטית לא רק בעת השוואת קווי התא עם רקעים גנטיים שונים, אלא גם כאשר חוזר השוואות סלולר ומולקולרי של אותו קו התא. שינויים בתאים, כגון הבדלים היטב בצפיפות iPSCs, עשויים להשפיע על בידול הלב, הפקת תשואה נמוכה ומנוציטים באיכות ירודה. תאים אלה עדיין יכול לשמש כדי לבצע ניסויים שאינם דורשים אוכלוסייה טהורה של CMs (למשל, בעת ביצוע Ca2 + ארעי מדידות). ואכן, בעת ביצוע ניתוח אלקטרולוגי, אי-CMs לא יכה, לא באופן ספונטני ולא מתחת לגירוי חשמלי, כך יהיה קל להוציא אותם מהניתוח. עם זאת, בגלל האיכות הירודה, iPSC-CMs יכול להראות מאפיינים אלקטרופיסיולוגיים שונה (למשל, Ca לא סדיר2 + ארעי, נמוך ca2 + משרעת) אשר אינם בשל האיפור הגנטי שלהם. לכן, במיוחד כאשר באמצעות iPSC-CMs למודל לב מחלות, חשוב לא לבלבל את התוצאות מ-CM באיכות נמוכה עם פנוטיפים למחלה. תהליכי הקרנה והדרה מזהירים נדרשים לפני שממשיכים ללמוד אלקטרופיסיולוגיים.
שיטה זו כוללת פרוטוקולים ממוטבים להפקת שימוש בטוהר גבוה ובאיכות גבוהה ולהערכת תפקידם על-ידי ביצוע מדידות של Ca2 + ארעי באמצעות מערכת הפקת סידן וניתוח. טכניקה זו היא פשוטה, אך רבת עוצמה, דרך להבדיל בין יעילות גבוהה לבין יעילות נמוכה ההכנות iPSC-CM ולספק אפיון מבחינה פיזיולוגית יותר רלוונטי של iPSC-CMs אנושי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27(-) insulin Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic inline heater</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>IL-H-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-qualified matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSC media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33493-01</td>
			<td>StemFlex Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>EC-B25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>ISW-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10906-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>124-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magensium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Glass Cover Slips</td>
			<td>Lab Scientific</td>
			<td>7807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BSS-355w</td>
			<td>Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization

תאי גזע הנגרמת על ידי האדם המושרה-הקרדיוציטים (iPSC-CMs) לספק מקור אנושי יקר ללמוד את המדע הבסיסי של סידן (Ca2 +) טיפול מסלולים איתות, כמו גם הקרנות התפוקה גבוהה הקרנת תרופות רעילות. להלן, אנו מספקים תיאור מפורט של המתודולוגיות המשמשות להפקת iPSC-CMs באיכות גבוהה שיכול לשחזר בעקביות מאפיינים מולקולריים ופונקציונליים על פני קווי תאים שונים. בנוסף, מתוארת שיטה להעריך באופן אמין את האפיון הפונקציונלי שלהם באמצעות הערכה של מאפייני Ca2 + טיפול. חמצן נמוך (O2) התנאים, בחירת לקטט, וזמן ממושך בתרבות לייצר טוהר גבוהה ואיכות גבוהה, המוח כמו הקרדיוציטים. בדומה מבודד עכברוש מבוגר חולדה (ARCMs), 3-חודש-התערוכה iPSC-CMs גבוה יותר Ca2 + משרעת, שיעור מהיר יותר של ca2 + קליטה (ריקבון-טאו), ו תגובה lusitropic חיובית β-אדראררגיות גירוי לעומת יום 30 ipsc-CMs. האסטרטגיה היא טכנית פשוטה, חסכונית, והיא מתוכמת. הוא מספק פלטפורמה חזקה למודל לב מחלות ועבור הקרנת סמים בקנה מידה גדול כדי למקד Ca2 + טיפול בחלבונים.

הפרוטוקול המתואר באיור 1A שנוצר הקרדיוציטים טהור אשר לרכוש שיטת למבוגרים, כמו פניטיפ עם הזמן בתרבות. כפי שמוערך על ידי immunofluorescence כתמים עבור הפרפור ואת הרירן החדרית שרשרת האור הרגולציה 2 איזופורמים (MLC2A ו MLC2V, בהתאמה), רוב התאים שנוצר על ידי פרוטוקול זה היו MLC2A-חיוביים...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

כאן אנו מתארים ולאמת שיטה כדי ליצור בעקביות באופן עקבי הנגרמת האנושי המושרה תא גזע מושרה ולאפיין את תפקידם. טכניקות אלה עשויות לסייע בפיתוח תובנה מכניסטית למסלולי איתות, לספק פלטפורמה לסינון תרופות בקנה מידה גדול ומחלות לב באופן אמין.

הדור של היפנוציטים באיכות גבוהה והתרופות לאפיון הטיפול בסידן

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

רבייה היא דאגה העיקרית כאשר גרימת קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע. באמצעות שיטות אלה, טוהר גבוה ו cardiomyocytes באיכות גבוהה יכול להיווצר iPS לשימושם במחקרים פונקציונליים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי היא שיטה פשוטה, אמינה, חסכונית, וחזקה מאוד להשגת מטוהרים, הכנות באיכות גבוהה של קרדיומיוציטים שמקורם iPSC.עבור מעבר תאים, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS ללא סידן ומגנזיום במשך שבע עד 10 דקות לפני החלפת PBS עם מיליליטר אחד של מדיום עובר. באמצעות מרים תאים, בעדינות לגרד את התאים מתחתית הבארות, ולהשתמש פיפטה זכוכית סטרילי שני מיליליטר כדי לנתק מכנית את התאים מנותקים. כאשר התאים התרוממים לאשכולות קטנים כפי שהם נראים מתחת למיקרוסקופ מוסיפים מדיום עובר כדי לפצל את התאים ביחס של אחד עד שישה.לאחר מכן, שאף את המטריצה המוסמכת של תאי הגזע העובריים האנושיים מצלחת ששת הבאר. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של עובר בינוני ומיליליטר אחד של תאים מנותקים לכל באר, ולתת לתאים לגדול עד שהם מגיעים 70 עד 80% confluency לפני תחילת התמדה לבבית. לפחות 30 דקות לפני ניתוק iPSC-CMs, לנגב מחליק כיסוי זכוכית בודד עם 70% אתנול, ולמקם את הכיסוי מחליק לתוך בארות בודדות של צלחת סטרילית שש באר.כאשר החלקות הכיסוי התייבשו, להוסיף 250 עד 300 microliters של תא גזע אנושי מוסמך פתרון מטריצה ישירות למרכז של כל להחליק כיסוי, ולמקם את צלחת שש היטב במכסה המנוע של תרבות הרקמה. כדי לנטרל את iPSC-CM שנבחר באופן מטבולי להוסיף מיליליטר אחד של סטרילי 0.25% טריפסין עם EDTA לכל באר עבור דגירה של חמש דקות ב 35 מעלות צלזיוס, ולהשתמש פיפט 1000 microliter כדי לנטרל מכנית את התאים עד השעיה תא יחיד הושג. משוך את התאים בצינור חרוט סטרילי 15 מיליליטר, ולשטוף כל באר עם שני מיליליטר של RPMI 20 בינוני לגם.לאחר מכן מוסיפים את הכביסה לצינור וכדור התאים על ידי צנטריפוגה. תן שימוש חוזר בתאים בנפח מספיק של מדיום כדי להשיג שלוש פעמים 10 לתאים החמישיים לכל 250 מיקרוליטרים של ריכוז תאים. השתמש בקצה פיפט 1000 מיליליטר כדי לנתק את התאים עד שהפתרון נראה הומוגני.לאחר מכן שאפו 250 מיקרוליטרים של תאים לקצה פיפט של 1000 מיקרוליטר, ופונו באיטיות את כל נפח הפתרון לתגוח כיסוי מקודד אחד של תאי גזע עובריים. כאשר כל התאים כבר זרעו, בזהירות למקם את הצלחת לתוך החממה תרבות התא לילה. בעדינות הוספת שני מיליליטר של D7 בינוני לכל באר למחרת בבוקר.כאשר iPSC-CMs שנבחרו מגיעים לפחות שלושה חודשים לטפל בתאים עם שני microliters של Fura-2 AM במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, וכוח על מערכת ניתוח סידן. ליזום את ArcLamp ולחבר את הצינורות מהמשאבה לשקעים המתאימים ואת החוט האלקטרוני מן הממריץ לתא. שים את התא על המערכת.מלאו את צינור ProFusion העובר דרך התנור הנוזלי עם 37 מעלות צלזיוס חיממו את הפתרון של טירודה, והתאימו את מידות המצלמה והצמצם המסגור כדי למזער את אזור הרקע. הדקו את כיסוי הזכוכית עם iPSC-CMs לתוך התא, והוסיפו בעדינות 500 מיקרוליטרים של הפתרון של טירודה ישירות על גבי החלקת הכיסוי. התחילו למזג את התא עם הפתרון של טירוד בקצב של 1.5 מיליליטר לדקה, ולהשתמש בממריץ חשמלי כדי לקצב את ה-iPC-CMs עם גירוי שדה 1 הרץ ב 1 וולט כל ארבע אלפיות שנייה במשך שלוש עד חמש דקות.כאשר כל הצבע נשטף מהתא, התאם את חלון הצפייה לאזור השמאלי העליון של החלק השמאלי העליון של המכסה, והתחל בהקלטה. לאחר איסוף זרם עקבי של חמש עד 10 פסגות לחץ על השהיה כדי לעצור זמנית את ההקלטה ולהזיז את שלב המיקרוסקופ לאזור סמוך לקצה הנגדי של שובר הכיסוי לפני חידוש ההקלטה. לאחר סריקת ארעיות הסידן על פני כל החלקת המכסה באותו אופן על פני תקופה של 10 דקות לנתח את הנתונים עם תוכנת ניתוח מעקב florescence המתאימה על פי הוראות היצרן.פרוטוקול זה מייצר קרדיומיוציטים טהורים מאוד הרוכשים פנוטיפ דמוי מבוגרים חדרי בתרבות לאורך זמן. כפי שהוערך על ידי כתמים פלואורסצנטיים אימונו עבור isoforms MLC2 פרוזדורי חדרית, רוב התאים שנוצרו על ידי פרוטוקול זה הם פרוזדורי MLC2 isoform חיובי ביום 30 לאחר אינדוקציה של התביור הלב. בעוד isoforms MLC2 חדרית באים לידי ביטוי במספרים רבים באותו זמן נקודה.ככל שהזמן בתרבות גדל, מתג שלם isoforms MLC2 הוא ציין. נתונים אלה אושרו גם על ידי כימות ציטומטרי זרימה של אחוז סמן MLC2 פרוזדורים חדריים המבטאים תאים. משרעת הסידן גדלה באופן משמעותי ב- iPSC-CMs ביום 90, בדומה לזה שנצפה עבור CMs עכברוש בוגר.חשוב לציין כי זיהום תאים שאינם לב עשוי להשפיע על התבגרות תפקודית של iPSC-CMs האנושי במהלך בידול. כמו כן, כאשר שיא סידן חולף ב- iPSC-CMs יש צורך לאפשר לתאים להתייצב ב 37 מעלות צלזיוס תחת גירוי מתמיד לפחות 200 שניות, ולהגביל את ההקלטות לחלון זמן מסוים כדי להבטיח תוצאות לשחזור. זכור לאשר כי iPSCs להפגין מורפולוגיה הומוגנית כדי לאפשר לתאים לגדול ל 70 עד 80% confluency לפני תחילת התפזרות לב.איכות טהורה בקרדיומיוציטים שמקורם ב- iPS לא בוגר עשויה להראות מאפיינים פונקציונליים משתנים, שאינם משקפים את הפנוטיפ האמיתי, אך עלולים להיות מתפרשים שלא כהלכה כפנוטיפ חולה. לכן, קבלת קרדיומיוציטים טהורים ואיכותיים חשובה כדי לספק תוצאות עקביות לשחזור.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

טיפול של הכותנה העכברוש במחקרים להערכה טרום-הקלינית של וירוסי Oncolytic

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

מדריך ליצירת וNPCs hiPSC שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

אפיון רקמות לאחר שיטה חדשה חלוקה לעור מיקרו שתלי הדור

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

בידוד ואפיון של ראש וצוואר קשקש Cell Carcinoma-אוכלוסיית מאפייני תאי גזע לאחר

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...