Name: generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00
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इस शोध को अहा वैज्ञानिक विकास अनुदान 17SDG33700093 (F.S.S.) द्वारा समर्थित किया गया था; माउंट सिनाई KL2 विद्वानों पुरस्कार नैदानिक और ट्रांसलेशनल रिसर्च कैरियर विकास KL2TR001435 (F.S.) के लिए; एनआईएच आर00 एचएल116645 व अहा 18TPA34170460 (सीके) ।

इस अध्ययन में वयस्क चूहा कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग कर प्रयोग माउंट सिनाई में इकाहान स्कूल ऑफ मेडिसिन के अनुमोदित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) प्रोटोकॉल के साथ किए गए थे । वयस्क चू?...

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	<li>Karakikes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+human+phospholamban+R14del+mutation+associated+with+cardiomyopathy+using+targeted+nucleases+and+combination+therapy.">Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy.</a> Nature Communications. 6, 6955 (2015).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+pluripotent+stem+cells+recapitulate+electrophysiological+characteristics+of+an+overlap+syndrome+of+cardiac+sodium+channel+disease.">Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease.</a> Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+ryanodine+receptor+2+dysfunction+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+generated+from+CPVTD307H+patients+are+arrhythmogenic+in+response+to+beta-adrenergic+stimulation.">Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery.">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).</li><li>Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+stem+cells+and+cardiovascular+drug+discovery.">Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery.</a> Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).</li><li>Youssef, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Promise+and+Challenge+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Applications.">The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).</li><li>Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cues+for+the+maturation+of+metabolic,+electrophysiological+and+calcium+handling+properties+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Gorski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Cardiomyocyte+Contractility+and+Calcium+Handling+In+Vitro.">Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation.">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Patterson, A. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+fetal+heart+development.">Hypoxia and fetal heart development.</a> Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+hypoxia+and+bioreactor+hydrodynamics+boosts+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+towards+cardiomyocytes.">Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Improving+the+Maturity+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).</li><li>Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).</li><li>Hwang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+calcium+handling+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+by+multiple+laboratories.">Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).</li><li>Scuderi, G. J., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+Engineered+Maturation+of+Cardiomyocytes.">Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).</li><li>Jung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+evolution+of+functional+vs.+remodeling+signaling+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+and+induced+maturation+with+biomechanical+stimulation.">Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).</li></ol>

प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में मानव आईपीएससी-सीएम का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) पैदा करना जो लगातार प्रदर्शन और प्रजनन योग्य परिणाम सुनिश्चित कर...

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेम्पेट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) एक आकर्षक मानव आधारित मंच हैजो विट्रो1,2,3,4,5,6,7,8में हृदय रोगों की एक बड़ी विविधता को मॉडल करता है । इसके अलावा, आईपीएससी-सीएम का उपयोग उपन्यास या मौजूदा दवाओं के लिए रोगी प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी के लिए, हिट यौगिकों को स्क्रीन करने और नई व्यक्तिगत दवाओंको विकसितकरने के लिए किया जा सकता है9,10। हालांकि, महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, आईपीएससी-सीएम11का उपयोग करते समय कई सीमाओं और चुनौतियों पर विचार करने की आवश्यकता है। नतीजतन, कार्डियक भेदभाव प्रोटोकॉल में सुधार करने, आईपीएससी-सीएम दक्षता और परिपक्वता को बढ़ाने के लिए, और विशिष्ट कार्डियोमायोसाइट उपप्रकार (वेंट्रिकुलर, एट्रायल और नोडल) उत्पन्न करने के तरीकों का तीव्रता से अध्ययन किया गया है और पहले से ही इन बाधाओं को दूर करने के लिए कई संस्कृति रणनीतियों का नेतृत्व किया गयाहै 12,13,14,15।
इन प्रोटोकॉलकी मजबूती के बावजूद, आईपीएससी-सीएम के उपयोग के लिए एक बड़ी चिंता उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त करने के लिए लंबी और जटिल प्रक्रियाओं की प्रजनन क्षमता है जो एक ही प्रदर्शन और प्रजनन योग्य परिणाम सुनिश्चित कर सकती है। विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ सेल लाइनों की तुलना करते समय न केवल प्रजनन क्षमता महत्वपूर्ण है, बल्कि एक ही कोशिका रेखा की सेलुलर और आणविक तुलना को दोहराते समय भी महत्वपूर्ण है। सेल परिवर्तनशीलता, जैसे कि आईपीएससी घनत्व में अच्छी तरह से अंतर, कार्डियक भेदभाव को प्रभावित कर सकता है, जिससे कम उपज और खराब गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स पैदा हो सकते हैं। इन कोशिकाओं का उपयोग अभी भी ऐसे प्रयोग करने के लिए किया जा सकता है जिनमें सीएम की शुद्ध आबादी की आवश्यकता नहीं होती है (उदाहरण के लिए, सीए2 + क्षणिक माप प्रदर्शन करते समय)। दरअसल, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण करते समय, गैर-सीएम न तो अनायास और न ही विद्युत उत्तेजना के तहत नहीं हराएंगे, इसलिए उन्हें विश्लेषण से बाहर करना आसान होगा। हालांकि, खराब गुणवत्ता के कारण, आईपीएससी-सीएम बदल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं (जैसे, अनियमित सीए2 + क्षणिक, कम सीए2 + आयाम) दिखा सकते हैं जो उनके आनुवंशिक मेकअप के कारण नहीं हैं। इसलिए, विशेष रूप से जब आईपीएससी-सीएम का उपयोग हृदय रोग मॉडल के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि रोग फेनोटाइप के साथ एक खराब गुणवत्ता वाले सीएम से परिणाम भ्रमित न करें। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों पर आगे बढ़ने से पहले सावधानीपूर्वक स्क्रीनिंग और बहिष्कार प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है।
इस विधि में उच्च शुद्धता और उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न करने और कैल्शियम और संकुचन अधिग्रहण और विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके सीए2 + क्षणिक माप प्रदर्शन करके उनके कार्य का आकलन करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल शामिल हैं। यह तकनीक उच्च दक्षता और कम दक्षता वाले आईपीएससी-सीएम की तैयारियों के बीच अंतर करने और मानव आईपीएससी-सीएम का अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक लक्षण वर्णन प्रदान करने का एक सरल, अभी तक शक्तिशाली तरीका है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27(-) insulin Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic inline heater</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>IL-H-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-qualified matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSC media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33493-01</td>
			<td>StemFlex Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>EC-B25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>ISW-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10906-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>124-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magensium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Glass Cover Slips</td>
			<td>Lab Scientific</td>
			<td>7807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BSS-355w</td>
			<td>Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (iPSC-सीएम) कैल्शियम के बुनियादी विज्ञान (Ca2 + +)हैंडलिंग और संकेत रास्तों के साथ ही उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता परख का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मानव स्रोत प्रदान करते हैं । इसके साथ, हम उच्च गुणवत्ता वाले आईपीएससी-सीएम उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धतियों का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं जो विभिन्न सेल लाइनों में आणविक और कार्यात्मक विशेषताओं को लगातार पुन: पेश कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, सीए2 + हैंडलिंग गुणों के मूल्यांकन के माध्यम से उनके कार्यात्मक लक्षण वर्णन का मज़बूती से आकलन करने के लिए एक विधि वर्णित है। कम ऑक्सीजन (ओ2)स्थितियां, लैक्टेट चयन, और संस्कृति में लंबे समय तक उच्च शुद्धता और उच्च गुणवत्ता वाले वेंट्रिकुलर जैसे कार्डियोमायोसाइट्स का उत्पादन करते हैं। अलग वयस्क चूहा कार्डियोमायोसाइट्स (एआरसीएमएस) के समान, 3 महीने पुराने आईपीएससी-सीएम उच्च सीए2 + आयाम, सीए2 + रीटेक (क्षय-ताऊ) की तेज दर और दिन 30 आईपीएससी-सीएम की तुलना में एड्रेनेर्जिक उत्तेजना के लिए एक सकारात्मक लुसिट्रोपिक प्रतिक्रिया प्रदर्शित करते हैं। रणनीति तकनीकी रूप से सरल, लागत प्रभावी और प्रजनन योग्य है। यह हृदय रोग मॉडल के लिए और बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग के लिए सीए2 + हैंडलिंग प्रोटीन को लक्षित करने के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करता है ।

चित्रा 1में वर्णित प्रोटोकॉलअत्यधिक शुद्ध कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न होता है जो संस्कृति में समय के साथ एक वेंट्रिकुलर/वयस्क की तरह फेनोटाइप प्राप्त करता है। जैसा कि एट्रियल और वे...

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Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

यहां हम लगातार मजबूत मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न करने और उनके कार्य की विशेषता के लिए एक विधि का वर्णन और मान्य करते हैं। इन तकनीकों के मार्ग संकेत में यंत्रवादी अंतर्दृष्टि विकसित करने में मदद कर सकते हैं, बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग के लिए एक मंच प्रदान करते हैं, और मज़बूती से मॉडल हृदय रोगों ।

वेंट्रिकुलर की पीढ़ी-जैसे HiPSC-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स और कैल्शियम हैंडलिंग लक्षण वर्णन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले सेल की तैयारी

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स को प्रेरित करते समय प्रजनन क्षमता प्रमुख चिंता का विषय है। इन तरीकों का उपयोग करके, उच्च शुद्धता और उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स को कार्यात्मक अध्ययनों में उनके उपयोग के लिए आईपीएस से उत्पन्न किया जा सकता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की शुद्ध, उच्च गुणवत्ता वाली तैयारी प्राप्त करने के लिए एक सरल, विश्वसनीय, लागत प्रभावी और बेहद शक्तिशाली तरीका है।सेल पासिंग के लिए, पीबीएस को पासएजिंग माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ बदलने से पहले सात से 10 मिनट के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को कुल्लाएं। एक सेल लिफ्टर का उपयोग करना, धीरे-धीरे कोशिकाओं को कुओं के नीचे से परिमार्जन करें, और अलग कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से अलग करने के लिए बाँझ दो मिलीलीटर ग्लास पिपेट का उपयोग करें। जब कोशिकाओं को छोटे समूहों में उठा लिया है के रूप में माइक्रोस्कोप के तहत दिखाई एक से छह अनुपात में कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए passaging माध्यम जोड़ें ।इसके बाद, छह अच्छी तरह से थाली से मानव भ्रूणस्टेम सेल योग्य मैट्रिक्स को एस्पिरेट करें। फिर प्रत्येक अच्छी तरह से पासेजिंग माध्यम का एक मिलीलीटर और अलग कोशिकाओं का एक मिलीलीटर जोड़ें, और कोशिकाओं को तब तक बढ़ने दें जब तक कि वे हृदय भेदभाव शुरू करने से पहले 70 से 80% तक न पहुंचजाएं। आईपीएससी-सीएम को अलग करने से कम से कम 30 मिनट पहले, 70% इथेनॉल के साथ व्यक्तिगत ग्लास कवर स्लिप को पोंछें, और कवर स्लिप को बाँझ छह अच्छी प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में रखें।जब कवर स्लिप सूख जाती है, तो प्रत्येक कवर स्लिप के केंद्र पर सीधे मानव भ्रूणस्टेम सेल योग्य मैट्रिक्स समाधान के 250 से 300 माइक्रोलीटर जोड़ें, और ऊतक संस्कृति हुड में छह अच्छी तरह से प्लेट रखें। मेटाबोलिक रूप से चयनित आईपीएससी-सीएम को अलग करने के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक कुएं में ईडीटीए के साथ बाँझ 0.25% ट्राइपसिन का एक मिलीलीटर जोड़ें, और एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त होने तक कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से अलग करने के लिए 1000 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करें। बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु नली में कोशिकाओं को खींचो, और प्रत्येक अच्छी तरह से आरएमआई 20 माध्यम प्रति अच्छी तरह से दो मिलीलीटर के साथ धोने ।फिर वॉश को ट्यूब में डालें और कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करके गोली मार दें। कोशिकाओं की एकाग्रता के प्रति 250 माइक्रोलीटर पांचवीं कोशिकाओं को तीन गुना 10 प्राप्त करने के लिए माध्यम की पर्याप्त मात्रा में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1000 मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग करें जब तक कि समाधान समरूप प्रतीत नहीं होता है।फिर कोशिकाओं के 250 माइक्रोलीटर को 1000 माइक्रोलीटर पिपेट टिप में एस्पिरेट करें, और धीरे-धीरे एक मानव भ्रूणीय स्टेम सेल योग्य मैट्रिक्स कोडेड कवर स्लिप पर समाधान की पूरी मात्रा को वितरित करें। जब सभी कोशिकाओं को वरीयता दी गई है, तो ध्यान से प्लेट को रात भर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें। धीरे से प्रत्येक अच्छी तरह से अगली सुबह के लिए D7 माध्यम के दो मिलीलीटर जोड़ने ।जब चयनित आईपीएससी-सीएम कम से तीन महीने पुराने तक पहुंचते हैं तो कोशिकाओं को ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए फ्यूरा-2 AM के दो माइक्रोलीटर के साथ इलाज करते हैं, और कैल्शियम विश्लेषण प्रणाली पर शक्ति । आर्कलैंप शुरू करें और पंप से ट्यूबों को उपयुक्त इनलेट और आउटलेट और उत्तेजक से कक्ष तक इलेक्ट्रॉनिक तार से कनेक्ट करें। कक्ष को सिस्टम पर रखें।प्रोफ्यूजन ट्यूब को भरें जो 37 डिग्री सेल्सियस गर्म टायरोड के समाधान के साथ तरल इनलाइन किए गए हीटर के माध्यम से चलती है, और पृष्ठभूमि क्षेत्र को कम करने के लिए कैमरे को समायोजित करें और एपर्चर आयाम तैयार करें। शीशे के कवर को कक्ष में आईपीएससी-सीएम के साथ वरीयता प्राप्त स्लिप जकड़ना, और धीरे से कवर स्लिप के शीर्ष पर सीधे टायरोड के समाधान के ५०० माइक्रोलीटर जोड़ें । एक १.५ मिलीलीटर प्रति मिनट की दर पर है Tyrode समाधान के साथ चैंबर प्रोफाइलिंग शुरू, और एक बिजली उत्तेजक का उपयोग करने के लिए 1 हर्ट्ज क्षेत्र उत्तेजना के साथ आईपीसी-सीएमएस गति 10 वोल्ट पर हर चार मिलीसेकंड तीन से पांच मिनट के लिए ।जब डाई के सभी कक्ष से बाहर धोया गया है कवर पर्ची के ऊपरी बाएं क्षेत्र के लिए देखने की खिड़की समायोजित करें, और रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं । पांच से 10 चोटियों की एक सुसंगत धारा इकट्ठा करने के बाद अस्थायी रूप से रिकॉर्डिंग को रोकने के लिए ठहराव पर क्लिक करें और रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले कवर स्लिप के विपरीत छोर के लिए माइक्रोस्कोप चरण को एक आसन्न क्षेत्र में ले जाएं। 10 मिनट की अवधि में एक ही तरीके से पूरे कवर पर्ची भर में कैल्शियम ट्रान्सेंस स्कैन करने के बाद निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त फ्लोरेसेंस ट्रेस विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण ।यह प्रोटोकॉल अत्यधिक शुद्ध कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न करता है जो समय के साथ संस्कृति में एक वेंट्रिकुलर, वयस्क की तरह फेनोटाइप प्राप्त करते हैं। जैसा कि एट्रियल और वेंट्रिकुलर एमएलसी 2 आइसोफॉर्म के लिए इम्यूनो फ्लोरोसेंट स्टेनिंग द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न अधिकांश कोशिकाएं कार्डियक भेदभाव के प्रेरण के बाद 30 दिन में एट्रियल एमएलसी2 आइसोफॉर्म सकारात्मक होती हैं। जबकि वेंट्रिकुलर एमएलसी2 आइसोफॉर्म एक ही समय बिंदु पर अधिक संख्या में व्यक्त किए जाते हैं।जैसे-जैसे संस्कृति में समय बढ़ता है, एमएलसी 2 आइसोफॉर्म पर एक पूर्ण स्विच मनाया जाता है। इन आंकड़ों की पुष्टि एट्रियल और वेंट्रिकुलर एमएलसी2 मार्कर व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत के प्रवाह साइटोमेट्रिक क्वांटिफिकेशन द्वारा भी की गई थी । 90 दिन में आईपीएससी-सीएम में कैल्शियम आयाम में काफी वृद्धि हुई है, जो वयस्क चूहे के सीएम के लिए मनाया जाता है।यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि गैर-हृदय कोशिकाओं को दूषित करने से भेदभाव के दौरान मानव आईपीएससी-सीएम की कार्यात्मक परिपक्वता प्रभावित हो सकती है। इसके अलावा, जब आईपीएससी-सीएमएस में रिकॉर्ड कैल्शियम यात्रियों को कम से कम 200 सेकंड के लिए निरंतर उत्तेजना के तहत कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर करने की अनुमति देना आवश्यक है, और रिकॉर्डिंग को प्रजनन योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए एक विशिष्ट समय खिड़की तक सीमित करना आवश्यक है। इस बात की पुष्टि करना याद रखें कि आईपीएससी एक सजातीय आकृति विज्ञान प्रदर्शित करता है और हृदय भेदभाव शुरू करने से पहले कोशिकाओं को 70 से 80% तक बढ़ने की अनुमति देता है।अपरिपक्व आईपीएस-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में शुद्ध गुणवत्ता बदल कार्यात्मक विशेषताओं को दिखा सकती है, जो वास्तविक फेनोटाइप को प्रतिबिंबित नहीं करती हैं, लेकिन रोगग्रस्त फेनोटाइप के रूप में गलत व्याख्या की जा सकती है। इसलिए, शुद्ध और उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त करना लगातार और प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Medicine

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